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    超聲波輔助的乙醇—硫酸銨雙水相聯(lián)合提取魚腥草總黃酮工藝

    2017-02-27 14:40郝紅英周芳王改利
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:正交設(shè)計(jì)總黃酮提取工藝

    郝紅英+周芳+王改利

    摘要:為了優(yōu)化超聲波輔助的乙醇-硫酸銨雙水相聯(lián)合提取魚腥草總黃酮的工藝,通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化影響總黃酮提取率的各因素水平,通過正交試驗(yàn)確定各因素組合的影響程度。結(jié)果表明,各因素的影響排序?yàn)橐掖紳舛?提取溫度>提取時間>料液比;最佳提取條件為脫脂魚腥草粉末2.0 g、乙醇用量32.50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、硫酸銨用量16.00%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、料液比1 g ∶20 mL、超聲波頻率300 W、超聲波處理溫度70 ℃、超聲波處理時間50 min,在此條件下,魚腥草總黃酮提取率為2.97%。由結(jié)果可知,超聲波-乙醇/硫酸銨雙水相聯(lián)合提取法提取效率高,操作簡便,是一種很有發(fā)展前途的提取方法。

    關(guān)鍵詞:雙水相;魚腥草;總黃酮;提取工藝;正交設(shè)計(jì);超聲波輔助提取

    中圖分類號: R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號:1002-1302(2017)01-0183-03

    魚腥草(Houttuynia cordata Thunb.)是三白草科蕺菜屬多年生草本植物,營養(yǎng)豐富,具有多種藥理作用:抗菌、抗病毒、抗炎、抗過敏、抗腫瘤,此外,魚腥草還可以增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[1-2]。魚腥草含有多種成分[3-4],如揮發(fā)油、阿福豆苷、金絲桃苷及蕺菜堿等,其中黃酮類成分有斛皮素、斛皮苷、綠原酸、金絲桃苷等。目前關(guān)于魚腥草活性成分的提取尚無統(tǒng)一的方法,主要運(yùn)用的提取方法有水煎煮法、醇提取法、索式抽提取法、超聲波提取法等[5]。超聲波能使植物組織細(xì)胞破裂,利于細(xì)胞中的成分進(jìn)入溶劑中,加速細(xì)胞成分與溶劑的相互滲透和溶解,從而提高黃酮類化合物在溶劑中的溶解度[6]。超聲波提取法具有操作簡單、能耗低、可以縮短提取時間、可提高有效成分的提取率、減少溶劑的使用量、提取成本低等特點(diǎn),因此,目前超聲波技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物有效成分的提取[7]。雙水相提取技術(shù)因設(shè)備投資少、操作簡單,引起了人們極大的重視,并且被廣泛用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化工等領(lǐng)域[8],但是目前未見采用超聲波-雙水相聯(lián)合提取魚腥草總黃酮的報(bào)道。因此,本研究結(jié)合超聲波輔助提取法、雙水相萃取法2種方法的優(yōu)點(diǎn),采用超聲波-乙醇/硫酸銨雙水相體系提取魚腥草中主要成分黃酮,以總黃酮得率為指標(biāo),采用單因素和正交試驗(yàn)法,確定提取總黃酮有效成分的較佳工藝,旨在為魚腥草總黃酮提取工藝的產(chǎn)業(yè)化提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    魚腥草,購自當(dāng)?shù)厮幍?。蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)樣品,由中國藥品生物制品檢定所提供,為生化試劑;其他試劑均為分析純。

    超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;電熱恒溫水溫箱,北京市永光明醫(yī)療儀器廠;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;7230G型可見分光光度計(jì),上海菁華科技儀器有限公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 魚腥草中黃酮類化合物含量的測定參照文獻(xiàn)[9-10]的方法,以蕓香苷為標(biāo)樣測定魚腥草總黃酮類化合物含量,所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.093 8x+0.000 1。式中:y為蕓香苷質(zhì)量濃度,g/mL;x為吸光度;r2=0.999 8。

    1.2.2 魚腥草總黃酮的提取與測定 魚腥草總黃酮的提?。悍Q取魚腥草干細(xì)粉(過60目篩)于索氏提取器中,經(jīng)石油醚脫脂,并除去部分色素。稱取2.0 g處理樣品于250 mL碘量瓶中,按一定的料液比加入乙醇-硫酸銨雙水相溶液,置于超聲波清洗器中,提取一段時間后,過濾,靜置分層,將濾液用分液漏斗將兩相分開,將醇相提取液高速離心25 min,即得魚腥草總黃酮類化合物提取液,后經(jīng)微孔濾膜過濾,精確稱取一定量用甲醇定容至250 mL,以供分析測試用。

    魚腥草總黃酮的測定:取2.5 mL樣品溶液至25 mL容量瓶中,加1 mL 5% NaNO2(質(zhì)量體積比,下同),搖勻,放置 5 min 后加入1 mL 10% Al(NO3)3(質(zhì)量體積比,下同),5 min后再加入10 mL 4% NaOH(質(zhì)量體積比,下同),搖勻,用蒸餾水稀釋至刻度,10 min后于7230G型可見分光光度計(jì)上在510 nm處測定吸光度D510 nm,根據(jù)蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,得到提取液濃度,總黃酮提取率按照下式計(jì)算:

    Et=(C×V×D)/m×100%。

    式中:Et為總黃酮提取率,%;C為測得的提取液濃度,g/mL;V為提取液體積,mL;D為稀釋倍數(shù);m為原料的質(zhì)量,g。

    1.2.3 超聲波處理時間對魚腥草總黃酮提取率的影響 采用超聲波功率300 W、恒定的乙醇用量32.50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)、超聲波處理溫度50 ℃、硫酸銨用量16.00%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)的條件,稱取2.0 g處理樣品,選擇料液比 1 g ∶20 mL,研究不同超聲波處理時間(10、20、30、40 min)對魚腥草總黃酮提取率的影響。

    1.2.4 料液比對魚腥草總黃酮提取率的影響 采用超聲波功率300 W、超聲波處理時間20 min、恒定的乙醇用量32.50%、超聲波處理溫度50 ℃、硫酸銨用量16.00%的條件,稱取 2.0 g 處理樣品,研究不同料液比(1 g ∶15 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL)對魚腥草總黃酮提取率的影響。

    1.2.5 超聲波處理溫度對魚腥草總黃酮提取率的影響 采用超聲波功率300 W、超聲波處理時間20 min、硫酸銨用量 16.00%、乙醇用量32.50%的條件,稱取2.0 g處理樣品,料液比選擇1 g ∶20 mL,研究不同超聲波處理溫度(30、40、50、60 ℃)對魚腥草總黃酮提取率的影響

    1.2.6 正交試驗(yàn) 在硫酸銨質(zhì)量濃度、超聲波功率確定的情況下,以乙醇用量(體積分?jǐn)?shù))、超聲波提取溫度、料液比(m魚腥草 ∶V雙水相溶劑)、超聲提取時間為考察因素,設(shè)計(jì)L9(34)正交表(表1),并按照此正交表安排試驗(yàn),重復(fù)上述操作。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 超聲波處理時間對魚腥草總黃酮提取率的影響

    從圖1可以看出,總黃酮提取率在超聲波處理10~20 min 時逐漸增高,而后隨著處理時間的延長逐漸降低。其原因可能是超聲波處理時間越長,超聲波對魚腥草細(xì)胞壁組織的破壞程度就越大,更有利于黃酮類物質(zhì)的釋放和進(jìn)入溶液,但過長的超聲處理時間,可能會引起黃酮類化合物的破壞和氧化。因此綜合分析可知,乙醇-硫酸銨雙水相體系超聲提取魚腥草總黃酮的處理時間以20 min為宜。

    2.2 料液比對魚腥草總黃酮提取率的影響

    從圖2可以看出,總黃酮提取率隨料液比的增大而提高,當(dāng)料液比為1 g ∶20 mL時,提取率最高;隨著料液比的進(jìn)一步增大,溶劑用量過大,會造成雙水相鹽用量增加,不僅耗費(fèi)大量的溶劑和銨鹽,也會給后續(xù)處理帶來不必要的麻煩。

    2.3 超聲提取溫度對魚腥草總黃酮提取率的影響

    從圖3可以看出,隨著超聲提取溫度的升高,總黃酮提取率提高;當(dāng)超聲溫度超過50 ℃時,提取率降低。超聲溫度低,導(dǎo)致黃酮不能完全溶出;而溫度過高,使超聲波破壞魚腥草細(xì)胞組織的能力增強(qiáng),黃酮類物質(zhì)更易浸出,但是在超聲波的作用下,過高的處理溫度會導(dǎo)致魚腥草黃酮類物質(zhì)因氧化或被超聲波破壞等原因,使變質(zhì)的量增加,同時溫度升高也會增加乙醇揮發(fā)量。因此由結(jié)果可以確定,50 ℃為魚腥草總黃酮提取的最佳溫度條件。

    2.4 多因素正交試驗(yàn)結(jié)果

    在單因素考察的基礎(chǔ)上,為了得到更好的條件,進(jìn)行正交試驗(yàn)。選取3因素4水平,使用L9(34)正交設(shè)計(jì)(表1)來安排試驗(yàn),結(jié)果見表2、表3。

    從表2、表3可知,各因素對提取率影響排序?yàn)橐掖加昧?gt;超聲提取溫度>超聲處理時間>料液比,其中乙醇濃度對魚腥草中總黃酮提取率的影響最大。由分析結(jié)果初步認(rèn)為,超聲波-乙醇/硫酸銨雙水相體系提取魚腥草總黃酮的最佳條件:在魚腥草質(zhì)量為2.00 g的情況下,硫酸銨用量為 16.00%,乙醇用量32.50%,料液比1 g ∶20 mL,提取溫度 70 ℃,處理時間50 min。

    2.5 平行試驗(yàn)結(jié)果

    為進(jìn)一步驗(yàn)證此正交試驗(yàn)結(jié)果的可考性和重現(xiàn)性,按照所得最佳條件做了3次平行試驗(yàn),總黃酮提取率分別為 3.00%、2.97%、2.94%,均值為2.97%,RSD為0.03%。結(jié)果表明,使用正交試驗(yàn)得出的方法,優(yōu)化出了最佳提取工藝,提取率均值為2.97%,不但提取率較高,而且試驗(yàn)的重現(xiàn)性好。

    3 討論

    通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)法,優(yōu)選出魚腥草總黃酮的雙水相最佳提取工藝:脫脂魚腥草粉末2.0 g,乙醇用量32.50%,硫酸銨用量16.00%,料液比1 g ∶20 mL,超聲波功率300 W,提取溫度70 ℃,處理時間50 min。在此條件下,魚腥草總黃酮提取率為2.97%。

    超聲波-乙醇/硫酸銨雙水相聯(lián)合提取法是一種新型的液-液萃取技術(shù),反應(yīng)條件溫和,提取時間短,提取效率高,操作簡便,不存在有機(jī)殘留問題,是一種很有發(fā)展前景的聯(lián)合提取方法。

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