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    山豆根根瘤菌的生物學(xué)特性及其不同菌株對(duì)山豆根幼苗藥用有效成分的影響

    2017-02-27 11:12:35唐美瓊閔丹丹李剛
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:有效成分山豆根根瘤菌

    唐美瓊+閔丹丹+李剛

    摘要:對(duì)采自廣西不同地點(diǎn)的山豆根根瘤菌進(jìn)行生物學(xué)特性研究,并將其分別接種在盆栽山豆根幼苗上,室內(nèi)培養(yǎng)180 d后,測(cè)定植株藥用有效成分苦參堿、氧化苦參堿含量。結(jié)果表明,山豆根根瘤菌為快生型根瘤菌,在YMA培養(yǎng)基上代謝產(chǎn)酸,大部分菌株的生長(zhǎng)溫度范圍為25~35 ℃,酸堿耐受范圍為pH值6.0~10.0,對(duì)抗生素卡那霉素(Km)、慶大霉素(Gm)敏感;不同來(lái)源的根瘤菌對(duì)山豆根藥用有效成分積累的影響不同,與其他菌株相比,來(lái)自靖西縣的2株菌JX2、JX3對(duì)苦參堿、氧化苦參堿的影響達(dá)到了顯著水平。

    關(guān)鍵詞:山豆根;根瘤菌;生物學(xué)特性;有效成分

    中圖分類號(hào): S567.21+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2017)01-0131-04

    山豆根為豆科植物越南槐(Sophora tonkinensis Gagnep.)的干燥根和根莖,主產(chǎn)于廣西,別稱廣豆根。山豆根具有清火解毒、消腫止痛等功效[1],其有效成分以苦參堿、氧化苦參堿為主[2],具有抗炎、抗心律失常、抗腫瘤等生物活性[3]。野生山豆根分布地域狹窄,零星生長(zhǎng)于石山區(qū)石縫中,野生資源已瀕臨枯竭[4]。近年來(lái),科技人員已經(jīng)對(duì)山豆根的人工繁殖栽培進(jìn)行研究,并取得了一定的成果[5-6]。在山豆根的栽培生產(chǎn)中,如果能利用豆科植物與根瘤菌的共生固氮效應(yīng)滿足植物對(duì)氮素的需求,對(duì)提高藥材的質(zhì)量及發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)、保護(hù)生態(tài)環(huán)境都有重要意義。但是目前關(guān)于豆科藥材的生物固氮及其結(jié)瘤固氮對(duì)藥材質(zhì)量影響等相關(guān)研究甚少,對(duì)山豆根的研究更是罕見。本試驗(yàn)從研究山豆根根瘤菌生物學(xué)特性入手,進(jìn)一步研究根瘤菌對(duì)山豆根幼苗有效成分積累的影響,以期為開發(fā)利用山豆根根瘤菌資源、提高山豆根原料藥材的質(zhì)量提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 根瘤菌的采集及分離純化

    分別在廣西藥用植物園、隆安縣、靖西縣栽培的山豆根系上采集新鮮、飽滿、個(gè)大的根瘤,放入裝有無(wú)水氯化鈣的具塞試管內(nèi),帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離純化。用自來(lái)水將采集的根瘤沖洗干凈,在無(wú)菌條件下,用95%乙醇浸泡1 min后用無(wú)菌水沖洗3次,用0.1%氯化汞浸泡3 min后再用無(wú)菌水沖洗4次,然后置于滅菌的研缽中,用無(wú)菌玻棒擠壓、破碎根瘤,取汁液在加有0.025 g/L剛果紅的YMA平板上劃線,28 ℃恒溫培養(yǎng)至菌落出現(xiàn),挑選典型單菌落進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng),獲得根瘤菌菌株YY、LA1、LA2、JX2、JX3(表1)。

    1.2 生長(zhǎng)特性測(cè)定

    革蘭氏染色參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》,按常規(guī)方法進(jìn)行[7]。生長(zhǎng)曲線測(cè)定:將根瘤菌接種到Y(jié)MA液體培養(yǎng)基中,接種后每隔4h用紫外-可見分光光度計(jì)在600 mn波長(zhǎng)處測(cè)定各參試菌株培養(yǎng)液的吸光度,以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。溴麝香草酚藍(lán)(BTB)反應(yīng):將菌種接種于含0.1%溴麝香草酚藍(lán)的YMA培養(yǎng)基上,于 28 ℃ 培養(yǎng)6~10 d,觀察顏色變化。

    1.3 生理生化特性測(cè)定

    以YMA液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。溫度試驗(yàn)設(shè)置共設(shè)8個(gè)單一溫度和1個(gè)耐高溫處理,單一溫度分別設(shè)為4、10、15、20、25、30、35、40 ℃,耐高溫處理先于60 ℃處理10 min,再置于28 ℃搖床中培養(yǎng)5 d。酸堿度影響試驗(yàn):分別設(shè)置pH值為4、5、6、7、8、9、10、11、12,共9個(gè)梯度。耐鹽性試驗(yàn):分別設(shè)置NaCl終濃度為0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%,共5個(gè)梯度??股乜剐栽囼?yàn):添加不同濃度氨芐青霉素(Amp)、氯霉素(Cm)、卡那霉素(Km)、慶大霉素(Gm)、大觀霉素(Spec)、鏈霉素(Sm)、羧芐青霉素(Cb)、萘定酮酸(Nm)、四環(huán)素(Tc)至YMA液體培養(yǎng)基中。碳源、氮源利用試驗(yàn):以去掉碳源的White培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別加入各種碳源或氮源,使終濃度為1%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)),調(diào)節(jié)pH值至7.0。滅菌后接入供試菌株,以YMA液體培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照,以不加任何碳源的培養(yǎng)基為陰性對(duì)照,于28 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)5 d后,顯微鏡下檢測(cè)根瘤菌的生長(zhǎng)狀況。 以上試驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)。

    1.4 回接試驗(yàn)

    培養(yǎng)基質(zhì)為按1 ∶1體積混合的水洗河沙、蛭石,121 ℃高壓滅菌1 h。山豆根種子來(lái)自廣西藥用植物園科研基地。先將山豆根種子在60 ℃左右熱水中浸泡,并讓其自然冷卻,吸脹后分別用75%乙醇、0.1%氯化汞進(jìn)行表面消毒,在無(wú)菌的水洗河沙中,于28 ℃培養(yǎng)至發(fā)芽,選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株移栽至花盆中,花盆用5%高錳酸鉀浸泡5~6 h后清洗干凈。

    將供試菌株分別接種到山豆根幼苗根系上作為接種處理,以不接種根瘤菌為對(duì)照處理(CK),共6個(gè)處理,每個(gè)處理種植3盆,每盆15株。接種方法:移栽山豆根幼苗后,用移液槍吸取相應(yīng)的根瘤菌菌液2 mL,注于幼苗根系周圍,CK處理用等量的無(wú)菌水代替。將植株置于日—夜溫度周期 28 ℃—22 ℃、光照度3 000 lx的無(wú)菌光照培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。用Fahraeus無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)元素、水分。培養(yǎng)180 d 后取出植株清洗,統(tǒng)計(jì)山豆根幼苗根瘤數(shù)量。

    1.5 苦參堿與氧化苦參堿的含量測(cè)定

    測(cè)定方法參照2010年《中華人民共和國(guó)藥典》(簡(jiǎn)稱《藥典》)[8]。以苦參堿、氧化苦參堿對(duì)照品作為試驗(yàn)對(duì)照,按照《藥典》中山豆根測(cè)定的方法制備供試液。稱取山豆根藥材 0.5 g,精確加入20mL混合溶液(三氯甲烷 ∶甲醇 ∶濃氨水體積比為40 ∶10 ∶1)密塞,稱質(zhì)量,放置30 min,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min;再次稱質(zhì)量后用混合溶液補(bǔ)足質(zhì)量,搖勻,過濾,精確量取續(xù)濾液10 mL,40 ℃減壓回收(使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀)至溶劑全部揮盡,在殘?jiān)屑尤脒m量甲醇(色譜純)溶解,轉(zhuǎn)移至容量瓶中,用甲醇定容至10 mL,搖勻,用0.22 μm微孔濾膜過濾。另取適量苦參堿、氧化苦參堿對(duì)照品,加入液相流動(dòng)相(乙腈 ∶異丙醇 ∶3%磷酸溶液體積比為80 ∶5 ∶15),使苦參堿含量為20 μg/mL,氧化苦參堿含量為150 μg/mL。儀器:高效液相色譜儀 Varian JC2X058;色譜柱:Phenomenex Luna 5 μ NH2 100 A,150 mm×4.6 mm;柱溫:25 ℃;流動(dòng)相:乙腈 ∶異丙醇 ∶3%磷酸溶液體積比為 80 ∶5 ∶15;檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;液相時(shí)間16 min。

    1.6 數(shù)據(jù)處理方法

    采用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 山豆根根瘤菌的生長(zhǎng)特性

    山豆根根瘤菌在YMA平板上于28 ℃培養(yǎng)3~5 d能形成良好的典型菌落,其菌落呈圓形,透明黏稠,表面光滑,有光澤,邊緣整齊,中心稍有突起。按菌落大小可分為2種類型,其中YY、LA2、JX3菌落直徑為0.6~0.8 cm,LA1、JX2菌落直徑為0.2~0.4 cm。BTB反應(yīng)表明,參試的山豆根菌株代謝產(chǎn)酸;革蘭氏染色均為陰性。生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果表明:各菌株在培養(yǎng)0~4 h為遲緩期,4~24 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,24 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期(圖1)。由此可見,本研究分離到的根瘤菌具有快生型根瘤菌的一般特征[9],初步判定它為快生型根瘤菌。

    2.2 山豆根根瘤菌的生理生化特性

    2.2.1 溫度對(duì)山豆根根瘤菌生長(zhǎng)的影響 山豆根根瘤菌對(duì)不同溫度的反應(yīng)較為一致,對(duì)低溫的忍耐能力較差,在30 ℃左右生長(zhǎng)良好。各菌株對(duì)異常溫度的耐受性有一定的差異,來(lái)自同一產(chǎn)地的不同根瘤菌株對(duì)高溫的耐受性也存在著差異,其中YY、LA1、JX2能耐受短時(shí)60 ℃的高溫(表2)。

    2.2.2 pH值對(duì)山豆根根瘤菌生長(zhǎng)的影響 一般過酸、過堿的環(huán)境條件不利于根瘤菌的生長(zhǎng),山豆根根瘤菌對(duì)酸堿的反應(yīng)較為一致,在pH值為 6.0~10.0時(shí)均能生長(zhǎng),其中LA1、JX2、JX3在pH 值為11的條件下仍能生長(zhǎng)(表3)。由試驗(yàn)結(jié)果可知,山豆根根瘤菌對(duì)酸性環(huán)境較為敏感,pH值低于6.0時(shí)菌株不能再生長(zhǎng),但具有較豐富的耐堿種質(zhì)資源。

    2.2.3 NaCl含量對(duì)山豆根根瘤菌生長(zhǎng)的影響 表4表明,山豆根根瘤菌在無(wú)鹽條件下能生長(zhǎng),隨著NaCl含量的增加,菌株生長(zhǎng)受到抑制,當(dāng)NaCl含量達(dá)到1%及以上時(shí),菌株不能生長(zhǎng)。

    2.2.4 山豆根根瘤菌對(duì)幾種抗生素的耐受性 對(duì)抗生素的敏感性是根瘤菌的重要生理生化特性,可以作為分類的指標(biāo)之一。表5表明,山豆根根瘤菌株對(duì)Km、Gm的耐受性最差,在低含量(5 μg/mL)下均不能生長(zhǎng);對(duì)Cb表現(xiàn)出抗性,在較高含量(300 μg/mL)下仍能夠生長(zhǎng);在100 μg/mL Cm、10 μg/mL Nm中都能夠生長(zhǎng)。此外,菌株間對(duì)不同抗生素或同一抗生素不同濃度的抗性差異較大,即使是來(lái)自同一地域的菌株之間也有部分差異。如來(lái)自靖西縣的菌JX2、JX3對(duì)Amp敏感,相反另外2株來(lái)自隆安縣的LA1、LA2對(duì)Amp(600 μg/mL)表現(xiàn)出抗性,而分離自廣西藥用植物園的YY菌株能忍耐100 μg/mL Amp。

    2.2.5 碳源和氮源利用 根瘤菌一般能較好地利用單糖和雙糖,而快生型根瘤菌能利用麥芽糖、乳糖、蔗糖等雙糖[10]。由表6可知,山豆根根瘤菌均能利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖、果糖、乳糖,但不能利用乙酸鈉、甘氨酸和肌醇。

    本試驗(yàn)檢測(cè)了供試菌株對(duì)5種氮源的利用情況,由表6可見,所有的菌株都能利用蛋白胨和硫酸銨;所有菌株均不能利用半胱氨酸;除YY外,其余菌株均能利用硝酸鉀,而且YY、LA1不能利用甘氨酸,說明大部分供試根瘤菌可以利用無(wú)機(jī)氮源作為其生長(zhǎng)所需氮源。試驗(yàn)結(jié)果表明,來(lái)源不同的山豆根根瘤菌對(duì)供試碳源、氮源的利用能力比較一致。

    2.3 根瘤菌對(duì)山豆根幼苗有效成分的影響

    接種根瘤菌能使山豆根幼苗結(jié)瘤,不同根瘤菌處理的植株苦參堿和氧化苦參堿含量是不同的。接種根瘤菌的處理,其苦參堿、氧化苦參堿含量均比對(duì)照有所增加,其中接種來(lái)自靖西縣菌株的植株含量顯著高于對(duì)照及其他大部分處理(表7)。由結(jié)果可見,接種根瘤菌有利于根瘤形成,再通過根瘤進(jìn)行生物固氮來(lái)積累氮素,從而促進(jìn)植株有效成分的積累。

    3 討論

    藥材原料質(zhì)量是藥材生產(chǎn)中亟待解決的問題,許多學(xué)者也在探索解決、評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的方法[11-12]。山豆根人工馴化獲得成功之后,人們總結(jié)了山豆根人工栽培的一些技術(shù)措施[5-6],但是在栽培生產(chǎn)中,藥農(nóng)為了追求產(chǎn)量而多施重施氮肥,造成病蟲害加重、農(nóng)藥殘留量升高、硝酸鹽含量超標(biāo)等問題,嚴(yán)重影響藥材質(zhì)量,這是目前山豆根可持續(xù)生產(chǎn)中不可忽視的問題。生物固氮是豆科植物的一個(gè)重要特性,通過生物固氮可以利用自然界的N2改善植株的氮素營(yíng)養(yǎng)狀況,從而避免盲目施氮肥造成對(duì)山豆根等豆科藥材質(zhì)量的不良影響。因此,篩選出具有優(yōu)良特性的土著根瘤菌菌株對(duì)進(jìn)一步在生產(chǎn)上進(jìn)行接種應(yīng)用是十分有利的。本試驗(yàn)從山豆根根瘤中獲得5株根瘤菌,它們均具有快生型根瘤菌生長(zhǎng)特征和生理生化特征。

    楊亞珍等發(fā)現(xiàn),不同地理來(lái)源、同一地理來(lái)源、甚至同一植株不同甘草根瘤菌菌株在個(gè)別指標(biāo)方面存在差異[13];黃榮韶等發(fā)現(xiàn),不同生態(tài)環(huán)境下采集的雞骨草根瘤菌在生物學(xué)特性方面具有較大的差異[14]。本試驗(yàn)結(jié)果與這些研究有相似之處,即來(lái)源相同或來(lái)源不同的山豆根根瘤菌在對(duì)高溫忍耐能力、酸堿環(huán)境的適應(yīng)性、抗生素的敏感性等方面存在差異,但對(duì)酸堿環(huán)境的適應(yīng)性及碳源的利用能力比較一致,推測(cè)這可能與不同的菌株含有的一些特殊基因有關(guān)。通過回接試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),人工接種根瘤菌明顯促進(jìn)山豆根根瘤的形成,植株的有效成分含量大幅度提高,其原因可能是生物堿是含氮化合物,氮素的供給利用在山豆根生物堿的生物合成和積累中起重要作用。但是不同來(lái)源的山豆根菌株之間對(duì)有效成分積累的影響不同,這是否與采集地的生態(tài)環(huán)境有關(guān),尚待進(jìn)一步研究。

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