山豆根根瘤菌的生物學(xué)特性及其不同菌株對(duì)山豆根幼苗藥用有效成分的影響

唐美瓊+閔丹丹+李剛

摘要：對(duì)采自廣西不同地點(diǎn)的山豆根根瘤菌進(jìn)行生物學(xué)特性研究，并將其分別接種在盆栽山豆根幼苗上，室內(nèi)培養(yǎng)180 d后，測(cè)定植株藥用有效成分苦參堿、氧化苦參堿含量。結(jié)果表明，山豆根根瘤菌為快生型根瘤菌，在YMA培養(yǎng)基上代謝產(chǎn)酸，大部分菌株的生長(zhǎng)溫度范圍為25～35 ℃，酸堿耐受范圍為pH值6.0～10.0，對(duì)抗生素卡那霉素（Km）、慶大霉素（Gm）敏感；不同來(lái)源的根瘤菌對(duì)山豆根藥用有效成分積累的影響不同，與其他菌株相比，來(lái)自靖西縣的2株菌JX2、JX3對(duì)苦參堿、氧化苦參堿的影響達(dá)到了顯著水平。

關(guān)鍵詞：山豆根；根瘤菌；生物學(xué)特性；有效成分

中圖分類號(hào)： S567.21+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）01-0131-04

山豆根為豆科植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep.）的干燥根和根莖，主產(chǎn)于廣西，別稱廣豆根。山豆根具有清火解毒、消腫止痛等功效[1]，其有效成分以苦參堿、氧化苦參堿為主[2]，具有抗炎、抗心律失常、抗腫瘤等生物活性[3]。野生山豆根分布地域狹窄，零星生長(zhǎng)于石山區(qū)石縫中，野生資源已瀕臨枯竭[4]。近年來(lái)，科技人員已經(jīng)對(duì)山豆根的人工繁殖栽培進(jìn)行研究，并取得了一定的成果[5-6]。在山豆根的栽培生產(chǎn)中，如果能利用豆科植物與根瘤菌的共生固氮效應(yīng)滿足植物對(duì)氮素的需求，對(duì)提高藥材的質(zhì)量及發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)、保護(hù)生態(tài)環(huán)境都有重要意義。但是目前關(guān)于豆科藥材的生物固氮及其結(jié)瘤固氮對(duì)藥材質(zhì)量影響等相關(guān)研究甚少，對(duì)山豆根的研究更是罕見。本試驗(yàn)從研究山豆根根瘤菌生物學(xué)特性入手，進(jìn)一步研究根瘤菌對(duì)山豆根幼苗有效成分積累的影響，以期為開發(fā)利用山豆根根瘤菌資源、提高山豆根原料藥材的質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 根瘤菌的采集及分離純化

分別在廣西藥用植物園、隆安縣、靖西縣栽培的山豆根系上采集新鮮、飽滿、個(gè)大的根瘤，放入裝有無(wú)水氯化鈣的具塞試管內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離純化。用自來(lái)水將采集的根瘤沖洗干凈，在無(wú)菌條件下，用95%乙醇浸泡1 min后用無(wú)菌水沖洗3次，用0.1%氯化汞浸泡3 min后再用無(wú)菌水沖洗4次，然后置于滅菌的研缽中，用無(wú)菌玻棒擠壓、破碎根瘤，取汁液在加有0.025 g/L剛果紅的YMA平板上劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)，挑選典型單菌落進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，獲得根瘤菌菌株YY、LA1、LA2、JX2、JX3（表1）。

1.2 生長(zhǎng)特性測(cè)定

革蘭氏染色參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，按常規(guī)方法進(jìn)行[7]。生長(zhǎng)曲線測(cè)定：將根瘤菌接種到Y(jié)MA液體培養(yǎng)基中，接種后每隔4h用紫外-可見分光光度計(jì)在600 mn波長(zhǎng)處測(cè)定各參試菌株培養(yǎng)液的吸光度，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。溴麝香草酚藍(lán)（BTB）反應(yīng)：將菌種接種于含0.1%溴麝香草酚藍(lán)的YMA培養(yǎng)基上，于 28 ℃ 培養(yǎng)6～10 d，觀察顏色變化。

1.3 生理生化特性測(cè)定

以YMA液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。溫度試驗(yàn)設(shè)置共設(shè)8個(gè)單一溫度和1個(gè)耐高溫處理，單一溫度分別設(shè)為4、10、15、20、25、30、35、40 ℃，耐高溫處理先于60 ℃處理10 min，再置于28 ℃搖床中培養(yǎng)5 d。酸堿度影響試驗(yàn)：分別設(shè)置pH值為4、5、6、7、8、9、10、11、12，共9個(gè)梯度。耐鹽性試驗(yàn)：分別設(shè)置NaCl終濃度為0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%，共5個(gè)梯度?？股乜剐栽囼?yàn)：添加不同濃度氨芐青霉素（Amp）、氯霉素（Cm）、卡那霉素（Km）、慶大霉素（Gm）、大觀霉素（Spec）、鏈霉素（Sm）、羧芐青霉素（Cb）、萘定酮酸（Nm）、四環(huán)素（Tc）至YMA液體培養(yǎng)基中。碳源、氮源利用試驗(yàn)：以去掉碳源的White培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入各種碳源或氮源，使終濃度為1%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)），調(diào)節(jié)pH值至7.0。滅菌后接入供試菌株，以YMA液體培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照，以不加任何碳源的培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，于28 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)5 d后，顯微鏡下檢測(cè)根瘤菌的生長(zhǎng)狀況。 以上試驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)。

1.4 回接試驗(yàn)

培養(yǎng)基質(zhì)為按1 ∶1體積混合的水洗河沙、蛭石，121 ℃高壓滅菌1 h。山豆根種子來(lái)自廣西藥用植物園科研基地。先將山豆根種子在60 ℃左右熱水中浸泡，并讓其自然冷卻，吸脹后分別用75%乙醇、0.1%氯化汞進(jìn)行表面消毒，在無(wú)菌的水洗河沙中，于28 ℃培養(yǎng)至發(fā)芽，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株移栽至花盆中，花盆用5%高錳酸鉀浸泡5～6 h后清洗干凈。

將供試菌株分別接種到山豆根幼苗根系上作為接種處理，以不接種根瘤菌為對(duì)照處理（CK），共6個(gè)處理，每個(gè)處理種植3盆，每盆15株。接種方法：移栽山豆根幼苗后，用移液槍吸取相應(yīng)的根瘤菌菌液2 mL，注于幼苗根系周圍，CK處理用等量的無(wú)菌水代替。將植株置于日—夜溫度周期 28 ℃—22 ℃、光照度3 000 lx的無(wú)菌光照培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。用Fahraeus無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)元素、水分。培養(yǎng)180 d 后取出植株清洗，統(tǒng)計(jì)山豆根幼苗根瘤數(shù)量。

1.5 苦參堿與氧化苦參堿的含量測(cè)定

測(cè)定方法參照2010年《中華人民共和國(guó)藥典》（簡(jiǎn)稱《藥典》）[8]。以苦參堿、氧化苦參堿對(duì)照品作為試驗(yàn)對(duì)照，按照《藥典》中山豆根測(cè)定的方法制備供試液。稱取山豆根藥材 0.5 g，精確加入20mL混合溶液（三氯甲烷 ∶甲醇 ∶濃氨水體積比為40 ∶10 ∶1）密塞，稱質(zhì)量，放置30 min，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min；再次稱質(zhì)量后用混合溶液補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，過濾，精確量取續(xù)濾液10 mL，40 ℃減壓回收（使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀）至溶劑全部揮盡，在殘?jiān)屑尤脒m量甲醇（色譜純）溶解，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾。另取適量苦參堿、氧化苦參堿對(duì)照品，加入液相流動(dòng)相（乙腈 ∶異丙醇 ∶3%磷酸溶液體積比為80 ∶5 ∶15），使苦參堿含量為20 μg/mL，氧化苦參堿含量為150 μg/mL。儀器：高效液相色譜儀 Varian JC2X058；色譜柱：Phenomenex Luna 5 μ NH2 100 A，150 mm×4.6 mm；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相：乙腈 ∶異丙醇 ∶3%磷酸溶液體積比為 80 ∶5 ∶15；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；液相時(shí)間16 min。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山豆根根瘤菌的生長(zhǎng)特性

山豆根根瘤菌在YMA平板上于28 ℃培養(yǎng)3～5 d能形成良好的典型菌落，其菌落呈圓形，透明黏稠，表面光滑，有光澤，邊緣整齊，中心稍有突起。按菌落大小可分為2種類型，其中YY、LA2、JX3菌落直徑為0.6～0.8 cm，LA1、JX2菌落直徑為0.2～0.4 cm。BTB反應(yīng)表明，參試的山豆根菌株代謝產(chǎn)酸；革蘭氏染色均為陰性。生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果表明：各菌株在培養(yǎng)0～4 h為遲緩期，4～24 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，24 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期（圖1）。由此可見，本研究分離到的根瘤菌具有快生型根瘤菌的一般特征[9]，初步判定它為快生型根瘤菌。

2.2 山豆根根瘤菌的生理生化特性

2.2.1 溫度對(duì)山豆根根瘤菌生長(zhǎng)的影響 山豆根根瘤菌對(duì)不同溫度的反應(yīng)較為一致，對(duì)低溫的忍耐能力較差，在30 ℃左右生長(zhǎng)良好。各菌株對(duì)異常溫度的耐受性有一定的差異，來(lái)自同一產(chǎn)地的不同根瘤菌株對(duì)高溫的耐受性也存在著差異，其中YY、LA1、JX2能耐受短時(shí)60 ℃的高溫（表2）。

2.2.2 pH值對(duì)山豆根根瘤菌生長(zhǎng)的影響 一般過酸、過堿的環(huán)境條件不利于根瘤菌的生長(zhǎng)，山豆根根瘤菌對(duì)酸堿的反應(yīng)較為一致，在pH值為 6.0～10.0時(shí)均能生長(zhǎng)，其中LA1、JX2、JX3在pH 值為11的條件下仍能生長(zhǎng)（表3）。由試驗(yàn)結(jié)果可知，山豆根根瘤菌對(duì)酸性環(huán)境較為敏感，pH值低于6.0時(shí)菌株不能再生長(zhǎng)，但具有較豐富的耐堿種質(zhì)資源。

2.2.3 NaCl含量對(duì)山豆根根瘤菌生長(zhǎng)的影響 表4表明，山豆根根瘤菌在無(wú)鹽條件下能生長(zhǎng)，隨著NaCl含量的增加，菌株生長(zhǎng)受到抑制，當(dāng)NaCl含量達(dá)到1%及以上時(shí)，菌株不能生長(zhǎng)。

2.2.4 山豆根根瘤菌對(duì)幾種抗生素的耐受性 對(duì)抗生素的敏感性是根瘤菌的重要生理生化特性，可以作為分類的指標(biāo)之一。表5表明，山豆根根瘤菌株對(duì)Km、Gm的耐受性最差，在低含量（5 μg/mL）下均不能生長(zhǎng)；對(duì)Cb表現(xiàn)出抗性，在較高含量（300 μg/mL）下仍能夠生長(zhǎng)；在100 μg/mL Cm、10 μg/mL Nm中都能夠生長(zhǎng)。此外，菌株間對(duì)不同抗生素或同一抗生素不同濃度的抗性差異較大，即使是來(lái)自同一地域的菌株之間也有部分差異。如來(lái)自靖西縣的菌JX2、JX3對(duì)Amp敏感，相反另外2株來(lái)自隆安縣的LA1、LA2對(duì)Amp（600 μg/mL）表現(xiàn)出抗性，而分離自廣西藥用植物園的YY菌株能忍耐100 μg/mL Amp。

2.2.5 碳源和氮源利用 根瘤菌一般能較好地利用單糖和雙糖，而快生型根瘤菌能利用麥芽糖、乳糖、蔗糖等雙糖[10]。由表6可知，山豆根根瘤菌均能利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖、果糖、乳糖，但不能利用乙酸鈉、甘氨酸和肌醇。

本試驗(yàn)檢測(cè)了供試菌株對(duì)5種氮源的利用情況，由表6可見，所有的菌株都能利用蛋白胨和硫酸銨；所有菌株均不能利用半胱氨酸；除YY外，其余菌株均能利用硝酸鉀，而且YY、LA1不能利用甘氨酸，說明大部分供試根瘤菌可以利用無(wú)機(jī)氮源作為其生長(zhǎng)所需氮源。試驗(yàn)結(jié)果表明，來(lái)源不同的山豆根根瘤菌對(duì)供試碳源、氮源的利用能力比較一致。

2.3 根瘤菌對(duì)山豆根幼苗有效成分的影響

接種根瘤菌能使山豆根幼苗結(jié)瘤，不同根瘤菌處理的植株苦參堿和氧化苦參堿含量是不同的。接種根瘤菌的處理，其苦參堿、氧化苦參堿含量均比對(duì)照有所增加，其中接種來(lái)自靖西縣菌株的植株含量顯著高于對(duì)照及其他大部分處理（表7）。由結(jié)果可見，接種根瘤菌有利于根瘤形成，再通過根瘤進(jìn)行生物固氮來(lái)積累氮素，從而促進(jìn)植株有效成分的積累。

3 討論

藥材原料質(zhì)量是藥材生產(chǎn)中亟待解決的問題，許多學(xué)者也在探索解決、評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的方法[11-12]。山豆根人工馴化獲得成功之后，人們總結(jié)了山豆根人工栽培的一些技術(shù)措施[5-6]，但是在栽培生產(chǎn)中，藥農(nóng)為了追求產(chǎn)量而多施重施氮肥，造成病蟲害加重、農(nóng)藥殘留量升高、硝酸鹽含量超標(biāo)等問題，嚴(yán)重影響藥材質(zhì)量，這是目前山豆根可持續(xù)生產(chǎn)中不可忽視的問題。生物固氮是豆科植物的一個(gè)重要特性，通過生物固氮可以利用自然界的N2改善植株的氮素營(yíng)養(yǎng)狀況，從而避免盲目施氮肥造成對(duì)山豆根等豆科藥材質(zhì)量的不良影響。因此，篩選出具有優(yōu)良特性的土著根瘤菌菌株對(duì)進(jìn)一步在生產(chǎn)上進(jìn)行接種應(yīng)用是十分有利的。本試驗(yàn)從山豆根根瘤中獲得5株根瘤菌，它們均具有快生型根瘤菌生長(zhǎng)特征和生理生化特征。

楊亞珍等發(fā)現(xiàn)，不同地理來(lái)源、同一地理來(lái)源、甚至同一植株不同甘草根瘤菌菌株在個(gè)別指標(biāo)方面存在差異[13]；黃榮韶等發(fā)現(xiàn)，不同生態(tài)環(huán)境下采集的雞骨草根瘤菌在生物學(xué)特性方面具有較大的差異[14]。本試驗(yàn)結(jié)果與這些研究有相似之處，即來(lái)源相同或來(lái)源不同的山豆根根瘤菌在對(duì)高溫忍耐能力、酸堿環(huán)境的適應(yīng)性、抗生素的敏感性等方面存在差異，但對(duì)酸堿環(huán)境的適應(yīng)性及碳源的利用能力比較一致，推測(cè)這可能與不同的菌株含有的一些特殊基因有關(guān)。通過回接試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人工接種根瘤菌明顯促進(jìn)山豆根根瘤的形成，植株的有效成分含量大幅度提高，其原因可能是生物堿是含氮化合物，氮素的供給利用在山豆根生物堿的生物合成和積累中起重要作用。但是不同來(lái)源的山豆根菌株之間對(duì)有效成分積累的影響不同，這是否與采集地的生態(tài)環(huán)境有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究。

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