聯(lián)合應(yīng)用Wee1抑制劑和阿霉素對(duì)急性白血病細(xì)胞株HL—60作用的研究

張西凱+于廣晴+倪蕾

【摘要】 目的：通過(guò)聯(lián)合應(yīng)用PD0166285和阿霉素，觀察其對(duì)急性白血病細(xì)胞HL-60的作用，探討其可能的作用機(jī)制。方法：通過(guò)MTT法檢測(cè)藥物對(duì)HL-60的生長(zhǎng)抑制作用，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其凋亡作用，Western bolt檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和PARP的表達(dá)情況。結(jié)果：PD0166285聯(lián)合阿霉素對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制作用和促凋亡作用明顯增強(qiáng)，同時(shí)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和PARP的剪切增加。結(jié)論：PD0166285能夠增強(qiáng)阿霉素對(duì)HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制并促進(jìn)其凋亡，可能通過(guò)caspase依賴性凋亡途徑發(fā)揮作用。

【關(guān)鍵詞】 PD0166285； ADM； HL-60； 凋亡

【Abstract】 Objective：Through the combined use of PD0166285 and adriamycin，to observe its effect on acute leukemia cells HL-60，and to explore its possible mechanism.Method：MTT method was used to detect the inhibitory effect of drugs on the growth of HL-60，flow cytometry was used to detect the apoptosis，Western bolt was used to detect the expression of apoptosis related protein caspase-3 and PARP.Result：The inhibitory effect and apoptosis of PD0166285 combined with adriamycin on HL-60 cells was significantly enhanced，and the shear of apoptosis related protein caspase-3 and PARP increased.Conclusion：PD0166285 can enhance the growth inhibition and apoptosis of HL-60 cells，which may play a role in caspase dependent apoptosis pathway.

【Key words】 PD0166285； ADM； HL-60； Apoptosis

First-authors address：The First Hospital Affiliated to Jiamusi University，Jiamusi 154003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.36.005

急性白血?。ˋL）是一種造血干祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病[1]，其治療包括聯(lián)合化療、促分化、促凋亡治療和造血干細(xì)胞移植，其中聯(lián)合化療是主要方法[2]。阿霉素（ADM）作為一種蒽環(huán)類抗腫瘤藥物[3]，在白血病的治療中應(yīng)用已久，但由于其心臟毒性、骨髓抑制等不良反應(yīng)較多且易產(chǎn)生多藥耐藥，限制了其作為抗腫瘤藥物的進(jìn)一步應(yīng)用[4]。目前許多研究表明，一些參與細(xì)胞周期調(diào)控的分子已成為治療腫瘤的重要靶點(diǎn)[5-6]。Wee1蛋白激酶作為一種細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶，是調(diào)控細(xì)胞從G2期到M期的關(guān)鍵靶點(diǎn)[7-8]。新近研究發(fā)現(xiàn)抑制Wee1可以導(dǎo)致細(xì)胞周期相關(guān)激酶活性的上調(diào)，促使受損傷細(xì)胞跨過(guò)G2/M期檢查點(diǎn)，損傷的DNA無(wú)法完成修復(fù)便直接進(jìn)入有絲分裂期，導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難和細(xì)胞凋亡甚至死亡等事件的發(fā)生，表現(xiàn)出抗腫瘤的生物活性[9-10]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，PD0166285作為一種Wee1蛋白激酶抑制劑可協(xié)同化療或放療更好起到抗腫瘤作用[11]。筆者希望通過(guò)體外聯(lián)合使用PD0166285與ADM，觀察其對(duì)急性白血病細(xì)胞HL-60的作用，進(jìn)而探討PD0166285聯(lián)合ADM抗HL-60細(xì)胞的可能機(jī)制，為臨床聯(lián)合使用PD0166285與ADM提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 急性白血病細(xì)胞HL-60（上海子實(shí)生物公司），PD0166285（美國(guó)Selleck公司），阿霉素（美國(guó)Sigma公司），MTT（上海碧云天生物公司），兔抗人PARP、兔抗人caspase-3、兔抗人β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記抗兔二抗（北京中杉公司）；其余試劑均為分析純。流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dikison公司），Annexin-V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒（北京嘉美紐諾生物公司）。

1.2 MTT法測(cè)定PD0166285及ADM單用/聯(lián)用對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞，按照2.0×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度鋪于96孔板中，每孔100 ?L細(xì)胞懸液，加入不同濃度的PD0166285和/或ADM。每個(gè)濃度設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，同時(shí)用RPMI1640替代藥物作為對(duì)照孔。將鋪好的96孔板于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h后向每孔加入10 ?L的MTT溶液，繼續(xù)孵育1 h后離心棄上清液，加入50 ?L DMSO，振蕩溶解結(jié)晶后置酶標(biāo)儀上490 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度值（OD值），計(jì)算抑制率，抑制率（%）=（1-藥物組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.3 Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒法檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡 收集藥物處理后的細(xì)胞，PBS洗二次，4 ℃離心去上清液。加入50 ?L的結(jié)合緩沖液，再加入5 ?L Annexin V-FITC，混勻后室溫避光孵育15 min。再加入10 ?L PI，孵育5 min后迅速上機(jī)完成凋亡檢測(cè)。細(xì)胞凋亡率為Annexin V-FITC+/PI-及Annexin V-FITC+/PI+的百分比之和。endprint

1.4 Western bolt檢測(cè)caspase-3和PARP的表達(dá) 收集不同濃度藥物作用后的細(xì)胞，細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，按50 μg體系加樣，垂直電泳，100 V電泳轉(zhuǎn)膜2 h，封閉1 h，加入一抗孵育24 h，二抗孵育1 h，加入ECL發(fā)光液，Tanon 5200采集圖像，對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度掃描。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測(cè)定PD0166285及ADM單用/聯(lián)用對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制作用 將HL-60細(xì)胞培養(yǎng)在不同濃度PD0166285和/或ADM中，MTT法測(cè)定抑制率。單獨(dú)用藥結(jié)果顯示，PD0166285、ADM對(duì)HL-60細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，并呈明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系。PD0166285作用于HL-60細(xì)胞48 h的IC50為1 μm；ADM作用于HL-60細(xì)胞48 h的IC50為0.65 μm。聯(lián)合用藥結(jié)果顯示，PD0166285聯(lián)合ADM增強(qiáng)了對(duì)HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，單用0.1、0.5、1.0 ?m的ADM作用于HL-60細(xì)胞48 h的抑制率分別為（31.23±0.75）%、（49.73±0.61）%、（62.66±0.07）%，而聯(lián)用0.50 ?m PD0166285后，抑制率增加為（48.56±0.05）%、（64.45±0.13）%、（79.73±0.18）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 PD0166285和/或ADM對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的影響 HL-60細(xì)胞處理后凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，單獨(dú)用ADM（0.1 ?m，48 h）作用于HL-60細(xì)胞凋亡率為（25.27±0.34）%，單獨(dú)用PD0166285（1 ?m，48 h）處理凋亡率為（23.15±1.03）%，當(dāng)PD0166285（1 ?m）聯(lián)合ADM（0.1 ?m）作用時(shí)凋亡率則達(dá)到（56.21±1.64）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

2.3 PD0166285聯(lián)合ADM對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡蛋白的影響 將HL-60細(xì)胞與不同濃度的ADM及PD0166285聯(lián)合作用48 h，提取蛋白，進(jìn)行Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)，第1～6條泳道分別代表空白對(duì)照組、ADM 0.1 ?m組、ADM 0.5 ?m組、PD0166285 0.5 ?m組、PD0166285+ADM 0.1 ?m組、PD0166285+ADM 0.5 ?m組，ADM作用于HL-60細(xì)胞48 h后，在藥物濃度0.5 ?m時(shí)caspase-3和PARP發(fā)生剪切，細(xì)胞發(fā)生凋亡，經(jīng)PD0166285（0.5 ?m）和ADM聯(lián)合作用后，在ADM藥物濃度為0.1 ?m時(shí)caspase-3和PARP即發(fā)生剪切。見(jiàn)圖2。

3 討論

Wee1蛋白激酶是一種細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶，在調(diào)控細(xì)胞從G2期到M期的過(guò)渡中發(fā)揮重要作用。當(dāng)細(xì)胞DNA因各種原因受到損傷時(shí)，活化的Wee1磷酸化Cdc2的Tyr15位點(diǎn)而使其失活，阻止CDK1-cyclinB復(fù)合物結(jié)合活化，阻止細(xì)胞進(jìn)入M期，從而延遲有絲分裂[12]，促進(jìn)DNA損傷的修復(fù)以及保證細(xì)胞DNA復(fù)制的完成，以避免異常的DNA進(jìn)入有絲分裂期導(dǎo)致有絲分裂災(zāi)難甚至發(fā)生調(diào)亡[13]。目前在許多惡性腫瘤中都檢測(cè)到了Wee1的過(guò)表達(dá)，特別是在p53突變或缺失型的腫瘤中更明顯[14-15]，國(guó)內(nèi)學(xué)者經(jīng)實(shí)驗(yàn)初步證明Wee1在急性白血病細(xì)胞株中存在高表達(dá)[16]。此外，Wang等[17]發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中Wee1的過(guò)表達(dá)能夠?qū)笵NA損傷后引起的凋亡，使受損傷細(xì)胞得到修復(fù)并對(duì)放化療不敏感[8]。

根據(jù)Wee1在細(xì)胞周期中的作用及其在一些腫瘤中過(guò)表達(dá)，提示可以通過(guò)抑制Wee1來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[18]?？蒲腥藛T在過(guò)去的十多年中研發(fā)出來(lái)了多種Wee1小分子抑制劑，如PD0166285、PD0407824及MK-1775等[19]，在不同的實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了抗腫瘤作用[20]。本實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)Wee1蛋白激酶抑制劑PD0166285聯(lián)合ADM應(yīng)用時(shí)，能夠明顯增強(qiáng)ADM對(duì)急性白血病細(xì)胞HL-60的增殖抑制和促凋亡作用，筆者考慮當(dāng)Wee1蛋白激酶受到抑制時(shí)，ADM造成的細(xì)胞DNA損傷無(wú)法得到修復(fù)，大量受損傷細(xì)胞未完成修復(fù)便進(jìn)入M期，DNA損傷增加，進(jìn)而出現(xiàn)有絲分裂災(zāi)難，導(dǎo)致caspase-3的激活和PARP的裂解增加，通過(guò)caspase依賴性凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但是，由于caspase依賴性凋亡途徑又可分為由死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑和由線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑[21]，并且是否涉及非caspase依賴途徑的參與尚不清楚，PD0166285增強(qiáng)ADM誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。由于Wee1激酶抑制劑充分發(fā)揮抗白血病細(xì)胞作用需要建立在細(xì)胞DNA受損傷的基礎(chǔ)上，因此Wee1激酶抑制劑與化療、放療等損傷細(xì)胞的治療方法聯(lián)合使用可能是比較理想的方案。

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（收稿日期：2016-10-14） （本文編輯：張爽）endprint