HCMV感染對(duì)人THP-1細(xì)胞HLA-G及其受體表達(dá)的影響*

賴媚媚， 周秋菊， 樓韻燕， 郭彬瀚， 王慧燕， 鄭曉群△

(1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、附屬育英兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 溫州325027； 2溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院， 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州325035)

HCMV感染對(duì)人THP-1細(xì)胞HLA-G及其受體表達(dá)的影響*

賴媚媚1, 2， 周秋菊1, 2， 樓韻燕1, 2， 郭彬瀚1, 2， 王慧燕1, 2， 鄭曉群1, 2△

(1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、附屬育英兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 溫州325027；2溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院， 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州325035)

目的： 研究人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染對(duì)人THP-1細(xì)胞人類白細(xì)胞抗原G(HLA-G)異構(gòu)體及其受體表達(dá)的影響，探討HLA-G在HCMV逃逸宿主免疫應(yīng)答中的作用。方法: HCMV Towne株感染THP-1細(xì)胞后，采用RT-PCR和Western blot 檢測(cè)HLA-G異構(gòu)體mRNA和蛋白水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)THP-1細(xì)胞HLA-G及其表面受體ILT2、ILT4的表達(dá)，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10及可溶性HLA-G(sHLA-G)水平，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果: HCMV感染后細(xì)胞未出現(xiàn)明顯凋亡，細(xì)胞存活率高。 HCMV感染THP-1細(xì)胞1 d后HLA-G1、-G3、-G4和-G5的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，HLA-G1和HLA-G5的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。THP-1 細(xì)胞HLA-G、ILT2和ILT4的表達(dá)在感染1 d后明顯上調(diào)。 sHLA-G水平在感染1 d后顯著升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-10水平在感染1 d后明顯上調(diào)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論: HCMV感染THP-1細(xì)胞能誘導(dǎo)HLA-G異構(gòu)體的差異表達(dá)，以HLA-G1和HLA-G5為主，且上調(diào)其表面受體ILT2/ILT4的表達(dá)。同時(shí)，HCMV感染能誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌IL-10。該研究為進(jìn)一步探討HCMV逃避機(jī)體免疫應(yīng)答的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

人巨細(xì)胞病毒； 人類白細(xì)胞抗原G； 抑制性受體； 感染

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)屬于皰疹病毒科β亞科的DNA病毒，是一種機(jī)會(huì)性病原體[1-2]。病毒感染后，機(jī)體快速啟動(dòng)的固有免疫和獲得性免疫能有效地清除病毒。但HCMV形成了多種機(jī)制來逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和防御，并在體內(nèi)長(zhǎng)期潛伏[3-4]，如抑制NK細(xì)胞殺傷功能、編碼細(xì)胞因子和趨化因子的類似物、干擾MHCⅠ類分子的功能和調(diào)節(jié)MHCⅡ類分子的表達(dá)等。

人類白細(xì)胞抗原G(human leukocyte antigen-G，HLA-G)屬于非經(jīng)典HLA-I類分子，是體內(nèi)一種重要的免疫耐受分子。初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)選擇性剪接，產(chǎn)生7種異構(gòu)體，即膜結(jié)合型分子(HLA-G1、-G2、-G3、-G4)和可溶型分子(HLA-G5、-G6、-G7)。其主要通過與多種免疫細(xì)胞表達(dá)的特異性受體(ILT2/CD85j、ILT4/CD85d、KIR2DL4/CD158d)結(jié)合發(fā)揮免疫抑制作用，包括抑制CD4+T細(xì)胞的增殖和樹突狀細(xì)胞的抗原提呈，抑制NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞的殺傷功能，刺激抗原提呈細(xì)胞分泌TGF-β、IL-10等細(xì)胞因子，上調(diào)抑制性受體的表達(dá)[5]。

近年來，雖在HCMV感染免疫逃逸方面取得了顯著進(jìn)展，但迄今為止其持續(xù)感染的分子免疫調(diào)控機(jī)制仍不明確。經(jīng)典MHC分子參與抗原的遞呈機(jī)制，一直是病毒感染免疫的研究重點(diǎn)。但有研究顯示：非經(jīng)典的MHCⅠ類分子HLA-G在病毒感染后免疫逃逸機(jī)制中亦發(fā)揮了關(guān)鍵作用，HCMV誘導(dǎo)HLA-G的表達(dá)已有報(bào)道，但仍不全面或存在爭(zhēng)議[6-7]，因此，我們用HCMV感染THP-1細(xì)胞后，研究HCMV感染THP-1細(xì)胞對(duì)HLA-G異構(gòu)體及其受體表達(dá)的影響，以進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和了解HLA-G在HCMV感染后持續(xù)潛伏中的作用。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株及病毒株

HCMV Towne株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，THP-1細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液及胎牛血清購自Gibco；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo；SDS-PAGE配膠試劑、RIPA裂解液、PMSF和BCA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；HLA-G (4H84)I抗購自Abcam；HLA-G (MEM-G/9)I抗購自Exbio；ILT2 (CD85j)和ILT4 (CD85d)抗體購自eBioscience；人IL-10和可溶性HLA-G(soluble HLA-G, sHLA-G)ELISA試劑盒購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自Life Technologies；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，詳見表1。

表1 HLA-G PCR擴(kuò)增所需引物的序列

3 方法

3.1 細(xì)胞感染模型的建立 純化后的HCMV Towne株感染THP-1細(xì)胞(1×109/L，MOI=5)，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～4 d后，每天半量換液，模型建立及確定與我們之前的研究相符合[8]。

3.2 HLA-G異構(gòu)體 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 提取感染組和未感染組THP-1細(xì)胞的總 RNA并測(cè)定其濃度，按照Thermo的cDNA合成試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖電泳驗(yàn)證。

3.3 Western blot實(shí)驗(yàn) 提取感染組和未感染組THP-1細(xì)胞的總蛋白，按照BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，蛋白樣品加熱變性后將不同蛋白樣品之間的濃度調(diào)到一致，上樣進(jìn)行Western blot檢測(cè)，使用抗HLA-G (4H84)檢測(cè)HLA-G蛋白水平。4H84是用HLA-G α1結(jié)構(gòu)域61～83位氨基酸片段免疫小鼠BALB/c而獲得的，所有的HLA-G亞型都包含α1結(jié)構(gòu)域，因此，4H84可以識(shí)別所有的HLA-G亞型。

3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)THP-1細(xì)胞HLA-G及其受體ILT2、ILT4的表達(dá) 收集未感染組和感染組THP-1細(xì)胞，分別往兩管中加入5 μL抗HLA-G(MEM-G/9)和同型對(duì)照/CD85j和同型對(duì)照/CD85d和同型對(duì)照，混勻后，避光30 min，30 min內(nèi)上機(jī)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)THP-1細(xì)胞HLA-G、ILT2和ILT4的表達(dá)。

3.5 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中sHLA-G和IL-10水平 根據(jù)人sHLA-G和IL-10 ELISA試劑盒使用說明書的步驟檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中sHLA-G和IL-10。

1) 采樣。按前述藥效試驗(yàn)處理和藥劑噴施方法，于各重復(fù)小區(qū)取一芽2葉茶青混合裝入保鮮袋，藥前采樣記錄為CK；藥液噴施完畢，葉片表面藥液水分揮發(fā)后采集的樣品記為0 d，其他采樣時(shí)間分別為藥后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、15 d、21 d和30 d。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，結(jié)果用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Annexin V-FITC/PI檢測(cè)THP-1細(xì)胞的存活率

HCMV感染THP-1細(xì)胞1～4 d后，用Annexin V-FITC/PI檢測(cè)THP-1細(xì)胞的存活率及凋亡率，結(jié)果顯示HCMV感染THP-1細(xì)胞后，細(xì)胞的存活率較高，細(xì)胞未出現(xiàn)明顯凋亡，與對(duì)照組比較，無顯著差異，見圖1。這說明HCMV感染THP-1細(xì)胞后，THP-1仍保持生存狀態(tài)，病毒感染不對(duì)細(xì)胞造成明顯損傷，所建立的細(xì)胞模型是可取的。

Figure 1.The viability of THP-1 cells infected with HCMV. Con: control group; Q1: necrotic cells; Q2: non-viable apoptotic cells; Q3: viable apoptotic cells; Q4: normal cells. Mean±SD.n=3.

圖1 HCMV感染對(duì)THP-1細(xì)胞存活率的影響

2 HCMV感染THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)HLA-G 異構(gòu)體的表達(dá)

HCMV感染THP-1細(xì)胞1～4 d后，無論是RNA水平還是蛋白水平，均能誘導(dǎo)HLA-G異構(gòu)體的差異表達(dá)。結(jié)果顯示HLA-G異構(gòu)體mRNA的表達(dá)以HLA-G1、-G3、-G4和-G5為主，相較對(duì)照組，以感染后1 d表達(dá)上調(diào)最為明顯。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HLA-G蛋白的表達(dá)以HLA-G1和HLA-G5為主。感染1 d后HLA-G1和HLA-G5 蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，見圖2。

Figure 2. HCMV induced expression of HLA-G isoforms in the THP-1 cells. A: the expression of HLA-G isoforms at mRNA level; B: the expression of HLA-G isoforms at protein level. Mean±SD.n=3.*P<0.05**P<0.01vscontrol (Con) group.

圖2 HCMV感染THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)HLA-G異構(gòu)體的表達(dá)

3 HCMV感染THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)HLA-G、ILT2和ILT4的表達(dá)

Figure 3. The expression of HLA-G (A), ILT2 (B) and ILT4 (C) in the THP-1 cells induced by HCMV infection. Blue lines: MEM-G/9, CD85 and CD85d; red lines: the same type control. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol (Con) group.

圖3 HCMV感染THP-1 細(xì)胞誘導(dǎo)HLA-G、ILT2和ILT4的表達(dá)

4 HCMV感染THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)sHLA-G的表達(dá)

HCMV感染THP-1細(xì)胞1～4 d后，用ELISA試劑盒檢測(cè)THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清中sHLA-G(主要為sHLA-G1和HLA-G5)水平。結(jié)果顯示感染1 d后，sHLA-G水平顯著升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

5 HCMV感染THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)

HCMV感染THP-1細(xì)胞1～4 d后，用ELISA試劑盒檢測(cè)THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，感染1 d后IL-10水平顯著升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖5。

Figure 4.Expression of sHLA-G in the THP-1 cell culture supernatant. Con: control group. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖4 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清中sHLA-G的水平

Figure 5.The level of IL-10 in the THP-1 cell culture supernatant. Con: control group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖5 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10水平的變化

討 論

HCMV感染機(jī)體后，形成了多種機(jī)制來逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和防御，如改變MHC的功能，干擾APC的抗原提呈功能以及抑制NK細(xì)胞和CD8+CTL細(xì)胞的殺傷作用等。近年研究數(shù)據(jù)顯示，HLA-G在病毒感染后的免疫逃逸中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

生理?xiàng)l件下，HLA-G的表達(dá)主要局限于滋養(yǎng)層細(xì)胞、角膜、胰島細(xì)胞和干細(xì)胞等。但病理情況如惡性腫瘤、器官移植、炎癥性疾病和病毒感染等均能誘導(dǎo)HLA-G分子異常表達(dá)[9]。HLA-G初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)選擇性剪接，產(chǎn)生7種異構(gòu)體，即膜結(jié)合型分子(HLA-G1、-G2、-G3、-G4)和可溶型分子(HLA-G5、-G6、-G7)。膜結(jié)合型HLA-G蛋白能在它表達(dá)的局部發(fā)揮作用，而sHLA-G除在局部發(fā)生作用外，還可通過循環(huán)系統(tǒng)發(fā)揮遠(yuǎn)端效應(yīng)。HLA-G主要通過與多種免疫細(xì)胞表達(dá)的特異性受體(ILT2/CD85j、ILT4/CD85d和KIR2DL4/CD158d)結(jié)合發(fā)揮免疫抑制作用。 ILT2/4抑制性受體胞質(zhì)區(qū)含有免疫受體酪氨酸抑制基序，HLA-G與ILT2/4相互作用，引起SHP-2、STAT5、p70S6K的磷酸化/去磷酸化，導(dǎo)致下游基因沉默。有研究表明，HLA-G在腫瘤細(xì)胞免疫逃逸及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[10]。我們前期研究結(jié)果也表明，HLA-G 14bp 插入/缺失多態(tài)性可能是HCMV活動(dòng)性感染的一個(gè)潛在易感因素[11]，但對(duì)其在HCMV逃避宿主免疫應(yīng)答中的作用尚不清楚。

病毒感染誘導(dǎo)HLA-G的異常表達(dá)能影響宿主的抗病毒免疫機(jī)制，利于病毒的復(fù)制和傳播[12]。據(jù)報(bào)道HIV、狂犬病毒(RABV)、HSV-1、HCV、HBV、甲型流感病毒等均能誘導(dǎo)表達(dá)HLA-G。Lozano 等[13]研究發(fā)現(xiàn)HIV陽性患者血液中的CD8+T細(xì)胞和單核細(xì)胞能高表達(dá)HLA-G，同時(shí)發(fā)現(xiàn)HIV長(zhǎng)期進(jìn)展者血清中sHLA-G的水平明顯高于不進(jìn)展者，表明HLA-G的異常表達(dá)是HIV逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊的重要機(jī)制之一。有研究報(bào)道，不同病毒感染能上調(diào)HLA-G不同異構(gòu)體的表達(dá)。Lafon等[14]證實(shí)嗜神經(jīng)病毒(HSV-1和RABV)感染可使神經(jīng)細(xì)胞(包括受感染的神經(jīng)細(xì)胞和未感染的神經(jīng)細(xì)胞)HLA-G表達(dá)增加，其中RABV主要上調(diào)HLA-G1，而HSV-1上調(diào)HLA-G3和HLA-G5的表達(dá)。國內(nèi)外也有研究表明，HCMV感染影響HLA-G的表達(dá)，Yan等[15]發(fā)現(xiàn)HCMV活動(dòng)性感染患者體內(nèi)外周血單個(gè)核細(xì)胞中膜結(jié)合型和可溶性HLA-G的表達(dá)明顯升高，但具體機(jī)制尚不明確。在本研究中，我們以THP-1為細(xì)胞模型建立HCMV 潛伏感染，分析了HCMV感染THP-1細(xì)胞后HLA-G異構(gòu)體的差異表達(dá)。THP-1細(xì)胞屬于髓系細(xì)胞，是HCMV 潛伏感染的主要靶細(xì)胞且免疫功能明確，感染HCMV后，細(xì)胞狀態(tài)無明顯變化，細(xì)胞基本為存活細(xì)胞，有利于病毒的持續(xù)復(fù)制且病毒感染不對(duì)細(xì)胞造成明顯損傷。數(shù)據(jù)顯示HCMV感染THP-1細(xì)胞后上調(diào)HLA-G的表達(dá)，以HLA-G1和HLA-G5為主。這表明HLA-G的異常表達(dá)可能是HCMV感染后免疫逃逸的關(guān)鍵，且HLA-G1和HLA-G5在HCMV免疫逃逸中發(fā)揮的作用優(yōu)于其它HLA-G異構(gòu)體。

HLA-G可直接與抑制性受體結(jié)合發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。其中，ILT2表達(dá)在所有的單核、樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞以及部分T細(xì)胞和NK細(xì)胞；ILT4僅分布在單核和樹突狀細(xì)胞等髓樣細(xì)胞，這些抑制性受體在初始型免疫細(xì)胞中處于低水平表達(dá)狀態(tài)，但在活化的免疫細(xì)胞或病理?xiàng)l件下表達(dá)上調(diào)[16]。已有研究報(bào)道ILT2/HLA-G相互作用活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要參與調(diào)控T細(xì)胞生物學(xué)功能，在T細(xì)胞趨化受體的表達(dá)及T 細(xì)胞周期等方面起重要作用。HLA-G與單核細(xì)胞上的抑制性受體ILT2或ILT4結(jié)合后，可刺激細(xì)胞分泌TGF-β、IL-10 等細(xì)胞因子，使Th1/Th2 平衡移向Th2，同時(shí)增加抑制性受體ILT2或ILT4的表達(dá)[17]。本研究顯示HCMV感染使細(xì)胞表面ILT2和ILT-4表達(dá)明顯增加，這說明，HCMV感染THP-1細(xì)胞以后，HLA-G異常表達(dá)，結(jié)合抑制性受體ILT2/ILT4后發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)，HLA-G與ILT2/ILT4相互作用從而可能影響單核細(xì)胞的免疫功能，但具體機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

細(xì)胞因子可調(diào)控HLA-G的表達(dá)。有研究報(bào)道，細(xì)胞因子IL-10、IFN-γ和IFN-α能上調(diào)HLA-G的表達(dá)[18]。IL-10是一種重要的Th2型細(xì)胞因子，除具有重要的免疫抑制作用外，還具有免疫刺激作用[19]。本研究中，HCMV感染THP-1后IL-10分泌增加且HLA-G表達(dá)上調(diào)。兩者相互作用，一方面，HLA-G能促進(jìn)IL-10的分泌，使Th1/Th2平衡向Th2偏移；另一方面，IL-10又能上調(diào)HLA-G的表達(dá)，之間形成的正反饋在病毒免疫逃逸中起著重要調(diào)控作用[20]。

綜上所述，HCMV感染THP-1細(xì)胞能影響HLA-G異構(gòu)體及抑制性受體ILT2/ILT4的表達(dá)，這可能是HCMV逃避機(jī)體免疫應(yīng)答的重要機(jī)制之一。但HCMV感染后HLA-G及其抑制性受體ILT2/ILT4的異常表達(dá)對(duì)THP-1細(xì)胞免疫功能的影響目前研究較少，機(jī)制尚不清楚，值得進(jìn)一步研究和探討。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

HCMV-infected human THP-1 cells induce expression of HLA-G and its receptors

LAI Mei-mei1, 2,ZHOU Qiu-ju1, 2,LOU Yun-yan1, 2, GUO Bin-han1, 2, WANG Hui-yan1, 2, ZHENG Xiao-qun1, 2

(1DepartmentofLaboratoryMedicine,TheSecondAffiliatedHospital&YuyingChildren’sHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China;2SchoolofLaboratoryMedicalScience,WenzhouMedicalUniversity,TheKeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,MinistryofEducationofChina,Wenzhou325035,China.E-mail:jszhengxq@163.com)

AIM: To investigate the differential expression of human leukocyte antigen-G (HLA-G) isoforms and its receptors in human monocyte line THP-1 after human cytomegalovirus (HCMV) infection for exploring the role of HLA-G in HCMV escaping the immune response of the organism. METHODS: THP-1 cells were infected with HCMV Towne strain. The expression of HLA-G isoforms at mRNA and protein levels was determined by RT-PCR and Western blot, respectively. The surface expression of HLA-G and its receptors ILT2/ILT4 and the cell viability were analyzed by flow cytometry. The levels of soluble HLA-G (sHLA-G) and IL-10 were measured by ELISA. RESULTS: After infection of the THP-1 cells with HCMV, no obvious apoptosis in the cells was observed, and the viability of the cells was high. A significant up-regulation of HLA-G1, -G3, -G4 and -G5 at mRNA expression level 1 d after infection was found, while the protein expression of HLA-G1 and HLA-G5 isoforms was mainly detected. The expression of HLA-G/ILT2/ILT4 was evidently up-regulated 1 d after infection. The level of sHLA-G was significantly increased 1 d after infection as compared with control group (P<0.01). The expression of IL-10 was obviously up-regulated 1 d post-infection as compared with control group. CONCLUSION: The differential expression of HLA-G isoforms and secretion of the receptors ILT2/ILT4 and IL-10 in the THP-1 cells are induced after HCMV infection. This study provides experimental evidence for evaluating the immune mechanism of HCMV infection.

Human cytomegalovirus; Human leukocyte antigen-G; Inhibitory receptor; Infection

1000- 4718(2017)02- 0329- 07

2016- 09- 09

2016- 11- 21

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生課題項(xiàng)目(No.2017KY474);溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. Y20150304)

R392.32

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.022

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