高山石斛再生體系的建立

王一諾+黃雪彥+李磊

摘要：以高山石斛（Dendrobium infundibulum Lindl.）成熟種子為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，研究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素對(duì)高山石斛組織培養(yǎng)過(guò)程中繼代增殖和生根的影響。結(jié)果表明，高山石斛最佳的啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L；繼代增殖中，6-BA、NAA、KT等激素的配合使用具有較好的效果，利于繼代增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+活性炭1.0 g/L；最佳的生根壯苗培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+香蕉汁10%，此時(shí)苗的根系長(zhǎng)而粗壯，芽苗葉色翠綠，平均根長(zhǎng)2.79 cm，生根率達(dá)到92%。

關(guān)鍵詞：高山石斛；6-BA；NAA；KT；組織培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)基；生根培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)： S567.23+9.043 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）01-0050-02

高山石斛（Dendrobium infundibulum Lindl.）產(chǎn)于云南南部，系蘭科石斛屬多年生草本植物，生于海拔約2 000 m的密林中樹(shù)干上，喜溫暖、潮濕環(huán)境[1]。高山石斛被譽(yù)為“四大觀賞洋花”之一，具有極高的觀賞價(jià)值，花期為每年的8—11月，其總狀花序來(lái)自具葉的頂端，具1～2朵花，花姿優(yōu)雅，氣味芳香，既可做切花，可用于插花和餐桌的布置[2]，也可做盆栽。自然條件下，石斛屬植物的種子細(xì)小，不具胚乳，繁殖能力極低，主要通過(guò)分株方式繁殖[3]，而這種繁殖方法周期長(zhǎng)，短時(shí)間內(nèi)得到的有效苗數(shù)少。高山石斛的培植推廣受到種苗生產(chǎn)的制約[4]。近年來(lái)，隨著市場(chǎng)需求量的日益增大，原本自然資源稀缺，加之人們盲目過(guò)度采挖，使高山石斛的野生資源受到嚴(yán)重破壞[5]。本試驗(yàn)以MS為基本培養(yǎng)基，通過(guò)不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比應(yīng)用，對(duì)高山石斛進(jìn)行組織培養(yǎng)技術(shù)研究，篩選出高山石斛各個(gè)生長(zhǎng)培養(yǎng)階段的優(yōu)勢(shì)培養(yǎng)基，加快其繁殖速度，以期使高山石斛野生資源得到有效保護(hù)，同時(shí)降低組培成本，為高山石斛大規(guī)模的組培苗生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

高山石斛未開(kāi)裂成熟蒴果，采自廣西壯族自治區(qū)藥用植物園科研基地內(nèi)健壯、無(wú)病害的植株上。

1.2 組織培養(yǎng)

1.2.1 外植體消毒與啟動(dòng)培養(yǎng) 將高山石斛成熟飽滿、未開(kāi)裂的蒴果用流水清洗表面污垢，置于燒杯中依次用2%洗潔精溶液浸泡5 min，用線狀的自流水沖洗15 min；移至超凈工作臺(tái)，用75%乙醇表面消毒30 s，無(wú)菌水沖洗2次；用添加2滴吐溫-20的0.1% HgCl2浸泡15 min，無(wú)菌水浸泡沖洗3次；用消毒的濾紙除去表面水分，用無(wú)菌解剖刀將高山石斛蒴果的果皮輕輕切開(kāi)，用無(wú)菌鑷子將胚均勻撒播在以MS為基本培養(yǎng)基、添加不同濃度植物生長(zhǎng)劑（6-BA、NAA）的啟動(dòng)培養(yǎng)基上，觀察接入外植體的變化。

1.2.2 繼代增殖 將經(jīng)過(guò)初代培養(yǎng)獲得的無(wú)菌芽切為獨(dú)立的單芽，接種于以MS為基本培養(yǎng)基，添加30 g/L蔗糖、4.5 g/L 瓊脂、1 g/L活性炭、不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（1.0～4.0 mg/L 6-BA、0.5～1.0 mg/L NAA、0～0.5 mg/L KT）的繼代增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，pH值為5.8。重復(fù)3次。

1.2.3 生根培養(yǎng) 將繼代增殖培養(yǎng)生長(zhǎng)至3 cm左右的健壯單株從叢芽中剝離，接種至添加不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（6-BA、NAA）和植物提取液的MS基本培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)60 d，pH值為5.8；調(diào)查統(tǒng)計(jì)高山石斛生根的情況。每種培養(yǎng)基接種50株。

1.3 組織培養(yǎng)條件

溫度24～28 ℃，光照時(shí)間為12 d/h，平均光照為1 500～2 200 lx。

1.4 煉苗移栽

挑取生長(zhǎng)健壯、根系發(fā)達(dá)的高山石斛組培苗移入大棚溫室內(nèi)，打開(kāi)瓶蓋放置7 d，期間往瓶?jī)?nèi)組培苗噴灑少量水，保持瓶?jī)?nèi)水分充足；將瓶?jī)?nèi)幼苗取出，流水沖洗干凈根部的培養(yǎng)基，避免損傷根部的幼嫩組織；將幼苗于傍晚移栽至經(jīng)消毒過(guò)的栽培基質(zhì)中，保持濕度，上部覆蓋1層遮陽(yáng)網(wǎng)適度遮陰。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子的萌發(fā)情況

種子接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)25 d，大部分種子都固著在培養(yǎng)基表面，可明顯地觀察到種子胚開(kāi)始變大，由淡黃色慢慢變成淡綠色；隨培養(yǎng)時(shí)間的增加，淡綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樯罹G，萌發(fā)為原球莖；培養(yǎng)60 d，膨大的原球莖頂端產(chǎn)生葉原基突起，原球莖開(kāi)始慢慢分化，出現(xiàn)芽尖，并逐漸長(zhǎng)成芽苗。由表1可見(jiàn)，6-BA、NAA都對(duì)高山石斛芽的誘導(dǎo)產(chǎn)生影響；6-BA濃度不變時(shí)，NAA濃度增大有利于芽的萌發(fā)；NAA濃度不變時(shí)，6-BA 在0.1～0.5 mg/L范圍內(nèi)，濃度過(guò)高反而會(huì)使芽的萌發(fā)率下降；在MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L培養(yǎng)基上，高山石斛種子的萌發(fā)個(gè)數(shù)相對(duì)最多，芽苗顏色濃綠，長(zhǎng)勢(shì)良好（圖1）。因此，MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

2.2 繼代增殖

由表2可見(jiàn)，以MS為基本培養(yǎng)基、添加不同激素的12種培養(yǎng)基中，無(wú)菌芽苗接入增殖培養(yǎng)基30 d開(kāi)始分化，芽的增殖倍數(shù)有明顯差異；NAA、KT保持濃度不變，6-BA濃度為3.0 mg/L時(shí)芽的增殖能力相對(duì)較強(qiáng)，芽的增殖倍數(shù)為3.7～4.6（培養(yǎng)基編號(hào)為B7～B9），隨著6-BA濃度增加，芽的增殖倍數(shù)有所下降，且苗生長(zhǎng)過(guò)快，莖較細(xì)弱，有效苗的質(zhì)量變差；6-BA、NAA保持濃度不變時(shí)，培養(yǎng)基中加入KT有利于苗的增殖；培養(yǎng)基MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+活性炭1.0 g/L芽的增殖能力最強(qiáng)，增殖倍數(shù)達(dá)到4.6，芽生長(zhǎng)情況良好，苗健壯，葉色翠綠（圖2）。因此，確定培養(yǎng)基MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+活性炭1.0 g/L為高山石斛芽苗的最適增殖培養(yǎng)基。

2.3 生根培養(yǎng)

由表3可見(jiàn)，高山石斛在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+香蕉汁10%的培養(yǎng)基上生根率和生根數(shù)分別為92%、46條，平均根長(zhǎng)達(dá)2.79 cm，且芽苗葉色翠綠，植株健壯，根系長(zhǎng)而粗壯，主次分明（圖3），優(yōu)于其他組合；6-BA濃度保持不變時(shí)，隨NAA濃度的增大，高山石斛芽苗的生根率提高、生根數(shù)有所增加，NAA濃度為2.0 mg/L時(shí)生根效果相對(duì)最好，濃度過(guò)高反而不利于根的生長(zhǎng)。

2.4 煉苗移栽

試驗(yàn)表明，煉苗基質(zhì)以木屑 ∶草炭=2 ∶1為宜，栽好幼苗再覆蓋1層苔蘚，澆透水定根，同時(shí)保持棚內(nèi)濕度85%左右、溫度為20～30 ℃，15 d左右長(zhǎng)出新根去掉遮陽(yáng)網(wǎng)，此時(shí)，幼苗成活率高，生長(zhǎng)健壯。

3 結(jié)論與討論

組織培養(yǎng)過(guò)程中，只有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比恰當(dāng)，才有利于組培苗的生長(zhǎng)、 分化和快速繁殖[6]。MS培養(yǎng)基適合于大多

數(shù)的雙子葉植物，但不同品種在種子萌發(fā)和增殖過(guò)程中需要的激素濃度有很大區(qū)別[7]。本試驗(yàn)中，MS基本培養(yǎng)基中加入適宜的6-BA、NAA，可促進(jìn)高山石斛種子的萌發(fā)，較適宜種子萌發(fā)的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L，NAA濃度不變時(shí)，6-BA濃度過(guò)高反而會(huì)抑制萌發(fā)。

幼苗增殖和分化是組織培養(yǎng)過(guò)程中繁殖速度和增殖系數(shù)的關(guān)鍵[8]，而組培苗的增殖系數(shù)很大程度上受細(xì)胞分裂素的影響。試驗(yàn)表明，隨6-BA濃度的增大，繁殖系數(shù)有所提高，但當(dāng)6-BA濃度達(dá)到4.0 mg/L時(shí)，繁殖系數(shù)反而有所降低。KT作為外源性細(xì)胞分裂素，可以促進(jìn)側(cè)芽發(fā)育[9]。在高山石斛繼代增殖過(guò)程中，6-BA、NAA、KT等激素的聯(lián)合使用，對(duì)芽苗的增殖起到較為理想的效果，高山石斛在培養(yǎng)基MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+活性炭 1.0 g/L 中的繼代增殖效果相對(duì)最佳，芽生長(zhǎng)情況良好，苗健壯，葉色翠綠，增殖倍數(shù)達(dá)到4.6，且得到的有效苗數(shù)最多。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA對(duì)高山石斛的壯苗生根起到重要作用，與植物提取液香蕉汁配合使用生根效果較好，培養(yǎng)出的種苗植株健壯，主根系長(zhǎng)而粗壯，成活率高。因此，最適宜壯苗生根的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+香蕉汁10%。

高山石斛喜溫暖、潮濕的環(huán)境，移栽時(shí)關(guān)鍵是選取合適的栽培基質(zhì)。以木屑 ∶草炭灰=2 ∶1作為栽培基質(zhì)，并覆蓋1層苔蘚，既疏松又保水透氣，是一種較好的栽培基質(zhì)。

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