N-烷基酰胺類(lèi)化合物電噴霧質(zhì)譜裂解機(jī)制的研究

董 潔，冀嬌嬌，王加利，袁 將，高 簡(jiǎn)，張亞麗，姬瑞芳，全慶華，譚 鵬，劉永剛

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102)

N-烷基酰胺類(lèi)化合物電噴霧質(zhì)譜裂解機(jī)制的研究

董 潔，冀嬌嬌，王加利，袁 將，高 簡(jiǎn)，張亞麗，姬瑞芳，全慶華，譚 鵬，劉永剛

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102)

為闡明維吾爾族藥阿納其根中N-烷基酰胺類(lèi)成分的質(zhì)譜裂解機(jī)制，采用電噴霧離子源(ESI)正離子模式進(jìn)行多級(jí)碎片解析，對(duì)阿納其根中分離得到5種N-烷基酰胺類(lèi)成分：十-2E,4E-二烯酸-異丁基胺，十一-2E,4E-二烯-8,10二炔酸-苯乙胺，十-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺，十二-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺和十四-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺，應(yīng)用密度泛函(DFT)法比較不同裂解方式的優(yōu)化結(jié)構(gòu)，并分析其可能的質(zhì)譜裂解機(jī)制。結(jié)果表明，在正離子模式下，5種N-烷基酰胺類(lèi)成分均易形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子，并進(jìn)一步發(fā)生N-位的α裂解，丟失酰胺結(jié)構(gòu)中胺部分、羰基以及水等而形成碎片離子。該類(lèi)化合物的裂解規(guī)律可為N-烷基酰胺類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析奠定理論基礎(chǔ)。

N-烷基酰胺類(lèi)成分；電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MSn)；裂解途徑；量子計(jì)算化學(xué)

N-烷基類(lèi)化合物多為一端較長(zhǎng)不飽和酸和另一端有較少取代基的胺構(gòu)成的酰胺結(jié)構(gòu)，是廣泛存在于菊科、馬兜鈴科等植物中的一類(lèi)重要天然產(chǎn)物。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，N-烷基類(lèi)成分具有抗病毒、抗炎等藥理活性[1]，此外還具有酪氨酸酶激活作用[2]。

目前，關(guān)于N-烷基類(lèi)成分的研究報(bào)道多為對(duì)其提取物進(jìn)行LC/MS分析，如，Boonen等[3-4]采用HPLC-UV-ESI-MS法從阿納其根的乙醇提取物中鑒定了13種N-烷基類(lèi)成分，從金紐扣的乙醇提取物中鑒定了11種N-烷基類(lèi)成分，但并未進(jìn)一步研究這一類(lèi)單體成分的質(zhì)譜裂解機(jī)制。高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-ESI-MSn)技術(shù)集合了色譜強(qiáng)大的分離能力與質(zhì)譜優(yōu)越的定性功能，現(xiàn)已廣泛用于中藥復(fù)雜成分分析和化合物結(jié)構(gòu)鑒定等領(lǐng)域[7-10]，而量子化學(xué)計(jì)算[11-15]可以輔助推測(cè)化合物的電噴霧質(zhì)譜裂解途徑和裂解規(guī)律。

鑒于目前對(duì)N-烷基類(lèi)成分物質(zhì)基礎(chǔ)研究的缺乏，本研究擬采用HPLC-ESI-MSn結(jié)合量子化學(xué)計(jì)算方法，對(duì)維吾爾族藥阿納其根中分離得到的5種N-烷基酰胺類(lèi)成分的質(zhì)譜裂解機(jī)制進(jìn)行研究，以期為N-烷基酰胺類(lèi)成分的結(jié)構(gòu)鑒定及復(fù)雜樣品的快速檢測(cè)和定量分析提供理論依據(jù)和方法參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 1100 series HPLC色譜儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品，配有在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器、Chem stations色譜工作站等；Agilent 1100 MSD XCT/plus 離子阱質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；Satorious十萬(wàn)分之一電子天平：德國(guó)Satorious公司產(chǎn)品。

化合物a～e：均由本實(shí)驗(yàn)室從阿納其根(AnacycluspyrethrumDC.)中提取分離制備得到，經(jīng)核磁共振確定其結(jié)構(gòu)，經(jīng)HPLC-UV鑒定其純度達(dá)98%以上；乙腈(色譜純)：美國(guó)Fisher Scientific公司產(chǎn)品；甲酸：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水：屈臣氏蒸餾水；其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 樣品制備 將2 kg阿納其根藥材粉碎成粗粉，用10倍量70%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，回收溶劑，得到272 g浸膏。依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取浸膏，減壓回收溶劑，得到40 g二氯甲烷部位。用1.5倍硅膠拌樣，200～300目硅膠裝柱(硅膠與浸膏質(zhì)量比為1∶50)，依次用不同體積比的石油醚-乙酸乙酯(10∶1，7∶1，5∶1，3∶1，1∶1)及乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液經(jīng)硅膠薄層鑒別后，合并組成相似的流分，每個(gè)流分再經(jīng)硅膠、C18反復(fù)柱層析，得到化合物a～e。

1.2.2 色譜條件 Agilent Extend-C18 柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸水溶液(70:30，V∶V)；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL。

1.2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧(ESI)離子源，正離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 500；霧化氣和干燥氣均為氮?dú)?，純?99.99%；干燥氣流速11 L/min；霧化氣壓力241.5 kPa；碰撞氣為氦氣；噴霧電壓3 500 V；碰撞能量1 eV；采用Agilent 6300離子阱工作站(6.1版)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.4 量子化學(xué)計(jì)算方法 所有理論計(jì)算均應(yīng)用Gaussian03 程序完成，采用密度泛函(DFT)法并選擇6-31G基組，幾何優(yōu)化分析在B3LYP/6-31d水平上計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 一級(jí)質(zhì)譜分析

N-烷基酰胺類(lèi)成分可分為N-異丁基酰胺類(lèi)(IBA)，苯乙基酰胺類(lèi)(2-PEA)，苯乙基酰胺類(lèi)(4-OH PEA)等，它們結(jié)構(gòu)相似，區(qū)別僅見(jiàn)于組成它們的胺結(jié)構(gòu)不同。在電噴霧正離子模式下，5種化合物均以[M+H]+準(zhǔn)分子離子形式存在，幾乎沒(méi)有碎片離子，易于確定化合物的相對(duì)分子質(zhì)量。5種N-烷基酰胺類(lèi)成分(分別對(duì)應(yīng)化合物a～e)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式示于圖1，其一級(jí)質(zhì)譜圖示于圖2。

圖1 5種N-烷基酰胺類(lèi)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of five N-alkylamides

注：a.十-2E,4E-二烯酸-異丁基胺；b.十-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺；c.十二-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺；d.十四-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺；e.十一-2E,4E-二烯-8,10二炔酸-苯乙胺圖2 正離子模式下，5種N-烷基酰胺化合物的ESI-MS圖Fig.2 ESI-MS spectra of five N-alkylamides in positive ion mode

2.2 ESI-MSn分析

為進(jìn)一步分析化合物的結(jié)構(gòu)與裂解途徑的關(guān)系，對(duì)5種化合物的ESI-MSn碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)規(guī)律進(jìn)行研究，所得的質(zhì)譜圖示于圖3。5種化合物在正離子模式下的ESI-MSn碎片裂解信息列于表1。

2.2.1 異丁基酰胺類(lèi)(IBA)化合物的質(zhì)譜裂解途徑分析 十-2E,4E-二烯酸-異丁基胺屬于IBA類(lèi)，準(zhǔn)分子離子[M+H]+為m/z224。由圖3a可知，在二級(jí)質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了兩個(gè)相對(duì)豐度較高的碎片離子m/z168和m/z151。其中，m/z168是化合物結(jié)構(gòu)上的N位發(fā)生α裂解丟失異丁基而形成的碎片離子；m/z151是化合物結(jié)構(gòu)上的N位發(fā)生α裂解丟失N-異丁基而形成的碎片離子。在其三級(jí)質(zhì)譜圖中，出現(xiàn)了m/z133和m/z123碎片離子。其中，m/z123是由m/z151離子碎裂失去羰基(28 u)形成的碎片離子；m/z133可能是由m/z151離子經(jīng)電荷轉(zhuǎn)移和重排失去水(18 u)形成的碎片離子。在四級(jí)質(zhì)譜圖中，m/z133碎片進(jìn)一步丟失C2H4(28 u)碎片，生成m/z105碎片離子。

注：a.十-2E,4E-二烯酸-異丁基胺；b.十-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺；c.十二-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺；d.十四-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺；e.十一-2E,4E-二烯-8,10二炔酸-苯乙胺圖3 5種N-烷基酰胺類(lèi)化合物的ESI-MSn圖Fig.3 ESI-MSn spectra of five N-alkylamides

2.2.2 4-羥基苯乙基烷基酰胺類(lèi)(4-OH PEA)化合物的質(zhì)譜裂解途徑分析 十-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺、十二-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺、十四-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺3個(gè)化合物屬于4-OH PEA類(lèi)，它們的區(qū)別是不飽和脂肪酸鏈長(zhǎng)度不同，結(jié)構(gòu)上相差(C2H4)n。下面以十-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺為例，對(duì)這類(lèi)成分的裂解途徑進(jìn)行闡釋。

十-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺的準(zhǔn)分子離子[M+H]+為m/z288，由圖3b可見(jiàn)，在二級(jí)質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了兩個(gè)相對(duì)豐度較高的碎片離子m/z168和m/z151。其中，m/z168是準(zhǔn)分子離子[M+H]+化合物結(jié)構(gòu)上的N位發(fā)生α裂解丟失4-羥基苯乙胺而形成的碎片離子；而m/z151是該化合物結(jié)構(gòu)上的N位發(fā)生α裂解丟失N-4-羥基苯乙胺而形成的碎片離子。在三級(jí)質(zhì)譜圖中，出現(xiàn)了m/z133和m/z123碎片離子。其中，m/z123是由m/z151離子碎裂失去羰基(28 u)形成的碎片離子；m/z133離子可能是由m/z151離子經(jīng)電荷轉(zhuǎn)移和重排失去水(18 u)形成的碎片離子。在四級(jí)質(zhì)譜圖中，m/z133而進(jìn)一步丟失C2H4(28 u)而生成m/z105碎片離子。

十-2E,4E-二烯酸-異丁基胺和十-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺的裂解模式示于圖4。

十二-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺(圖3c)與十四-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺(圖3d)因結(jié)構(gòu)上有較長(zhǎng)的直鏈烷基，還出現(xiàn)了一系列相差(CH2)n的碎片離子，如：十四-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺的三級(jí)質(zhì)譜圖中，母離子m/z207丟失水及質(zhì)量數(shù)相差14的一系列碎片離子生成m/z189和m/z161、147、133、119。

表1 正離子模式下，5種N-烷基酰胺類(lèi)化合物的多級(jí)碎片信息Table 1 Fragmentation of five N-alkylamides in positive ion mode

圖4 十-2E,4E-二烯酸-異丁基胺和十-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺的裂解模式Fig.4 Fragmentation patterns of deca-2E, 4E-dienoicacid isobutylamideylamide and deca-2E,4E-dienoicacid-4-hydroxyphenylethlamide

圖5 十一-2E,4E-二烯-8,10-二炔酸-苯乙胺的裂解模式Fig.5 Fragmentation pattern of undeca-2E,4E-diene-8,10-diynoic acid phenylethylamide

2.2.3 苯乙基酰胺類(lèi)(2-PEA)化合物的質(zhì)譜裂解途徑分析 十一-2E,4E-二烯-8,10-二炔酸-苯乙胺屬于2-PEA類(lèi)化合物，其分子離子[M+H]+為m/z278，由圖3e可見(jiàn)，二級(jí)質(zhì)譜圖中，m/z157是由m/z278化合物結(jié)構(gòu)上的N位發(fā)生α裂解丟失N-苯乙基而形成的碎片離子；在三級(jí)質(zhì)譜圖中，出現(xiàn)了m/z145碎片離子，它是由m/z157離子碎裂失去C(12 u)形成的碎片離子；在四級(jí)質(zhì)譜圖中，母離子m/z145經(jīng)電荷轉(zhuǎn)移和重排失去水(18 u)生成了m/z127碎片離子，其可能的裂解途徑示于圖5。

2.2.4 質(zhì)譜裂解的量子化學(xué)計(jì)算 通過(guò)分析十-2E,4E-二烯酸-異丁基胺、十-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺、十二-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺和十四-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺這4種化合物的多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)它們具有相似的質(zhì)譜裂解規(guī)律，即在發(fā)生酰胺結(jié)構(gòu)上N-位，裂解后，繼續(xù)丟失H2O(18 u)，推測(cè)其脫水后可能生成的結(jié)構(gòu)為二烯炔或二炔。采用量子化學(xué)計(jì)算分別對(duì)這兩種結(jié)構(gòu)進(jìn)行最低能量構(gòu)象的優(yōu)化，二烯炔結(jié)構(gòu)優(yōu)化后最低能量HF=-388.319 2 a.u.，二炔結(jié)構(gòu)優(yōu)化后最低能量HF=-388.233 1 a.u.，說(shuō)明二烯炔結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，可由此確認(rèn)以上4種化合物的三級(jí)質(zhì)譜離子為二烯炔結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

采用HPLC-ESI-MSn法對(duì)阿納其根中分離得到的5種N-烷基酰胺類(lèi)成分進(jìn)行質(zhì)譜裂解機(jī)制研究，結(jié)合量子化學(xué)計(jì)算法，分析了這類(lèi)成分的主要碎片離子和裂解模式。結(jié)果表明，在正離子模式下，5種N-烷基類(lèi)成分具有相似的質(zhì)譜裂解規(guī)律，均易形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子，然后進(jìn)一步發(fā)生N-位的α裂解，丟失酰胺結(jié)構(gòu)中胺的部分、羰基、水等碎片形成碎片離子。采用量子化學(xué)計(jì)算法對(duì)十-2E,4E-二烯酸-異丁基胺、十-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺、十二-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺和十四-2E,4E-二烯酸-4-羥基苯乙胺等4種化合物的三級(jí)質(zhì)譜離子進(jìn)行了最低能量構(gòu)象的優(yōu)化，結(jié)果顯示，二烯炔結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。通過(guò)對(duì)這5種N-烷基酰胺類(lèi)成分質(zhì)譜裂解機(jī)制的研究，可為N-烷基酰胺類(lèi)成分的結(jié)構(gòu)鑒定及復(fù)雜樣品的快速檢測(cè)提供理論依據(jù)和方法參考。

[1] BOONEN J, BRONSELAER A, NIELANDT J, et al. Alkamid database: chemistry, occurrence and functionality of plantN-alkylamides[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2012, 142(3): 563-590.

[2] 古麗娜爾·卡斯木. 阿納其根化學(xué)成分及其酪氨酸酶活性篩選研究[D]. 烏魯木齊：新疆醫(yī)科大學(xué),2014.

[3] BOONEN J, BAERT B, BURVENICH C, et al.

LC-MS profiling ofN-alkylamides inSpilanthesacmellaextract and the transmucosal behaviour of its main bio-active spilanthol[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 2010, 53(3): 243-249.

[4] BOONEN J, SHARMA V, DIXIT V K, et al. LC-MSN-alkylamide profiling of an ethanolicAnacycluspyrethrumroot extract[J]. Planta Medica, 2012, 78(16): 1 787-1 795.

[5] ANNALAKSHMI R, UMA R, CHANDRAN G S, et al. A treasure of medicinal herb-Anacycluspyrethrum-A review[J]. Indian Journal of Drugs and Diseases, 2012, 1(3): 59-67.

[6] KUMAR V K, LALITHA K G. Pharmacognostical studies on the root ofAnacycluspyrethrumDC[J]. Indian Journal of Natural Products and Resources, 2012, 3(4): 518-526.

[7] HAYASHIDA M, HAYAKAWA H, WADA K, et al. A column-switching LC/MS/ESI method for detecting tetrodotoxin andAconitumalkaloidsin serum[J]. Legal Medicine, 2003, 5: S101-S104.

[8] HAN J, TAN P, LI Z, et al. Fuzi attenuates diabetic neuropathy in rats and protects schwann cells from apoptosis induced by high glucose[J]. Plos One, 2014, 9(1): e86 539-e86 539.

[9] LIU Y G, ZHANG Q S, LU Y Q, et al. Analysis of aconitine metabolites in ten-year aconitine poisoning human liver sample using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Asian Journal of Chemistry, 2014, 26(14): 4 277-4 280.

[10]LIU Y G, TAN P, LI F, et al. Study on the aconitine-type alkaloids of and its processed products using HPLC-ESI-MS[J]. Drug Testing & Analysis, 2013, 5(6): 480-484.

[11]詹雪艷,張燕玲,張加余,等. 積雪草苷和羥基積雪草苷的電噴霧質(zhì)譜裂解機(jī)制研究[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào),2015,36(4):289-295.

ZHAN Xueyan，ZHANG Yanling，ZHANG Jia-yu, et al. Frangmentation pathway and patterns ofAsiaticosideandMadecassosidein ESI-MSn[J]. Journal of Chinses Mass Spectrometry Sociedty, 2015, 36(4): 289-295(in Chinese).

[12]歐陽(yáng)永中. 電子轟擊和電噴霧電離源有機(jī)質(zhì)譜裂解規(guī)律的量子化學(xué)解析[D]. 長(zhǎng)沙：中南大學(xué),2010.

[13]夢(mèng)海. 量子化學(xué)計(jì)算方法與應(yīng)用[M]. 北京：科學(xué)出版社,2004.

[14]陳蘭慧,金蓮姬,蘇忠民,等. 烏頭堿類(lèi)生物堿電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜行為及碎片離子穩(wěn)定性的量子化學(xué)計(jì)算[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),2005,26(12):2 340-2 344.

CHEN Lanhui, JIN Lianji, SU Zhongmin, et al. ESI-MS behavior and quantum chemistry calculation of stability of fragmentation of diester-diterpenoid alakloids[J]. Chemical Journal of Chinses University, 2005, 26(12): 2 340-2 344(in Chinese).

[15]ZHANG G, MUSGRAVE C B. Comparison of DFT methods for molecular orbital eigenvalue calculations[J]. The Journal of Physical Chemistry A, 2007, 111(8): 1 554-1 561.

Fragmentation Pathways and Patterns ofN-Alkylamides by ESI-MSn

DONG Jie, JI Jiao-jiao, WANG Jia-li, YUAN Jiang, GAO Jian, ZHANG Ya-li, JI Rui-fang, QUAN Qing-hua, TAN Peng, LIU Yong-gang

(SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China)

There are 4 main types ofN-alkylamides inAnacycluspyrethrumDC., namely, isobutylamide (IBA),N-Me isobutylamide (N-Me IBA), 2-phenylethylamide (2-PEA) and 4-hydroxyphenylethylamide (4-OH PEA). However, there was very few research on the fragmentation pathways ofN-alkylamides by now. In order to obtain accurate and comprehensive information about the fragmentation pathways ofN-alkylamides, 5 kinds ofN-alkylamides were analyzed by HPLC-ESI-MSn. They are identified as deca-2E, 4E-dienoicacid isobutylamideylamide, undeca-2E, 4E-diene-8, 10-diynoic acid phenylethylamide, deca-2E, 4E-dienoicacid 4-hydroxyphenylethlamide, dodeca-2E, 4E-dienoicacid 4-hydroxyphenyl-ethylamide and tetradeca-2E, 4E-dienoic acid 4-hydroxyphenylethylamide. Multi-stage mass spectrum diagrams of fiveN-alkylamides were obtained in positive ion mode. Simultaneously, the method of quantum computational chemistry was adopted to verify their fragmentation pathways. Characteristic fragment ions were identified and the patterns were deduced further. The fragmentation patterns and structural assignment of ‘isobutylamides (IBA)’type, ‘2-phenylethylamide(2-PEA)’ type and ‘4-hydroxyphenylethyl-amides (4-OH PEA)’ type in ESI-MSnunder positive ion mode were summarized. The results show that fiveN-alkylamides have the similar fragmentation pathway, [M+H]+is prone to α-cracking inN-position at the first, loss of 28(CO), 18(H2O) subsequently. These compounds have strong pyrolysis rules and the study can provide reference forN-alkylamides in structural identification and quantitative analysis.

N-alkylamides; ESI-MSn; fragmentation pathways; quantum computational chemistry

2016-06-06;

2016-10-03

新疆自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201318101-5)資助

董 潔(1993—)，女(漢族)，甘肅人，碩士研究生，中藥化學(xué)專(zhuān)業(yè)。E-mail: dongjie5255@163.com

譚 鵬(1980—)，男(漢族)，山東濰坊人，副教授，從事中藥炮制研究。E-mail: tanpengtcm@163.com

劉永剛(1981—)，男(漢族)，山東臨沂人，副教授，從事中藥化學(xué)研究。E-mail: liuyg0228@163.com

O657.63

A

1004-2997(2017)01-0083-06

10.7538/zpxb.2017.38.01.0083