紫檀芪對C6膠質(zhì)瘤細胞凋亡及Caspase—3活性的影響

阮升　顧志成　張世華

【摘要】 目的：研究紫檀芪（pterostilbene，PTE）體外抑制C6膠質(zhì)瘤細胞增殖并誘導其凋亡的作用，探討其可能的作用機制。方法：運用MTT法測定細胞存活率，吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）雙熒光染色觀察C6細胞凋亡形態(tài)學變化，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定Caspase-3活性變化，并用Western blot法檢測Fas、FasL蛋白的表達水平。結果：由MTT結果知紫檀芪可以顯著抑制C6細胞的增殖（P<0.01），呈現(xiàn)藥物濃度與時間依賴性；AO/EB熒光染色（24 h）可見典型的凋亡形態(tài)學特征；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測表現(xiàn)為隨PTE濃度升高，Caspase-3活性逐步升高（P<0.01）；Western blot檢測顯示PTE可以使Fas、FasL蛋白表達顯著增加（P<0.01）。結論：PTE可誘導膠質(zhì)瘤細胞系C6細胞凋亡，其作用機制可能與激活Fas/FasL通路、上調(diào)Caspase-3活性有關。

【關鍵詞】 紫檀芪； 膠質(zhì)瘤細胞； 細胞凋亡； Fas/FasL； Caspase-3

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of pterostilbene（PTE） on the proliferation and apoptosis of glioma cell C6 in vitro，to probe into its mechanism.Method：MTT method was used to detect the survival rate of cells，using AO/EB fluorescent staining methods to observe apoptotic morphological changes of C6 cells.The enzymatic acitivity of Csapase-3 was measured by ELISA.The protein levels of Fas and FasL were detected by Western blot.Result：MTT result showed that PTE can effectively inhibit the proliferation of C6（P<0.01），these effects were showed to be time-and dose-dependent.The result of AO/EB fluorescent staining（24 h） showed that C6 treated by PTE was seen typical apoptotic morphological features.Besides，the enzymatic activity of Csapase-3 was promoted obviously after the effect of PTE on C6 cells by ELISA（P<0.01）.The result of Western blot showed that the protein levels of Fas and FasL in the C6 were upgraded significantly（P<0.01）. Conclusion：PTE can induce apoptosis of glioma cell C6，which is concerned with upgrading Fas and FasL，thereby affecting activation of apoptotic factor Caspase-3 protein.

【Key words】 Pterostilbene； Glioma cells； Apoptosis； Fas/FasL； Caspase-3

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.01.005

腦膠質(zhì)瘤作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及死亡率居顱內(nèi)腫瘤之首，具有無控增殖、侵潤生長、易復發(fā)等特點[1-2]。目前腦膠質(zhì)瘤的治療方案主要是以手術切除為主，化療及放療為輔，盡管綜合以上各種治療手段，但膠質(zhì)瘤患者的中位生存期并無明顯改善，患者大多于明確診斷后1年內(nèi)死亡[3]。近年來，一些天然物質(zhì)（ 青蒿琥酯、白藜蘆醇、雷公藤內(nèi)酯醇等）被逐漸應用于腫瘤的防治，其優(yōu)異的效果使人們越來越重視天然藥物在抗腫瘤方面的研究與應用[4-7]。目前關于白藜蘆醇抗腫瘤的研究很多，其可抑制多種惡性腫瘤細胞的生長[8-9]。紫檀芪（pterostilbene，PTE）作為白藜蘆醇的甲基化衍生物，與白藜蘆醇相比，具有更高的的生物活性[10]，更好的安全性[11]。關于PTE治療腦膠質(zhì)瘤的研究國內(nèi)外目前尚無報道，本研究將以體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤C6細胞系作為研究對象，觀察PTE對其增殖及凋亡的影響，從而為臨床藥物治療腦膠質(zhì)瘤提供新的思路與方法。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細胞株（上海拜力生物科技有限公）；PTE（南京世洲生物科技有限公司，純度>99%），用DMSO溶解。DMEM培養(yǎng)基，0.25%胰酶和胎牛血清（Hyclone公司）；四甲基偶氮唑藍（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）（上海碧云天生物技術有限公司）；Fas、FasL抗體（北京中杉公司）；β-actin 抗體（北京中杉公司）；大鼠Caspase-3 Elisa試劑盒（上海恒遠生物科技有限公司）。Allegra 64R超低溫高速離心機（Beckman公司）；Synergy HT全自動酶標儀（Bio-Tek公司）；Tanon 5200圖像分析管理系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；激光共聚焦顯微鏡（OLYMPUS）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將C6細胞用完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清及1%雙抗）置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)期備用。

1.2.2 MTT法檢測PTE對C6細胞增殖的抑制作用 調(diào)整細胞濃度為5×107/L，96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μL，待其貼壁后，再加入PTE溶液100 μL，使PTE終濃度為10、20、40 μmol/L，對照組加入同體積含0.01%DMSO的完全培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48、72 h，加20 μL的MTT，4 h后棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，在37 ℃恒溫搖床上震蕩10 min，酶標儀570/630 nm處測定各組OD值。

1.2.3 AO/EB熒光染色法檢測細胞凋亡 C6細胞以3×107/L的濃度鋪100 μL于激光共聚焦培養(yǎng)皿，4 h后棄掉舊培養(yǎng)液，加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入PTE（分組同1.2.2）繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸棄原培養(yǎng)液，用PBS洗滌3遍，加入AO/EB 雙熒光染色液100 μL（AO、EB的終濃度為5 μg/mL）。染色8 min后，吸棄染液，加PBS洗滌3遍，于激光共聚焦顯微鏡下觀察并記錄。

1.2.4 Caspase-3活化程度的測定 取實驗組和對照組細胞（分組同1.2.2）：用PBS洗滌2遍，離心（1200 r/min，3 min）收集的沉淀后加入裂解液，在冰上超聲裂解細胞后，于4 ℃，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液備用。按BCA試劑盒說明書操作，計算各組中的蛋白濃度，取100 μL含150 μg蛋白的樣品，加入反應緩沖液100 μL，再加入10 μL Caspase-3熒光底物于恒溫箱中培養(yǎng)4 h，在405 nm波長測定其OD值。

1.2.5 Western blot檢測Fas、FasL蛋白表達 以細胞密度為5×107/L， 接種于培養(yǎng)皿中，加入PTE（分組同1.2.2），培養(yǎng)24 h后，裂解細胞，按BCA試劑盒檢測樣品蛋白的濃度后，按30 μg體系加樣，垂直電泳，270 mA電轉膜70 min，封閉50 min，一抗孵育過夜，二抗孵育60 min，加入ECL發(fā)光液，Tanon 5200采集圖像，并對Western blot結果進行灰度掃描。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT法測定PTE對C6細胞增殖的影響 不同濃度PTE（ 10、20、40 μmol/L） 培養(yǎng)24、48、72 h后細胞存活率結果，見表1。由10、20、

40 μmol/L的PTE對C6細胞作用48 h的抑制率分別為（45.88±0.74）%、（52.37±1.59）%、（63.97±1.47）%，可見隨著藥物濃度的升高，抑制作用逐漸增強，同時24、48、72 h半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為75.2、14.6、4.8 μmol/L，顯示隨著作用時間延長，抑制作用逐漸增強。上述結果表明PTE可以有效抑制C6細胞的增殖，結果呈濃度時間依賴性。

2.2 激光共聚焦觀察C6細胞核形態(tài)改變 經(jīng)AO/EB

熒光染色后，對照組的細胞核染色質(zhì)均被染成綠色，深淺不一致，同時細胞核仍呈正常形態(tài)；經(jīng)10、20 μmol/L PTE處理24 h后細胞大多核染色質(zhì)染成綠色，染色增強，熒光更為明亮，呈固縮狀或圓珠狀，體積也較對照組的細胞大，為早期凋亡細胞；經(jīng)40 μmol/L PTE處理24 h后，有些細胞核染色質(zhì)被染成橘紅色，碎裂散布于胞漿中，細胞膜完整性遭到破壞，這些為晚期凋亡細胞。見圖1。隨著藥物濃度的增加，橘紅色熒光增強，被染細胞核的比例也隨之增高，同時細胞數(shù)目隨著減少，呈典型的凋亡特征。

2.3 PTE對C6 細胞中Caspase-3活性影響 各濃度PTE組C6 細胞Caspase-3蛋白含量較對照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表2。

2.4 Western blot檢測Fas、FasL的表達 Fas和FasL表達的蛋白水平隨著PTE濃度增加而增加，同時各指標在各組間表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見圖2，即PTE誘導 Fas和FasL蛋白的表達呈現(xiàn)劑量依賴性。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生演化與細胞調(diào)控增殖、分化、凋亡三者的平衡失調(diào)相關聯(lián)，是由多個基因、多個步驟、多個階段的共同作用[12]，其中細胞增殖與凋亡的平衡失調(diào)在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中可能起著十分重要的作用[13]。有學者提出啟動腫瘤細胞自身凋亡機制，誘導腫瘤細胞凋亡對腫瘤治愈有重要的意義[14-15]。目前在哺乳動物中存在著內(nèi)源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑這兩條細胞凋亡途徑[16]。而Caspase-3是這2條信號途徑的關鍵通道，它的表達增加及活化標志著細胞啟動了凋亡機制[17]。Fas/FasL是腫瘤細胞中廣泛存在且極為重要的受體[18]，作為體內(nèi)介導細胞凋亡的一對糖蛋白分子，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用[19]，F(xiàn)as與FasL配體結合后可通過 Fas分子啟動膜受體途徑信號，激活Caspase-3，最終啟動細胞凋亡信號途徑[20]。

PTE作為一種天然物質(zhì)，具有明確的抗腫瘤效應，與傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物相比，其安全范圍很大，基本無不良反應[10-11]，同時具有較好的脂溶性，極易通過血腦屏障[21]。有研究顯示PTE能通過線粒體途徑和死亡受體途徑傳遞凋亡信號，多靶點誘導細胞凋亡，最終發(fā)揮其抗腫瘤效應[22]。但是在不同的腫瘤細胞中，其具體作用方式及作用靶點仍不甚清楚。有學者指出PTE能通過促使線粒體膜電位去極化及上調(diào)Caspase-3活性來誘導人乳腺癌細胞凋亡[23]。

本實驗經(jīng)AO/EB熒光染色法觀察到C6細胞核中可見典型的凋亡形態(tài)學特征。MTT的結果呈現(xiàn)出PTE對于C6膠質(zhì)瘤細胞的增殖抑制具有時間及濃度依賴性。為了進一步探討PTE誘導C6細胞凋亡的具體作用方式，對Caspase-3酶活性及Fas、FasL蛋白的表達進行了檢測：PTE作用于C6細胞24 h后Caspase-3活性顯著上升（P<0.01），F(xiàn)as、FasL蛋白表達明顯增加（P<0.01）。由此推斷，PTE誘導C6細胞凋亡的作用與調(diào)控死亡受體途徑的相關蛋白的表達存在一定的聯(lián)系。同時，可進一步提出猜想PTE能否干擾線粒體膜的穩(wěn)定性，并圍繞線粒體凋亡途徑是否也參與了PTE誘導C6膠質(zhì)瘤細胞凋亡進程，開展進一步的深入研究。

綜上所述，PTE可能通過激活Fas/FasL通路，活化Caspase-3，從而抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖并誘導其凋亡?；诒緦嶒炑芯砍晒?，PTE在腦膠質(zhì)瘤藥物治療領域中有很高的研究價值及開拓前景。

參考文獻

[1] Alves T R，Lima F R S，Kahn S A，et al.Glioblastoma cells：A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma[J].Life Sciences，2011，89（15-16）：532-539.

[2] Kettenmann H，Hanisch U K，Noda M，et al.Physiology of microglia[J].Physiological Reviews，2011，91（2）：461-553.

[3] Bao S，Wu Q，McLendon R E，et al.Glioma stem cells promote radior-esistance by preferential activation of the DNA damage response[J].Nature，2006，444（7120）：756-760.

[4] Stakleff K S，Sloan T，Blanco D，et al.Resveratrol exerts differential effects in vitro and in vivo against ovarian cancer cells[J].Asian Pacific Journal of Cancer Prevention Apjcp，2012，13（4）：1333-1340.

[5] Harikumar K B，Aggarwal B B.Resveratrol： a multitargeted agent for age-associated chronic diseases[J].Cell Cycle，2008，7（8）：1020-1035.

[6] Vergara D，Valente C M，Tinelli A，et al.Resveratrol inhibits the epidermal growth factor-induced epithelial mesenchymal transition in MCF-7 cells[J].Cancer Letters，2011，310（1）：1-8.

[7] Piotrowska H，Myszkowski K，Zió?kowska A，et al.Resveratrol analogue 3，4，4 ，5-tetramethoxystilbene inhibits growth， arrests cell cycle and induces apoptosis in ovarian SKOV-3 and A-2780 cancer cells[J].Toxicology & Applied Pharmacology，2012，263（1）：53-60.

[8] Frazzi R，Valli R，Tamagnini I，et al.Resveratrol-mediated apoptosis of hodgkin lymphoma cells involves SIRT1 inhibition and FOXO3a hyperacetylation[J].International Journal of Cancer Journal International Du Cancer，2013，132（5）：1013-1021.

[9] Rimando A M，Cuendet M，Desmarchelier C，et al.Cancer chemopreventive and antioxidant activities of pterostilbene， a naturally occurring analogue of resveratrol[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry，2002，50（12）：3453-3457.

[10] Ruiz M J，F(xiàn)ernández M，Picó Y，et al.Dietary administration of high doses of pterostilbene and quercetin to mice is not toxic[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry，2009，57（57）：3180-3186.

[11] Chang J，Rimando A，Pallas M，et al.Low-dose pterostilbene，but not resveratrol，is a potent neuromodulator in aging and Alzheimer's disease[J].Neurobiology of Aging，2012，33（9）：2062-2071.

[12] Huse J T，Holland E C.Targeting brain cancer： advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma[J].Nature Reviews Cancer，2010，10（5）：319-331.

[13]馬瑞敏，康熙雄，楊春嬌，等.腦膠質(zhì)瘤惡性進展關鍵miRNA表達的研究[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2016，13（9）：1184-1186.

[14]鄭立影，呂紅，林賦桂，等.腦膠質(zhì)瘤治療策略及其研究進展[J].吉林醫(yī)藥學院學報，2016，37（1）：50-53.

[15]綦曉艷，王文武，歐陽學農(nóng).DR4、DR5甲基化影響腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體誘導腫瘤細胞凋亡的研究進展[J].實用臨床醫(yī)藥雜志，2015，19（1）：156-160.

[16] Strasser A，Cory S，Adams J M.Deciphering the rules of programmed cell death to improve therapy of cancer and other diseases[J].Embo Journal，2011，30（18）：3667-3683.

[17] Mcilwain D R，Berger T，Tw M.Caspase Functions in Cell Death and Disease： Figure 1[J].Cold Spring Harbor Perspectives in Biology，2013，5（4）：962-968.

[18]王耀先，郝慧南，陳秀瑋，等.大黃素通過內(nèi)源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑誘導人宮頸癌Hela細胞凋亡的研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2013，20（1）：37-39.

[19] Chen L，Park S M，Tumanov A V，et al.CD95 promotes tumour growth[J].Nature，2010，465（7297）：492-496.

[20] Jian X，Cheng G，Tang H F，et al.Ardipusilloside I induces apoptosis in human glioblastoma cells through a caspase-8-independent FasL/Fas-signaling pathway[J]. Environmental Toxicology & Pharmacology，2009，27（2）：264-270.

[21] Foti C V，Ciurleo R，Giacoppo S，et al.Role of resveratrol and its analogues in the treatment of neurodegenerative diseases： focus on recent discoveries[J].Cns & Neurological Disorders Drug Targets，2011，10（7）：849-862.

[22]王燕山，丁凌，王曉稼.紫檀芪的抗腫瘤活性研究進展[J].國際腫瘤學雜志，2011，38（3）：189-191.

[23] Schneider J G，Alosi J A，Mcdonald D E，et al.Effects of pterostilbene on melanoma alone and in synergy with inositol hexaphosphate[J].American Journal of Surgery，2009，198（5）：679-684.

（收稿日期：2016-09-01） （本文編輯：程旭然）