Roscovitine通過(guò)影響核因子κB活化抑制大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷導(dǎo)致的炎性增生*

趙京山， 孫佳歡， 于 琨, 2， 劉 玉, 2， 王 超， 李愛(ài)英

(1河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與生物學(xué)教研室， 2河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050200； 3河北省人民醫(yī)院, 河北 石家莊 050051)

Roscovitine通過(guò)影響核因子κB活化抑制大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷導(dǎo)致的炎性增生*

趙京山1, 2△， 孫佳歡1， 于 琨1, 2， 劉 玉1, 2， 王 超3， 李愛(ài)英1, 2△

(1河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與生物學(xué)教研室，2河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050200；3河北省人民醫(yī)院, 河北 石家莊 050051)

目的： 探討roscovitine通過(guò)影響核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)活化抑制大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷導(dǎo)致炎性增生的作用及其分子機(jī)制。 方法：隨機(jī)將SD大鼠分成對(duì)照組、模型組和治療組3組，每組20只。模型組采用胰蛋白酶消化法制作頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷模型；對(duì)照組采用假手術(shù)，用生理鹽水代替胰蛋白酶消化步驟，其他同模型組操作；治療組在分離的頸動(dòng)脈血管外壁均勻涂抹終濃度為2 g/L roscovitine 緩釋凝膠0.5 mL，其他同模型組。各組大鼠術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)4周后取材備檢。采用HE染色觀察各組形態(tài)學(xué)變化，采用Western blot法檢測(cè)IκB的表達(dá)變化和磷酸化降解，檢測(cè)NF-κB的表達(dá)變化、磷酸化激活以及其下游環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)、血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6) 的表達(dá)變化。 結(jié)果：Roscovitine通過(guò)抑制胰蛋白酶損傷誘導(dǎo)的IκB-α磷酸化降解，阻斷NF-κB-p65的磷酸化活化，進(jìn)而下調(diào)COX-2表達(dá)，抑制VCAM-1、TNF-α和IL-6的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制損傷血管內(nèi)膜增生的作用。 結(jié)論：Roscovitine通過(guò)影響NF-κB活化抑制大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷導(dǎo)致的炎性增生。

Roscovitine； 核因子κB； 頸動(dòng)脈內(nèi)膜； 炎性增生

隨著社會(huì)的老齡化，動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病。雖然動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明，但經(jīng)多年的發(fā)展，血管搭橋術(shù)、動(dòng)脈球囊擴(kuò)張術(shù)及支架置入術(shù)等多種形式的血管重建術(shù)已經(jīng)成為治療這類疾病常用而有效的方法[1]；然而，術(shù)后較高的再狹窄率使其遠(yuǎn)期療效不容樂(lè)觀。雖然人們嘗試采用藥物支架、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、血管內(nèi)照射以及多種治療藥物(包括抗凝藥、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、他汀類藥、細(xì)胞毒類藥)等方法來(lái)預(yù)防再狹窄，但是，到目前為止，人們尚未找到一種安全有效、用藥簡(jiǎn)便、能作用于多種病理環(huán)節(jié)防治再狹窄的藥物以及能夠完全有效地的解決這一難題的方法[2-3]。研究表明，再狹窄的最主要的病理變化是新生內(nèi)膜增生，因此可從抑制構(gòu)成血管壁細(xì)胞增殖的視角來(lái)研究防治再狹窄形成。

國(guó)內(nèi)外研究表明，血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的的異常增生是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄等血管增殖性疾病發(fā)生的核心事件，研究血管壁細(xì)胞增殖的機(jī)制，尋找抗細(xì)胞增殖的藥物已成為防治血管增殖性疾病領(lǐng)域的主要研究課題。血管壁細(xì)胞尤其是平滑肌細(xì)胞異常增生是血管增殖性疾病特征性病理變化，機(jī)械損傷和生長(zhǎng)因子的刺激使得平滑肌細(xì)胞表現(xiàn)出與腫瘤細(xì)胞類似的生物學(xué)行為，在疾病發(fā)生的分子機(jī)制上，調(diào)控血管平滑肌增殖的信號(hào)傳導(dǎo)通路與許多調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的信號(hào)通路相一致[3]。因此，應(yīng)用抗腫瘤藥物治療血管增殖性疾病可能是一種新的治療策略。但使用抗增殖藥防治血管增生性疾病還處于實(shí)驗(yàn)階段，探索抗增殖藥防治血管增生性疾病的機(jī)制將有助于抗增殖藥防治血管增生性疾病在臨床上的應(yīng)用與推廣。

大量研究表明，roscovitine 具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，roscovitine可抑制多種類型細(xì)胞的增殖，包括多種腫瘤細(xì)胞、角化細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等[4]。NF-κB作為一種多向性轉(zhuǎn)錄因子其結(jié)合序列存在于多種促炎和促增殖基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中，通過(guò)激活靶基因表達(dá)，廣泛參與機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖分化與凋亡[5-8]。Roscovitine是一種小分子抑制腫瘤細(xì)胞增殖藥物，具有低毒高效的特點(diǎn)[7]。Roscovitine是否能通過(guò)影響核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)途徑而抑制血管壁細(xì)胞增生是一個(gè)值得研究的問(wèn)題。本課題采用胰酶消化法建立SD大鼠頸動(dòng)脈血管損傷模型，觀察roscovitine 對(duì)血管新生內(nèi)膜增生的影響，并探討其作用機(jī)制，從而為臨床應(yīng)用roscovitine治療血管增殖性疾病提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為體重300～330 g的成年雄性SD大鼠，由河北省醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心提供；實(shí)驗(yàn)所用單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；多克隆抗體購(gòu)自北京中杉公司；roscovitine購(gòu)自Gibco；胰蛋白酶購(gòu)自Sigma；其余試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀和高速冷凍離心機(jī)(Thermo)；電泳儀(Bio-Rad)；顯微鏡(HITACHI)； ID數(shù)碼成像分析系統(tǒng)(Kodak)。

3 主要方法

3.1 模型制作 大鼠稱重，用10%水合氯醛(3 mL/kg)進(jìn)行麻醉。麻醉成功后備皮，取5%碘伏給大鼠頸動(dòng)脈區(qū)皮膚消毒1次，再用75%乙醇消毒2次，鋪無(wú)菌巾。然后操作者在無(wú)菌條件下進(jìn)行頸動(dòng)脈剝離，暴露出2 cm。用動(dòng)脈夾夾住剝離血管兩端，再將一段手術(shù)結(jié)扎線置于剝離血管下以備用。取0.33 mm注射器平行于血管縱軸方向穿刺進(jìn)入血管, 0.9%生理鹽水沖洗置換出管腔內(nèi)的血液后抽出生理鹽水，保留針頭，再抽取0.25%胰酶溶液進(jìn)行注射，直至血管充盈，將已準(zhǔn)備好的手術(shù)結(jié)扎線在針眼上方進(jìn)行結(jié)扎，防止胰酶漏出，拔出注射器，再用醫(yī)用生物膠粘合針孔。計(jì)時(shí)10 min后將結(jié)扎線解開(kāi)取出，并松開(kāi)動(dòng)脈夾，進(jìn)行切口縫合，縫合后注射0.2%青霉素2 mL。

3.2 Roscovitine緩釋凝膠的制備 利用Pluronic F127制備roscovitine血管外涂藥物緩釋凝膠，稱固體PF127粉30 g，溶于PBS中，40 ℃攪拌至澄清，定容至100 mL。將roscovitine 50 mg先溶解于1 mL DMSO, 然后再溶解于24 mL Pluronie F-127凝膠中，40 ℃攪拌過(guò)夜，制成終濃度為2 g/L 的roscovitine緩釋凝膠備用。

3.3 實(shí)驗(yàn)分組和取材 隨機(jī)將SD大鼠分成對(duì)照組、模型組和治療組3組，每組20只。對(duì)照組采用假手術(shù)，用生理鹽水代替胰蛋白酶消化步驟，其他同模型組操作；模型組按照3.1方法制作；治療組在進(jìn)行切口縫合前，在分離的頸動(dòng)脈血管外壁均勻涂抹終濃度為2 g/L的roscovitine 緩釋凝膠0.5 mL，其他同模型組。各組大鼠術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)4周后取材(術(shù)后前3 d注射0.2%青霉素2 mL/d)，取出各組的頸動(dòng)脈段，放在裝有生理鹽水的培養(yǎng)皿中進(jìn)行沖洗，沖洗干凈后，取約1 cm 用于病理形態(tài)學(xué)觀察，其余部分制備蛋白提取液。

3.4 病理形態(tài)學(xué)的觀察 取頸動(dòng)脈1 cm左右置冷PBS中洗凈殘留血液，放入4%多聚甲醛/PBS中固定至少24 h，乙醇梯度脫水，低溫石蠟垂直定向包埋、切片，常規(guī)HE染色。于光鏡下觀察、照相、進(jìn)行圖像學(xué)分析，計(jì)算內(nèi)膜厚度、中膜厚度和內(nèi)膜/中膜厚度之比(I/M)。

3.5 蛋白提取液的制備 取損傷部位血管，用生理鹽水洗凈后，按100 mg組織加入1 mL提取液(150 mmol/L NaC1，50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8，0.1% NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS)勻漿。冰浴反應(yīng)30 min；4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清用改良酚試劑法測(cè)定提取液的蛋白含量。

3.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 按照3.5的方法提取血管壁細(xì)胞總蛋白，用改良的Lowry法測(cè)定蛋白濃度。各組取等量蛋白提取液與5×SDS上樣緩沖液混勻后，100 ℃沸水浴中加熱5 min， 自然冷卻后在120 V恒壓條件下，進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，隨后與相應(yīng)的Ⅰ抗及Ⅱ抗反應(yīng)，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗原抗體結(jié)合區(qū)帶。用數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行密度掃描，以GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行定量分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間資料應(yīng)用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法，各項(xiàng)統(tǒng)計(jì)均用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 病理形態(tài)學(xué)的改變

對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈壁各層結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)膜光滑，中膜血管平滑肌細(xì)胞排列整齊。模型組內(nèi)膜呈彌漫性增厚，管腔變小，增厚的內(nèi)膜中以細(xì)胞成分為主，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，中膜細(xì)胞排列完整。給予roscovitine 治療后，血管內(nèi)膜增生明顯被抑制，炎癥細(xì)胞減少。形態(tài)測(cè)量分析表明，模型組與對(duì)照組相比，模型組的血管內(nèi)膜增生明顯，血管內(nèi)膜厚度顯著升高，內(nèi)膜/中膜面積(I/M)比值升高了0.81倍，roscovitine 治療組的上述指標(biāo)均有不同程度的降低，與模型組比較I/M比值降低了0.35倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Inhibitory effect of roscovitine on intimal hyperplasia in rat carotid artery after trypsin digestion iniury. A: HE staining of the rat carotid artery; B: the ratio of intimal to medial (I/M) area. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel.

圖1 Roscovitine 抑制胰蛋白酶消化損傷造成的大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生

2 NF-κB下游環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)、血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)的表達(dá)變化

為了觀察roscovitine抑制胰蛋白酶損傷后的早期血管炎癥反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了炎性標(biāo)志物COX-2、VCAM-1、TNF-α和IL-6在血管壁中的表達(dá)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組中可檢測(cè)到少量的COX-2、VCAM-1、TNF-α和IL-6 蛋白；模型組的COX-2、VCAM-1、TNF-α和IL-6蛋白水平明顯升高，約是對(duì)照組的2.25、2.13、2.04和2.19倍，說(shuō)明炎性增生模型復(fù)制成功；roscovitine可明顯抑制 COX-2、VCAM-1、TNF-α和IL-6的表達(dá)，COX-2、VCAM-1、TNF-α和IL-6的蛋白水平顯著降低，較模型組分別減少了34.8 %、28.9%、41.1%和38.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The effect of roscovitine on the expression of COX-2, VCAM-1, TNF-α and IL-6 in rat carotid artery after trypsin digestion injury. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel.

圖2 Roscovitine 對(duì)胰蛋白酶消化損傷后大鼠頸動(dòng)脈COX-2、VCAM-1、TNF-α和IL-6表達(dá)的影響

3 NF-κB表達(dá)水平及磷酸化活化的變化

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、模型組及治療組的NF-κB總量無(wú)差別，而磷酸化的NF-κB (p-NF-κB-p65)有明顯差別，對(duì)照組中可檢測(cè)到少量的p-NF-κB 蛋白；模型組的p-NF-κB水平明顯升高，較對(duì)照組升高了57.1%。Roscovitine可明顯抑制 p-NF-κB的蛋白水平，p-NF-κB的蛋白水平顯著降低，較模型組減少了29.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The effect of roscovitine on the expression of NF-κB in rat carotid artery after trypsin digestion injury. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel.

圖3 Roscovitine 對(duì)胰蛋白酶消化損傷后大鼠頸動(dòng)脈NF-κB表達(dá)的影響

4 IκB表達(dá)水平的變化及磷酸化降解

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、模型組及治療組IκB的總量無(wú)差別，而磷酸化IκB的水平有明顯差別，對(duì)照組中可檢測(cè)到少量的p-IκB 蛋白；模型組的p-IκB水平明顯升高，較對(duì)照組升高了43.9%；治療組roscovitine可明顯抑制 p-IκB，p-IκB的蛋白水平幾乎恢復(fù)到了對(duì)照組的水平，較模型組下降約23.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。

討 論

動(dòng)脈粥樣硬化和血管再狹窄是一種慢性血管炎癥性疾病，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)作為治療冠心病的有效手段現(xiàn)已得到廣泛的應(yīng)用，但介入性治療后3～6個(gè)月約35%～50%的患者出現(xiàn)血管再狹窄，嚴(yán)重限制了PTCA 的遠(yuǎn)期療效。目前認(rèn)為造成PTCA術(shù)后再狹窄的主要病理基礎(chǔ)是，血管內(nèi)膜受到刺激后，炎細(xì)胞浸潤(rùn)、內(nèi)皮細(xì)胞增生導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞表型改變，從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋承?，血管平滑肌?xì)胞遷移活性發(fā)生改變，從血管中膜遷移至內(nèi)膜，進(jìn)而分裂增殖，血管壁內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞增生及其產(chǎn)生的基質(zhì)等形成新生內(nèi)膜，導(dǎo)致管壁增厚，管腔變窄[5,10]。因此，如何抑制細(xì)胞的異常增殖，防止再狹窄的發(fā)生，就成為心血管疾病研究的一個(gè)重要問(wèn)題。

核因子NF-κB作為一種多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其結(jié)合序列存在于多種促炎基因和促增殖基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中，通過(guò)激活靶基因表達(dá)廣泛參與機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖分化與凋亡等生物行為[5,9-12]。NF-κB蛋白是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，所有成員都含有Rel同源區(qū)域，介導(dǎo)二聚體形成，其蛋白質(zhì)以同源/異源二聚體形式形成復(fù)合體，P65/P50是最常見(jiàn)的二聚體形式。靜息狀態(tài)NF-κB二聚體與抑制蛋白IκB相結(jié)合以非活性形式存在于胞漿中。NF-κB途徑可以被一系列的細(xì)胞外刺激所激活，通過(guò)各自的細(xì)胞膜受體將炎癥信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，激活I(lǐng)κB激酶(IKK)復(fù)合體，活化的IKK進(jìn)而催化IκB磷酸化，后者隨即被泛素化，而后降解，使NF-κB-p65得以游離釋放，并發(fā)生磷酸化，而后轉(zhuǎn)位入核，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域基序GGGRNNYYCC結(jié)合，激活靶基因轉(zhuǎn)錄。NF-κB 是血管炎癥發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)基因調(diào)控序列同源性比對(duì)，分析后發(fā)現(xiàn)，致炎因子誘導(dǎo)的異?；虮磉_(dá)大多受NF-κB的反式激活[13-17]，因此，通過(guò)抑制NF-κB 活化進(jìn)行的抗炎治療已成為防治增殖性心血管疾病的新策略。

Figure 4.The effect of roscovitine on the expression of IκB after trypsin digestion injury in the rat carotid artery. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel.

圖4 Roscovitine 對(duì)大鼠頸動(dòng)脈胰蛋白酶消化損傷后IκB表達(dá)的影響

Roscovitine是一種小分子抑制細(xì)胞增殖藥物，roscovitine作為新型的抗腫瘤藥物具有低毒高效的特點(diǎn)[7]，有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，尤其是抗炎性增殖作用明顯，該作用通過(guò)抑制NF-κB的活化抑制腫瘤細(xì)胞增殖和降低Mcl-1表達(dá)誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞凋亡。研究表明，roscovitine是一種低毒高效的抑制細(xì)胞增殖的抗腫瘤藥物，它可顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，而對(duì)正常細(xì)胞幾乎無(wú)影響，這是目前開(kāi)發(fā)此類藥物的意義所在[8]。我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，roscovitine對(duì)正常血管壁細(xì)胞(內(nèi)壁細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等)無(wú)影響，而對(duì)損傷的血管壁細(xì)胞具有抑制作用。正常血管，平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，roscovitine對(duì)其無(wú)影響，而當(dāng)血管受損時(shí)，構(gòu)成血管壁的細(xì)胞增殖活躍，這時(shí)它既可抑制平滑肌細(xì)胞，也可抑制其他細(xì)胞的增殖。而以動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓為代表的心血管疾病，血管壁細(xì)胞的炎性增殖是其病理基礎(chǔ)，roscovitine能否通過(guò)影響NF-κB信號(hào)途徑而抑制血管內(nèi)膜炎性增生是本研究的興趣點(diǎn)。

本課題采用胰蛋白酶消化法造成頸動(dòng)脈損傷模型，應(yīng)用新型藥物緩釋技術(shù)進(jìn)行干預(yù)治療，觀察roscovitine抑制血管壁損傷導(dǎo)致的內(nèi)膜增生，探討其抑制血管壁增生的分子機(jī)制。胰蛋白酶消化法大鼠頸動(dòng)脈炎性增生模型造模成功的標(biāo)準(zhǔn)是：內(nèi)膜粗糙，呈彌漫性增厚，管腔變小，增厚的內(nèi)膜中主要有細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞成分構(gòu)成，有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂，I/M比值較正常對(duì)照組升高0.5倍以上，同時(shí)損傷局部血管炎性因子表達(dá)增加。本研究圖1實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示形態(tài)學(xué)變化符合上述標(biāo)準(zhǔn)，且模型組I/M比值較正常對(duì)照組升高了0.81倍；圖2結(jié)果顯示，模型組的炎性因子COX-2、VCAM-1、TNF-α和IL-6較正常對(duì)照組表達(dá)水平明顯升高，約是對(duì)照組的2.25、2.13、2.04和2.19倍，上述數(shù)據(jù)表明大鼠血管壁炎性增生模型造模成功，可用于實(shí)驗(yàn)研究。

本實(shí)驗(yàn)采用新型藥物緩釋技術(shù)——“緩釋凝膠”給藥，該方法已在臨床中應(yīng)用，例如治療血管狹窄性疾病時(shí)所應(yīng)用的藥物涂層支架，其藥物涂層常采用“緩釋凝膠”給藥的方法。臨床上在動(dòng)脈中置入支架治療血管狹窄性疾病，約有30%～50%的病人會(huì)因局部血管增生出現(xiàn)再狹窄，目前預(yù)防再狹窄的有效措施之一便是采用藥物涂層支架，采用該給藥方式是為下一步開(kāi)發(fā)roscovitine藥物涂層支架做準(zhǔn)備。

HE染色形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，模型組與對(duì)照組相比，模型組的血管內(nèi)膜增生明顯，血管內(nèi)膜厚度顯著升高，I/M比值升高0.81倍，roscovitine 治療組的上述指標(biāo)均有不同程度的降低，I/M比值較模型組降低了0.35倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。以上統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明roscovitine能夠明顯抑制胰蛋白酶消化造成的大鼠血管內(nèi)皮剝脫誘導(dǎo)的新生內(nèi)膜增生。

為了觀察roscovitine抑制胰蛋白酶損傷后的血管炎癥增殖反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了炎性標(biāo)志物COX-2、VCAM-1、TNF-α和IL-6在血管壁中的表達(dá)。Western blot實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，對(duì)照組中可檢測(cè)到少量的COX-2、VCAM-1、TNF-α和IL-6蛋白；模型組的COX-2、VCAM-1、TNF-α和IL-6水平明顯升高，約是對(duì)照組的2.25、2.13、2.04和2.19倍。治療組Roscovitine可明顯抑制 COX-2、VCAM-1、TNF-α和IL-6的表達(dá)，使COX-2、VCAM-1、 TNF-α和IL-6的蛋白水平顯著降低，較模型組分別減少了34.8 %、28.9%、41.1%和38.7%。該結(jié)果表明，roscovitine可抑制受損血管致炎基因的表達(dá)，通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)抑制血管增生。

以往研究表明，NF-κB 是血管炎癥發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，因此，課題組觀察了胰蛋白酶損傷后roscovitine對(duì)NF-κB活化的影響，進(jìn)一步探討其抑制血管內(nèi)膜增生的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明roscovitine不影響NF-κB的表達(dá)，可明顯抑制 NF-κB-p65的磷酸化，治療組較模型組減少了29.6%。Roscovitine可明顯抑制 IκB 的磷酸化水平，治療組p-IκB 幾乎恢復(fù)到了對(duì)照組的水平，較模型組下降約23.1%，而roscovitine不影響IκB 蛋白的表達(dá)水平。上述結(jié)果說(shuō)明roscovitine對(duì)NF-κB活化的抑制作用與其減少 IκB 磷酸化降解有關(guān)，而關(guān)于 IκB 磷酸化的機(jī)制有待于下一步深入研究。

綜上所述，采用藥物緩釋技術(shù)，在血管外給藥，一次性涂抹roscovitine緩釋凝膠具有明顯的抑制血管內(nèi)膜增生作用。Roscovitine通過(guò)抑制胰蛋白酶損傷誘導(dǎo)的IκB磷酸化降解，阻斷NF-κB-p65的磷酸化，下調(diào)炎性因子COX-2、VCAM-1、TNF-α和IL-6的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制損傷血管的炎性增生作用，本研究為治療血管增生性疾病提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Roscovitine inhibits inflammatory hyperplasia of carotid artery intima in rats via suppressing nuclear factor-κB activation

ZHAO Jing-shan1, 2, SUN Jia-huan1, YU Kun1, 2, LIU Yu1, 2, WANG Chao3, LI Ai-ying1, 2

(1TheDepartmentofBiochemistryandBiology,BasicMedicalCollege,HebeiUniversityofChineseMedicine,2HebeiKeyLaboratoryofChineseMedicineResearchonCardiocerebrovascularDisease,Shijiazhuang050200,China;3HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China.E-mail:lay1963@126.com;zjs10@sina.com)

AIM: To study the effect of roscovitine on the inflammatory hyperplasia of carotid artery intima in rats and the related mechanisms. METHODS: SD rats (n=60) were randomly divided into 3 groups including control group, model group and treatment group. The rat model was established by trypsin digestion injury. The rats in control group were given sham operation. The rats in treatment group were administered with 0.5 mL roscovitine (2 g/L) slow-releasing gelatin. The rats in each group were fed normally for 4 weeks, then killed to take out carotid arteries for further observations. The effects of roscovitine on the inflammatory hyperplasia of carotid artery intima and the related mechanism via nuclear factor-κB (NF-κB) in the rats were detected by Western blot. RESUITS: Roscovitine inhibited the activation of NF-κB and the expression of inflammatory factors cyclooxygenase-2 (COX-2), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1),TNF-α and IL-6 via blocking the phosphorylation activation of NF-κB and inhibiting the degradation of IκB-α. CONCLUSION: Roscovitine inhibits inflammatory hyperplasia of carotid artery intima in the rats via suppressing NF-κB activation.

Roscovitine; Nuclear factor-κB; Carotid artery intima; Inflammatory hyperplasia

1000- 4718(2017)02- 0233- 06

2016- 07- 04

2016- 11- 01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 31271466； No. 81573698)；河北省科技支撐計(jì)劃(No.13277739D)；河北省教育廳科技類重點(diǎn)項(xiàng)目(No. ZD2014005)；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2009001053)

R543.5; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.007

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 李愛(ài)英 Tel: 0311-89926235； E-mail: lay1963@126.com； 趙京山 Tel: 0311-89926236； E-mail: zjs10@sina.com