• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    黃鱔醛酮還原酶的羰基解毒作用初探

    2017-02-27 11:17代海艷江翱李偉
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:黃鱔存活率

    代海艷+江翱+李偉

    摘要:醛酮還原酶(aldo-keto reductase,AKR)是機(jī)體依賴NAD(P)H的一類重要的氧化還原酶,在細(xì)胞有毒羰基化合物代謝中具有重要作用。迄今為止,國(guó)內(nèi)外尚無(wú)魚類醛酮還原酶基因及其功能的報(bào)道。為了解魚類醛酮還原酶在細(xì)胞抗有毒羰基化合物脅迫過(guò)程中的作用,筆者比較了含重組黃鱔AKR基因的陽(yáng)性菌株和不含該重組基因的陰性對(duì)照在丙酮醛及2,3-丁二酮2種羰基化合物處理后的存活率。結(jié)果表明,隨著毒性物質(zhì)處理時(shí)間的延長(zhǎng)和處理濃度的升高,陽(yáng)性菌株和對(duì)照菌株存活率均呈逐漸下降趨勢(shì);陽(yáng)性菌株的存活率始終極顯著高于對(duì)照菌株(P<0.01)。結(jié)果提示,黃鱔的醛酮還原酶具有一定的羰基解毒作用。該研究為進(jìn)一步深入了解魚類AKR基因的功能提供了基礎(chǔ)資料。

    關(guān)鍵詞:黃鱔;醛酮還原酶;羰基脅迫;存活率;解毒作用

    中圖分類號(hào):S941.91 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2017)01-0150-03

    醛酮還原酶(aldo-keto reductase,AKRs)超家族是一類廣泛存在依賴于NAD(P)H的氧化還原酶[1]。生物體內(nèi)氧化應(yīng)激[2]、致癌化合物降解[3]、糖尿病并發(fā)癥及腫瘤發(fā)生[4]等過(guò)程都有AKRs的參與。細(xì)胞內(nèi)存在低濃度的羰基化合物如不能被及時(shí)降解,就會(huì)通過(guò)羰基化修飾使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子發(fā)生構(gòu)象變化和功能喪失,并最終導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂,引起癌變或壞死,這就是所謂的“羰基脅迫”[5]。醛酮還原酶可以將對(duì)細(xì)胞毒害較強(qiáng)的羰基化合物還原成相應(yīng)的對(duì)細(xì)胞毒害作用較小或無(wú)毒性的醇類物質(zhì),承擔(dān)機(jī)體防護(hù)酶的作用[6]。研究表明,大腸桿菌[7]及藍(lán)藻[8]的AKR基因產(chǎn)物可有效降解丙酮醛、甘油醛等羰基化合物對(duì)細(xì)胞的毒害作用。植物的AKRs分子參與植物各種各樣的逆境脅迫反應(yīng),是植物防御系統(tǒng)中不可或缺的部分[9]。人類的AKR1B10基因轉(zhuǎn)化到293T細(xì)胞中后,可有效降低不飽和羰基對(duì)細(xì)胞的毒害作用[10]。老鼠的AKR7A1基因在中國(guó)倉(cāng)鼠V79-4細(xì)胞中的表達(dá)也可提高細(xì)胞對(duì)丙烯醛和HNE的抵抗力[11]。這些試驗(yàn)結(jié)果表明,生理狀態(tài)下的醛酮還原酶對(duì)細(xì)胞毒性羰基物質(zhì)具有解毒功能。

    盡管有關(guān)于高等脊椎動(dòng)物、細(xì)菌和植物的醛酮還原酶分子的研究眾多,但人們對(duì)于魚類的醛酮還原酶基因及其功能卻知之甚少。苯并芘(BaP)處理羅非魚可顯著提高其肝組織醛酮還原酶AKR1A1基因的大量表達(dá),該研究結(jié)果提示羅非魚的AKR1A1分子可能在BaP解毒過(guò)程中具有重要的作用[12]。在前期的研究中,筆者所在實(shí)驗(yàn)室克隆了黃鱔肝臟醛酮還原酶基因并構(gòu)建了其原核表達(dá)載體。為進(jìn)一步分析黃鱔醛酮還原酶在細(xì)胞抗羰基脅迫中的作用,筆者對(duì)比了含有重組黃鱔醛酮還原酶基因和不含該基因的大腸桿菌在受到丙酮醛和2,3-丁二酮等有毒羰基化合物脅迫后的存活率,分析了羰基化合物處理時(shí)間和濃度差異對(duì)細(xì)胞毒性的影響。這為深入了解魚類的醛酮還原酶的羰基解毒作用和功能提供了重要參考資料。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)菌株和試劑

    含pET-28a-EakR1重組質(zhì)粒的BL21(DE3)菌株和含pET-28a空白質(zhì)粒的BL21(DE3)菌株,由長(zhǎng)江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所保存;丙酮醛和2,3丁二酮,購(gòu)買于Aladdin公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 菌株活化及誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè)

    將重組陽(yáng)性菌株和對(duì)照菌在含50 μg/mL Kan的LB平板上劃線,在37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取于單克隆LB液體培養(yǎng)基中,在37 ℃、250 r/min恒溫?fù)u床上培養(yǎng)4 h后,加入終濃度為 0.1 mmol/L 的IPTG,誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h,取適量菌液用12%的 SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

    1.3 羰基化合物濃度大小對(duì)大腸桿菌存活率的影響

    挑取陽(yáng)性重組菌單克隆于6 mL含50 μg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、250 r/min培養(yǎng)3 h后,加入終濃度為 0.5 mmol/L 的IPTG,繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)1 h。將誘導(dǎo)培養(yǎng)液分裝至6只EP管中,然后在EP管中加入丙酮醛(或2,3-丁二酮),使其終濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L,進(jìn)一步在37 ℃靜置1 h。離心收集菌體,滅菌水洗滌3次后用1 mL新鮮液體LB重懸。取10 μL菌液進(jìn)行101、102、103、104、105、106…倍梯度稀釋。取稀釋后的系列菌液50 μL涂布在含Kana的LB平板上后于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)12 h。選擇菌落數(shù)在100~500的平板,用Shineso公司的平板菌落計(jì)數(shù)儀進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),根據(jù)相應(yīng)稀釋倍數(shù)推算稀釋前的總菌落個(gè)數(shù)。計(jì)算出不同濃度丙酮醛(或2,3-丁二酮)處理后大腸桿菌的存活率(SC)。對(duì)照菌同樣處理,重復(fù)3次。

    SC=各濃度丙酮醛(2,3-丁二酮)處理后的總菌落個(gè)數(shù)不添加丙酮醛(2,3-丁二酮)處理的總菌落個(gè)數(shù)×100%。

    1.4 羰基化合物處理時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)大腸桿菌存活率的影響

    按照“1.3”節(jié)進(jìn)行重組菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)后的菌液中加入終濃度為2 mmol/L的丙酮醛(或2,3-丁二酮),分別在37 ℃靜置培養(yǎng)0、10、20、30、40、50、60 min。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出菌液0.1 mL,離心收集菌體并進(jìn)行梯度稀釋。稀釋后的菌液取50 μL涂布在含Kana的LB平板上后于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)12 h。選擇菌落數(shù)在100~500的平板,用Shineso公司的平板菌落計(jì)數(shù)儀進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),根據(jù)相應(yīng)稀釋倍數(shù)推算稀釋前的總菌落個(gè)數(shù)。計(jì)算出丙酮醛(或2,3-丁二酮)處理不同時(shí)間大腸桿菌的存活率(ST)。對(duì)照菌同樣處理,重復(fù)3次。

    ST=丙酮醛(2,3-丁二酮)處理不同時(shí)間后的總菌落個(gè)數(shù)不添加丙酮醛(2,3-丁二酮)處理的總菌落個(gè)數(shù)×100%。

    1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

    數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0軟件中的單因素方差分析(A-NOVA)進(jìn)行,存活率結(jié)果用 x±s表示,并進(jìn)行Duncans多重比較檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)為差異顯著,當(dāng)P<0.01時(shí)差異極顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

    由圖1可知,相對(duì)于陽(yáng)性重組質(zhì)粒,空白質(zhì)粒菌株在用IPTG誘導(dǎo)前后均沒(méi)有表達(dá)外源蛋白;而含有EakR1的重組菌株用IPTG誘導(dǎo)后與未誘導(dǎo)相比明顯表達(dá)了EakR1。EakR1分子量大約為37 ku,與醛酮還原酶理論分子量大小相符。這說(shuō)明黃鱔AKR基因可以實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌BL21(DE3)中的融合表達(dá)。

    2.3 羰基化合物濃度大小對(duì)大腸桿菌存活率的影響結(jié)果

    由圖2可知,丙酮醛的處理對(duì)大腸桿菌細(xì)胞有著極強(qiáng)的毒害作用;隨著丙酮醛濃度升高,2組大腸桿菌的存活率都極顯著下降。當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中丙酮醛濃度達(dá)到2.5 mmol/L時(shí),陰性對(duì)照菌株的存活率極低(10-3%~10-4%),而陽(yáng)性重組菌株的存活率(約1%)與陰性對(duì)照相比有極顯著提高,約為陰性對(duì)照菌株存活率1 000~10 000倍。

    由圖3可知,2,3-丁二酮處理對(duì)大腸桿菌細(xì)胞也有較強(qiáng)毒害作用,但效果比丙酮醛低得多。隨著2, 3-丁二酮濃度升高,2組大腸桿菌菌株存活率也出現(xiàn)明顯降低。當(dāng)培養(yǎng)基

    中2,3-丁二酮的濃度達(dá)到2.5 mmol/L時(shí),陰性對(duì)照菌株的存活率只有約5%,而陽(yáng)性重組菌株存活率達(dá)到44%,約為空質(zhì)粒對(duì)照菌株存活率的9倍。

    2.5 羰基化合物處理時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)大腸桿菌存活率的影響結(jié)果

    由圖4可知,當(dāng)與2 mmol/L丙酮醛共同培養(yǎng)時(shí),隨著時(shí)間延伸,陽(yáng)性重組菌及對(duì)照菌株的存活率都呈逐漸下降的趨勢(shì);且丙酮醛對(duì)陰性對(duì)照菌株的毒害作用要明顯高于陽(yáng)性重組菌株。當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到60 min時(shí),陰性對(duì)照菌株的存活率約為10-3%,而重組菌株的存活率約為1.4%,約為對(duì)照菌株的 1 400 倍。

    相似地,如圖5可知,2,3-丁二酮對(duì)細(xì)胞的毒害作用要低于丙酮醛,隨著處理時(shí)間延長(zhǎng),2組菌株的存活率也呈下降趨勢(shì);當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到60 min時(shí),陰性對(duì)照菌株的存活率約為6.8%,而陽(yáng)性重組菌株的存活率約為55.8%,約為對(duì)照菌株的8倍。

    3 討論

    醛酮還原酶在自然界分布廣泛且結(jié)構(gòu)相對(duì)保守;具有多樣化的功能,可能參與了細(xì)胞內(nèi)各種各樣羰基化合物的代謝作用[1]。作為羥化類固醇脫氫酶(HSD),它們參與了高等哺乳動(dòng)物的類固醇代謝平衡調(diào)節(jié)和致病過(guò)程[13];作為醛糖還原酶,它們與多種慢性疾病或并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14];作為酮還原酶或醛還原酶,它們是機(jī)體細(xì)胞外源性或內(nèi)源性毒性物質(zhì)代謝的重要分子[15]。盡管不同來(lái)源的醛酮還原酶具有相類似的(α/β)8桶裝二級(jí)結(jié)構(gòu)和催化四分體氨基酸,它們?cè)诘孜镒R(shí)別和催化機(jī)理上還是存在非常大的差異[16]。作為醛酮還原酶超級(jí)家族中一個(gè)新的成員,黃鱔醛酮還原酶的功能有待深入研究。

    甘油醛是細(xì)胞甘油代謝途徑產(chǎn)生的對(duì)細(xì)胞有高毒性的化合物,它可修飾或改變細(xì)胞內(nèi)大分子化合物的構(gòu)象及功能[17]?,F(xiàn)有研究表明,大多數(shù)細(xì)胞的甘油醛解毒作用是通過(guò)Ⅰ型和Ⅱ型乙二醛酶的轉(zhuǎn)化來(lái)實(shí)現(xiàn)的[18];越來(lái)越多的試驗(yàn)也證實(shí)醛酮還原酶可將甘油醛轉(zhuǎn)化為低毒的丙酮醇以實(shí)現(xiàn)解毒作用,是細(xì)胞抗羰基脅迫的重要分子。細(xì)菌的醛酮還原酶分子在體內(nèi)對(duì)甘油醛具有明顯的降解作用[19-20],低等的藍(lán)藻也對(duì)醛酮還原酶降解丙酮醛有較強(qiáng)的依賴作用[8]。

    筆者研究表明,丙酮醛和2,3-丁二酮等羰基化合物對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)均具有較強(qiáng)的毒害作用;且丙酮醛的毒害作用遠(yuǎn)大于2,3-丁二酮,其對(duì)大腸桿菌致死率約為2,3-丁二酮的6 000倍。重組黃鱔EakR1的菌株能夠顯著提高細(xì)菌抵抗羰基化合物毒害作用的能力。其中,在丙酮醛脅迫試驗(yàn)中能夠?qū)⒋竽c桿菌的存活率提高1 000~10 000倍;在2,3-丁二酮脅迫試驗(yàn)中能夠?qū)⒋竽c桿菌的存活率提高約9倍。表明,黃鱔EakR1基因在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物能夠有效降解丙酮醛和2,3-丁二酮等有毒羰基化合物,起到保護(hù)酶的作用。當(dāng)然,目前對(duì)于醛酮還原酶在黃鱔羰基化合物脅迫和其他生理過(guò)程中的具體作用和機(jī)制尚不可知,需要進(jìn)一步深入研究。該試驗(yàn)結(jié)果為人們深入了解魚類醛酮還原酶的功能并應(yīng)用于魚類養(yǎng)殖實(shí)踐提供了基礎(chǔ)資料。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Jez J M,Bennett M J,Schelgel B P,et al. Comparative anatomy of the aldo-keto reductase superfamily[J]. Biochemical Journal,1997,326:625-636.

    [2]Endo S,Matsunaga T,Mamiya H,et al. Characterization of a rat NADPH-dependent aldo-keto re ductase (AKR1B13) induced by oxidative stress[J]. Chemico-Biological Interactions,2009,178:151-157.

    [3]Korenaga D,Takesue F,Yasuda M,et al. The relationship between cyclin B1 overexpression and lymph node metastasis in human colorectal cancer[J]. Surgery,2002,131(Suppl1):S114-S120.

    [4]Penning T M. The aldo-keto reductases (AKRs)[J]. Chemico-Biological Interactions,2015,234:236-246.

    [5]Miyata T,van Ypersele de Strihou C,Kurokawa K,et al. Alterations in nonenzymatic biochemistry in uremia:origin and significance of“carbonyl stress”in long-term uremic complications[J]. Kidney International,1999,55(2):389-399.

    [6]Li D,F(xiàn)errari M,Ellis E M. Human aldo-keto reductase AKR7A2 protects against the cytotoxicity and mutagenicity of reactive aldehydes and lowers intracellular reactive oxygen species in hamster V79-4 cells[J]. Chemico-Biological Interactions,2012,195(1):25-34.

    [7]Lapthorn A J,Zhu X F,Ellis E M. The diversity of microbial aldo-keto reductases from Escherichia coli K12[J]. Chemico-Biological Interactions,2013,202(1/2/3):168-177.

    [8]Xu D Y,Liu X W,Guo C,et al. Methylglyoxal detoxification by an aldo-keto reductase in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002[J]. Microbiology-SGM,2006,152(7):2013-2021.

    [9]Sengupta D,Naik D,Reddy A R. Plant aldo-keto reductases (AKRs) as multi-tasking soldiers involved in diverse plant metabolic processes and stress defense:a structure-function update[J]. Journal of Plant Physiology,2015,179:40-55.

    [10]鐘琳琳.AKRIB10蛋白對(duì)α,β-不飽和羰基的解毒作用[D]. 沈陽(yáng):中國(guó)醫(yī)科大學(xué),2009.

    [11]李 丹,馬東初,張歧山,等. 醛酮還原酶AKR7A1在活性醛引起的V79-4細(xì)胞損傷中的作用[J]. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,42(5):408-411.

    [12]Osorio-Yez C,Luis García-Tavera J,Téresa Pérez-Núez M,et al. Benzo(a)pyrene induces hepatic AKR1A1 mRNA expression in tilapia fish (Oreochromis niloticus)[J]. Toxicology Mechanisms and Methods,2012,22(6):438-444.

    [13]Riner T L,Penning T M. Role of aldo-keto reductase family 1 (AKR1) enzymes in human steroid metabolism[J]. Steroids,2014,79(1):49-63.

    [14]谷 娟,嚴(yán) 謹(jǐn),吳衛(wèi)華,等. 醛糖還原酶的研究進(jìn)展[J]. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2010,35(4):395-400.

    [15]Barski O A,Tipparaju S M,Bhatnagar A. The aldo-keto reductase superfamily and its role in drug metabolism and detoxification[J]. Drug Metabolism Reviews,2008,40(4):553-624.

    [16]Penning T M. The aldo-keto reductases (AKRs):overview[J]. Chemico-Biological Interactions,2015,234(5):236-246.

    [17]Ferguson G P,Ttemeyer S,Maclean M J,et al. Methylglyoxal production in bacteria:suicide or survival[J]. Archives of Microbiology,1998,170(4):209-218.

    [18]Kalapos M P. Methylglyoxal in living organisms. Chemistry,biochemistry,toxicology and biological implications[J]. Toxicol Lett,1999,110,145-175.

    [19]Ko J,Kim I,Yoo S,et al. Conversion of methylglyoxal to acetol by Escherichia coli aldo-keto reductases[J]. J Bacteriol,2005,187,5782-5789.

    [20]Grant A W,Steel G,Waugh H,et al. A novel aldo-keto reductase from Escherichia coli can increase resistance to methylglyoxal toxicity[J]. FEMS Microbiology Letters,2003,218(1):93-99.楊偉克,唐芬芬,劉增虎,等. 高溫和低溫條件下琥珀蠶血淋巴SOD及CAT活性的變化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,45(1):153-155.

    猜你喜歡
    黃鱔存活率
    損耗率高達(dá)30%,保命就是保收益!這條70萬(wàn)噸的魚要如何破存活率困局?
    水產(chǎn)小白養(yǎng)蛙2年,10畝塘預(yù)計(jì)年產(chǎn)3.5萬(wàn)斤,畝純利15000元!存活率90%,他是怎樣做到的?
    海南石斑魚明年或減產(chǎn)40%!魚苗存活率低,成魚賣不起價(jià),石斑魚怎么了?
    黃鱔料占全國(guó)的70%,今年特種料將激增40%,看這家企業(yè)如何再造輝煌?
    摳黃鱔
    池塘小網(wǎng)箱養(yǎng)殖黃鱔
    黃鱔銷售價(jià)格出現(xiàn)“倒掛”,散養(yǎng)戶虧聲一片
    Alice臺(tái)風(fēng)對(duì)東海鮐魚魚卵仔魚的輸運(yùn)和存活率的影響
    99精国产麻豆久久婷婷| 日本wwww免费看| 国产亚洲最大av| 性色avwww在线观看| 婷婷色av中文字幕| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲在久久综合| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲综合色网址| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲精品中文字幕在线视频| 深夜精品福利| 观看av在线不卡| 欧美中文综合在线视频| 国产成人aa在线观看| 国产日韩欧美在线精品| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美bdsm另类| 高清不卡的av网站| 老熟女久久久| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲国产av影院在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 熟女av电影| 中文天堂在线官网| 久久久精品94久久精品| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 免费av中文字幕在线| 亚洲,欧美精品.| 久久久久久久久久人人人人人人| 最新中文字幕久久久久| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 成年av动漫网址| 99re6热这里在线精品视频| 欧美激情高清一区二区三区 | 日韩精品有码人妻一区| 国产成人免费无遮挡视频| 国产日韩欧美视频二区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 咕卡用的链子| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久久久国产网址| 丝袜人妻中文字幕| 久久久精品94久久精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 91成人精品电影| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产精品一国产av| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 一二三四在线观看免费中文在| 高清在线视频一区二区三区| 美女高潮到喷水免费观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 中国国产av一级| 曰老女人黄片| 赤兔流量卡办理| 交换朋友夫妻互换小说| av天堂久久9| 下体分泌物呈黄色| 精品一区二区三卡| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲国产精品一区三区| 免费看av在线观看网站| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美日韩精品成人综合77777| 观看美女的网站| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 18+在线观看网站| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产精品三级大全| 免费黄色在线免费观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲三级黄色毛片| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产97色在线日韩免费| 丝袜脚勾引网站| 日韩电影二区| 中文天堂在线官网| 久久久久久久久免费视频了| 国产精品蜜桃在线观看| 人体艺术视频欧美日本| av网站在线播放免费| 久久久久网色| 18+在线观看网站| 最新的欧美精品一区二区| 各种免费的搞黄视频| 性色avwww在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲av日韩在线播放| 国产成人精品婷婷| 欧美成人午夜精品| 色94色欧美一区二区| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲欧美清纯卡通| 久久狼人影院| 免费高清在线观看视频在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲伊人色综图| 熟女电影av网| 日韩av免费高清视频| 国产 精品1| 国产成人午夜福利电影在线观看| 超色免费av| 黄片播放在线免费| 高清在线视频一区二区三区| 老鸭窝网址在线观看| 在线观看三级黄色| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 免费在线观看完整版高清| 久久亚洲国产成人精品v| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产爽快片一区二区三区| 国产成人精品在线电影| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产精品久久久久成人av| 免费少妇av软件| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 人人澡人人妻人| 美女视频免费永久观看网站| 成人亚洲欧美一区二区av| av又黄又爽大尺度在线免费看| 下体分泌物呈黄色| 久久亚洲国产成人精品v| 哪个播放器可以免费观看大片| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美激情高清一区二区三区 | 曰老女人黄片| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 亚洲综合精品二区| 美女中出高潮动态图| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久午夜综合久久蜜桃| 老熟女久久久| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产精品av久久久久免费| 久久久久视频综合| 国产乱来视频区| 国产探花极品一区二区| 久久久久久伊人网av| 久久久久网色| 免费大片黄手机在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 日本欧美国产在线视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美日韩一级在线毛片| 色婷婷久久久亚洲欧美| 1024香蕉在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产在视频线精品| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久久久网色| 黄色一级大片看看| 国产亚洲欧美精品永久| 国产乱来视频区| 成人免费观看视频高清| 在线观看三级黄色| 久久久久久人人人人人| 男女免费视频国产| 最近中文字幕高清免费大全6| videos熟女内射| 欧美精品一区二区大全| 国产av国产精品国产| 老女人水多毛片| 伊人亚洲综合成人网| 综合色丁香网| 在线观看一区二区三区激情| freevideosex欧美| av卡一久久| 在线观看一区二区三区激情| 成人黄色视频免费在线看| videossex国产| 美女午夜性视频免费| 一区二区三区精品91| 男男h啪啪无遮挡| 国产日韩欧美在线精品| 日韩伦理黄色片| 一本大道久久a久久精品| 另类亚洲欧美激情| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 色婷婷久久久亚洲欧美| 美女高潮到喷水免费观看| 国产精品人妻久久久影院| 韩国av在线不卡| 久久精品人人爽人人爽视色| 在线观看国产h片| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产黄色免费在线视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 丝袜喷水一区| 日韩中字成人| 2021少妇久久久久久久久久久| 久久久欧美国产精品| 国产极品粉嫩免费观看在线| 最近的中文字幕免费完整| 久久久久国产网址| 91久久精品国产一区二区三区| 免费黄网站久久成人精品| 欧美xxⅹ黑人| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 免费少妇av软件| 成人手机av| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 最新中文字幕久久久久| 麻豆乱淫一区二区| 午夜福利在线免费观看网站| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲人成电影观看| 在线 av 中文字幕| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久影院123| 91成人精品电影| 国产精品成人在线| av电影中文网址| 18禁国产床啪视频网站| 日韩中文字幕视频在线看片| 中文字幕制服av| 国产成人精品无人区| 亚洲精品久久午夜乱码| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 69精品国产乱码久久久| 777久久人妻少妇嫩草av网站| www.av在线官网国产| 亚洲内射少妇av| 午夜精品国产一区二区电影| 男女下面插进去视频免费观看| 久久久久久久精品精品| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 美女视频免费永久观看网站| 日韩av在线免费看完整版不卡| 丰满少妇做爰视频| 久久久久国产网址| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 精品亚洲成a人片在线观看| 只有这里有精品99| 亚洲国产色片| 国产av精品麻豆| 久久热在线av| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久午夜福利片| 国产又色又爽无遮挡免| 中文字幕色久视频| 99久久人妻综合| 视频在线观看一区二区三区| 久久久久网色| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 国产色婷婷99| av片东京热男人的天堂| 久久久久久久国产电影| 在线观看免费日韩欧美大片| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲成人av在线免费| 我的亚洲天堂| 国产成人午夜福利电影在线观看| www.精华液| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日韩av免费高清视频| 乱人伦中国视频| 91国产中文字幕| 超碰成人久久| 人体艺术视频欧美日本| 丝袜美足系列| 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品免费大片| 亚洲欧美色中文字幕在线| 26uuu在线亚洲综合色| 最近2019中文字幕mv第一页| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 1024香蕉在线观看| 男女国产视频网站| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产一区二区在线观看av| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 免费观看av网站的网址| 午夜老司机福利剧场| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | a级毛片黄视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 男女高潮啪啪啪动态图| 欧美在线黄色| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 免费看av在线观看网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 在线 av 中文字幕| 亚洲欧美精品自产自拍| 精品久久久精品久久久| av有码第一页| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲人成网站在线观看播放| 日韩av免费高清视频| 国产野战对白在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲av综合色区一区| 精品福利永久在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 成人亚洲精品一区在线观看| 看免费av毛片| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 各种免费的搞黄视频| 亚洲图色成人| 国产精品无大码| 亚洲欧美一区二区三区国产| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲经典国产精华液单| 久久韩国三级中文字幕| av有码第一页| av在线播放精品| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久久精品94久久精品| 日韩电影二区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲av在线观看美女高潮| 美女主播在线视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久99精品国语久久久| 久久人人爽人人片av| 中文天堂在线官网| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲人成77777在线视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久这里有精品视频免费| 国产一区亚洲一区在线观看| videos熟女内射| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 黄色 视频免费看| 交换朋友夫妻互换小说| 欧美日韩精品网址| 一级片免费观看大全| 又黄又粗又硬又大视频| 国产av精品麻豆| 亚洲精品av麻豆狂野| 深夜精品福利| 国产成人av激情在线播放| 18+在线观看网站| 黑人猛操日本美女一级片| 欧美97在线视频| 色婷婷av一区二区三区视频| videos熟女内射| 亚洲综合色惰| 在线观看人妻少妇| 日韩三级伦理在线观看| 午夜影院在线不卡| 色吧在线观看| 少妇精品久久久久久久| 亚洲综合色网址| 国产日韩欧美在线精品| 日韩av免费高清视频| 日韩电影二区| 国产精品 欧美亚洲| 精品视频人人做人人爽| 国产成人精品婷婷| h视频一区二区三区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产精品国产av在线观看| 亚洲内射少妇av| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲成国产人片在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 最近最新中文字幕免费大全7| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲综合色惰| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲成国产人片在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 精品久久蜜臀av无| 精品视频人人做人人爽| 男女高潮啪啪啪动态图| 黄片小视频在线播放| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲在久久综合| 亚洲精品久久午夜乱码| 免费大片黄手机在线观看| av国产精品久久久久影院| 99国产精品免费福利视频| 搡老乐熟女国产| 18禁国产床啪视频网站| 日韩成人av中文字幕在线观看| 午夜福利,免费看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 不卡视频在线观看欧美| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲成色77777| 精品卡一卡二卡四卡免费| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久韩国三级中文字幕| 丝袜美腿诱惑在线| 五月天丁香电影| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产精品久久久久久精品电影小说| 中文天堂在线官网| 国产乱来视频区| 久久精品亚洲av国产电影网| 婷婷成人精品国产| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产亚洲精品第一综合不卡| 一边亲一边摸免费视频| a级片在线免费高清观看视频| 中国国产av一级| 人妻一区二区av| 日本爱情动作片www.在线观看| 大香蕉久久网| 午夜91福利影院| 色网站视频免费| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 日本免费在线观看一区| 久久久久网色| 国产精品国产三级专区第一集| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 男女啪啪激烈高潮av片| 性色av一级| 看非洲黑人一级黄片| 国产在线一区二区三区精| 精品一区二区免费观看| 欧美av亚洲av综合av国产av | 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品无大码| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲av男天堂| 国产又爽黄色视频| 伦理电影免费视频| 捣出白浆h1v1| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 成人毛片60女人毛片免费| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 伦理电影大哥的女人| 久久精品国产综合久久久| 久久人妻熟女aⅴ| 丝袜脚勾引网站| 欧美日韩成人在线一区二区| 丝袜在线中文字幕| 少妇人妻久久综合中文| 男人添女人高潮全过程视频| 青春草亚洲视频在线观看| 国产在线视频一区二区| videossex国产| 欧美xxⅹ黑人| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 性高湖久久久久久久久免费观看| 我要看黄色一级片免费的| 中文天堂在线官网| 另类精品久久| 亚洲国产av影院在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av | 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美亚洲日本最大视频资源| 搡女人真爽免费视频火全软件| 涩涩av久久男人的天堂| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 午夜福利,免费看| xxxhd国产人妻xxx| 最近中文字幕2019免费版| 在现免费观看毛片| 91国产中文字幕| 999久久久国产精品视频| 色吧在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 一区二区三区四区激情视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| av免费观看日本| 欧美成人午夜免费资源| 国产精品人妻久久久影院| 国产午夜精品一二区理论片| 久久 成人 亚洲| 99国产综合亚洲精品| 久久久久网色| 香蕉国产在线看| 国产深夜福利视频在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲久久久国产精品| 国产免费一区二区三区四区乱码| 精品福利永久在线观看| 国产一级毛片在线| 中国三级夫妇交换| 一区二区日韩欧美中文字幕| 精品第一国产精品| 老司机影院毛片| 久久久久网色| 国产 一区精品| 久久久久久人妻| 精品午夜福利在线看| 宅男免费午夜| 热re99久久国产66热| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲三区欧美一区| 国产麻豆69| 国产淫语在线视频| 午夜免费鲁丝| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 又大又黄又爽视频免费| 日韩视频在线欧美| 久久久久久久精品精品| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久久精品区二区三区| 一级毛片 在线播放| 蜜桃在线观看..| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产成人精品久久久久久| 亚洲精品成人av观看孕妇| 免费在线观看黄色视频的| 国产xxxxx性猛交| 国产成人av激情在线播放| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 女性被躁到高潮视频| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲欧美色中文字幕在线| 青青草视频在线视频观看| 欧美激情高清一区二区三区 | 亚洲在久久综合| 久久国内精品自在自线图片| 91国产中文字幕| 久久久a久久爽久久v久久| 成人漫画全彩无遮挡| 国产熟女欧美一区二区| 另类精品久久| 777米奇影视久久| 99re6热这里在线精品视频| av不卡在线播放| 欧美日韩视频精品一区| 男人添女人高潮全过程视频| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲av日韩在线播放| 晚上一个人看的免费电影| 国产亚洲欧美精品永久| 美女高潮到喷水免费观看| 午夜激情av网站| 一区二区av电影网| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 99九九在线精品视频| freevideosex欧美| 老女人水多毛片| 天堂8中文在线网| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲精品中文字幕在线视频| av网站在线播放免费| 大香蕉久久网| 久久久久国产精品人妻一区二区| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久亚洲国产成人精品v| 高清欧美精品videossex| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 免费少妇av软件| av在线播放精品| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 亚洲第一青青草原| 久久国内精品自在自线图片| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久这里有精品视频免费| 99九九在线精品视频| 91国产中文字幕| 国产免费又黄又爽又色| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 精品亚洲成国产av| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美精品一区二区大全| 乱人伦中国视频| 亚洲情色 制服丝袜| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲伊人久久精品综合| 午夜福利一区二区在线看| 校园人妻丝袜中文字幕| 老熟女久久久| 久久ye,这里只有精品| 久久人妻熟女aⅴ| 三上悠亚av全集在线观看| 各种免费的搞黄视频| 岛国毛片在线播放| 欧美人与性动交α欧美软件| 精品国产乱码久久久久久小说| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 激情视频va一区二区三区| 大片电影免费在线观看免费| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 美女国产高潮福利片在线看| 国产精品偷伦视频观看了| 国产淫语在线视频| 久久久久久久久免费视频了| 中文天堂在线官网| 男女午夜视频在线观看| 夫妻午夜视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 国产精品久久久久久av不卡| av在线观看视频网站免费| 自线自在国产av| 青青草视频在线视频观看| 母亲3免费完整高清在线观看 | 久久女婷五月综合色啪小说|