中藥白芷中歐前胡素、異歐前胡素體外經(jīng)皮滲透特性的串聯(lián)質(zhì)譜研究

張 琳，皮子鳳，孫云霞，劉志強，宋鳳瑞，胡秀麗，韓紅祥

(1.吉林大學藥學院，吉林 長春 130021；2.中國科學院長春應用化學研究所，長春質(zhì)譜中心，吉林省中藥化學與質(zhì)譜重點實驗室，吉林 長春 130022；3.吉林農(nóng)業(yè)大學，吉林 長春 130118；4.吉林省現(xiàn)代中藥及生物制藥基地建設辦公室，吉林 長春 130041)

中藥白芷中歐前胡素、異歐前胡素體外經(jīng)皮滲透特性的串聯(lián)質(zhì)譜研究

張 琳1，皮子鳳2，孫云霞1，劉志強2，宋鳳瑞2，胡秀麗1，韓紅祥3,4

(1.吉林大學藥學院，吉林 長春 130021；2.中國科學院長春應用化學研究所，長春質(zhì)譜中心，吉林省中藥化學與質(zhì)譜重點實驗室，吉林 長春 130022；3.吉林農(nóng)業(yè)大學，吉林 長春 130118；4.吉林省現(xiàn)代中藥及生物制藥基地建設辦公室，吉林 長春 130041)

歐前胡素和異歐前胡素屬于6,7-呋喃香豆素類化合物，是中藥白芷的主要藥效成分。為了考察二者的經(jīng)皮滲透特性，采用改進型的Franz擴散池，以大鼠離體皮膚作為滲透屏障，以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法測定白芷提取液的經(jīng)皮滲透液中歐前胡素和異歐前胡素的含量，據(jù)此來考察白芷提取液中歐前胡素和異歐前胡素的經(jīng)皮滲透特性。實驗結(jié)果表明，歐前胡素和異歐前胡素在48 h內(nèi)，單位面積的累積滲透量分別為116.11 μg/cm2和140.84 μg/cm2，累積滲透百分率分別為37.75%和71.86%。歐前胡素的穩(wěn)態(tài)滲透速率為26.5 μg/h·cm2，其體外經(jīng)皮滲透符合Higuchi方程。本研究闡明了歐前胡素的體外經(jīng)皮滲透機制，可為白芷作為外用經(jīng)皮給藥制劑的發(fā)展提供實驗依據(jù)和理論基礎。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)；白芷；歐前胡素；異歐前胡素；體外經(jīng)皮滲透；Higuchi方程

中藥白芷RadixAngelicaeDahuricae為傘形科植物白芷或杭白芷的干燥根，具有散風除濕、通竅止痛的功效，其有效成分主要是以歐前胡素和異歐前胡素為代表的香豆素類成分[1]。研究表明，歐前胡素和異歐前胡素均具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、平喘等作用[2-4]，除此之外，異歐前胡素還具有明顯的抗腫瘤作用[5]。白芷在外用制劑中有廣泛的應用，如：白芷散敷貼用于治療足跟痛[6]；用于治療痤瘡等皮膚疾病的東風痤康凝膠劑處方中的主要成分含有白芷，主要起祛風除濕、利血脈、消腫生肌等作用[7]；用于燒傷、燙傷的白芷燒傷酊，通過臨床驗證證明其具有抗感染、止血、收斂等療效，能縮短病程[8]；除此之外，白芷還具有美容功效，外用可以治療黃褐斑、白癜風、痤瘡等多種皮膚疾病[9]。因此，考察白芷提取液中歐前胡素和異歐前胡素的經(jīng)皮滲透能力對于開發(fā)利用含白芷的經(jīng)皮給藥制劑具有重要意義。

目前，中藥化學成分的分析方法主要有薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)等，但由于中藥存在成分復雜、分離困難、某些成分含量低等問題，傳統(tǒng)的TLC、LC方法有時很難對其成分進行測定和分析。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC/MS)是近年來發(fā)展起來的一門綜合性分析技術(shù)，它既具有液相色譜對復雜樣品較強的分離能力，又具有質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性以及能夠提供相對分子質(zhì)量和豐富結(jié)構(gòu)信息的特征，可彌補傳統(tǒng)技術(shù)分析樣品時的局限，已成為現(xiàn)代分析手段中必不可少的組成部分和藥物研究中強有力的工具[10]?；贖PLC/MS技術(shù)發(fā)展起來的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(HPLC-MS/MS)，其中的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的工作原理是根據(jù)待測化合物母離子質(zhì)量數(shù)與碎片離子質(zhì)量數(shù)，選擇母離子-子離子對，允許符合要求的子離子進入碰撞室，碰撞結(jié)束后，只記錄設定子離子信號，通過母粒子與子離子的兩次選擇，去除干擾離子，以此來降低化學背景，提高靈敏度[11]。近年來，串聯(lián)質(zhì)譜已成為一種成熟的技術(shù)，在許多領域特別是在中藥學領域發(fā)揮了巨大作用。

目前，已有采用HPLC法測定白芷透皮滲透液中歐前胡素含量的研究[12-14]，但還未見關(guān)于HPLC-MS/MS測定透皮滲透液中歐前胡素和異歐前胡素含量的報道。本研究擬采用HPLC-MS/MS 法測定白芷提取液的透皮滲透液中歐前胡素和異歐前胡素的含量，考察二者的體外經(jīng)皮滲透特性，希望為含有白芷的經(jīng)皮制劑的藥效物質(zhì)基礎研究以及制劑質(zhì)量標準的建立提供理論支撐和可行性依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器

Xevo-TQ三重四極桿質(zhì)譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品，配備Acquity UPLC系統(tǒng)，Waters Masslynx V4.1數(shù)據(jù)工作站；Sanorius BS110S分析天平：北京賽多利斯有限公司產(chǎn)品；ZTY智能透皮吸收儀：鞏義市予華儀器有限責任公司產(chǎn)品；KQ-500DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

白芷：購自長春市宏檢大藥房，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學王淑敏教授鑒定；歐前胡素對照品(批號：140602)、異歐前胡素對照品(批號：140327)：純度均為98%，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品；甲醇(色譜純)：美國Thermo-Fisher公司產(chǎn)品。

1.3 實驗動物

7只清潔級SD大鼠，雄性，其質(zhì)量為(200±20) g，由吉林大學實驗動物中心提供。

1.4 實驗條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水溶液(80∶20，V/V)；流速：0.8 mL/min；柱溫：35 ℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源，正離子模式(ESI+)，多反應監(jiān)測模式(MRM)；毛細管電壓4.0 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣：N2，溫度500 ℃，流速650 L/h；錐孔氣流速50 L/h；碰撞氣：氬氣，壓力0.15 Pa。歐前胡素和異歐前胡素的裂解電壓、碰撞能量以及掃描離子片段列于表1。

1.5 白芷提取液的制備與測定

1.5.1 白芷提取液的制備 稱量250 g白芷，粉碎成細粉，混合均勻，加入8倍質(zhì)量濃度為80%(體積分數(shù))的乙醇回流提取2次，每次2 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至相對密度為1.0～1.2(50 ℃)，即得白芷提取液。

1.5.2 白芷提取液中化學成分含量的測定

取1 mL制得的白芷提取液，于50 ℃烘箱中烘干，然后加入1 mL甲醇，超聲溶解，過0.45 μm濾膜，即得待測液。以HPLC-MS/MS法測得白芷提取液中歐前胡素的含量為2.2 g/L，異歐前胡素的含量為0.98 g/L。

表1 歐前胡素和異歐前胡素的多反應監(jiān)測條件Table 1 HPLC-MS/MS MRM conditions of imperatorin and isoimperatorin

1.6 透皮吸收實驗

1.6.1 經(jīng)皮吸收擴散裝置 經(jīng)皮吸收擴散裝置由上下兩室對合而成，上室為擴散室，下室為接受室，將皮膚固定于兩室中間。在接受室的側(cè)部連有一個取樣管，供取樣、補充接受液和排除氣泡用，滲透面積為1.13 cm2，實驗中以多功能電磁攪拌器維持接受室動態(tài)環(huán)境，實驗溫度維持(37.0±0.5) ℃。

1.6.2 離體鼠皮的制備 取(200±20) g的雄性大鼠，用脫毛膏脫毛，然后處死動物，分離腹部皮膚，小心剝離皮下脂肪，用生理鹽水反復洗凈，備用。

1.6.3 實驗方法 將處理好的動物皮膚固定在滲透擴散裝置的擴散室與接受室之間，在接受室中注入20.0 mL生理鹽水，液面恰與皮膚內(nèi)層接觸且沒有氣泡。開動電磁攪拌器，保持恒溫下恒速攪拌，取0.05 mL已制備的白芷提取液涂于皮膚上，用保鮮膜封口，分別在1、2、4、8、12、24 h取1.0 mL樣品于小瓶中，每次取樣后均立即補加相同體積的新鮮生理鹽水，并排除接受室中的氣泡，計算每次實驗的單位面積累積滲透量(Q)。

1.6.4 透皮接收液的處理 將裝有透皮接收液的小瓶于50 ℃烘箱烘干，加入1 mL甲醇超聲溶解，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，然后采用HPLC-MS/MS法測定濾液中的歐前胡素、異歐前胡素的含量，按式(1)計算單位面積的累積滲透量Q(μg/cm2)。

Q=(CnV+Vr∑Cp)/A

(1)

式中，Cn為第n個取樣點實際測得的藥物濃度(g/L)；∑Cp為該取樣點前各點的藥物測定濃度之和(g/L)；V為接受液的體積(mL)；Vr為取樣體積(mL)；A為滲透面積(cm2)。

2 結(jié)果與討論

2.1 歐前胡素和異歐前胡素定性、定量信息的確定

將濃度為10 mg/L的歐前胡素、異歐前胡素標準溶液分別以直接進樣的方式注入質(zhì)譜儀中，在m/z50～300掃描范圍內(nèi)，以正離子模式對其進行一級質(zhì)譜全掃描，以確定歐前胡素、異歐前胡素分子的[M+H]+峰；以分子離子峰為母離子，對離子源參數(shù)進行優(yōu)化，使質(zhì)譜儀的測定靈敏度達到最高；然后在一定的碰撞能量下對歐前胡素、異歐前胡素的子離子進行全掃描，以確定其主要的離子碎片，其二級質(zhì)譜掃描圖示于圖1。由圖1可見，歐前胡素、異歐前胡素均可產(chǎn)生m/z147.05和m/z203.04兩個主要的碎片離子，結(jié)合樣品空白基質(zhì)的質(zhì)譜圖選取離子豐度最高、本底干擾最小的m/z271. 1→203.04為定量離子對，m/z271. 1→147. 05為定性離子對。

圖1 歐前胡素(a)和異歐前胡素(b)準分子離子[M+H]+的子離子全掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Full scan product ion spectra of imperatorin (a) and isoimperatorin (b) parent ion [M+H]+

2.2 方法學考察

2.2.1 專屬性考察 分別取空白透皮接收液、歐前胡素對照液、異歐前胡素對照液、白芷提取液、白芷透皮接收液，按照1.4節(jié)條件進行測定。歐前胡素的保留時間約為6.72 min，異歐前胡素的保留時間約為10.36 min，空白透皮接收液中未檢測到歐前胡素和異歐前胡素。各樣品的HPLC-MS/MS色譜圖示于圖2。

注：a.空白透皮接收液；b.歐前胡素對照液；c.異歐前胡素對照液；d.白芷提取液；e.白芷透皮接收液圖2 5種樣品溶液的HPLC-MS/MS色譜圖Fig.2 HPLC/MS/MS chromatograms of 5 samples

2.2.2 標準曲線的制備 將1 g/L的對照品儲備液用甲醇逐級稀釋，得到系列對照品溶液，其中歐前胡素的質(zhì)量濃度分別為0.001、0.0025、0.01、0.05、0.1、0.2、1 mg/L；異歐前胡素的質(zhì)量濃度分別0.001、0.002 5、0.01、0.02、0.05、0.1、1 mg/L。按照1.4節(jié)條件進行測定。分別以歐前胡素、異歐前胡素的峰面積(y)為縱坐標，歐前胡素、異歐前胡素的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標，進行線性回歸，得到線性方程；向空白透皮接收液中添加對照品，分別以10倍信噪比(S/N=10)和3倍信噪比(S/N=3)計算歐前胡素和異歐前胡素的方法定量限(LOQ)和方法檢出限(LOD)。結(jié)果表明，歐前胡素和異歐前胡素在0.001～1 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限結(jié)果列于表2。

表2 HPLC-MS/MS方法的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients (r2), limits of detection (LOD) and limits of quantitation (LOQ) of HPLC-MS/MS

2.2.3 精密度、穩(wěn)定性、重復性和加樣回收率的考察 通過對歐前胡素和異歐前胡素進行精密度、穩(wěn)定性(24 h內(nèi))、重復性(日內(nèi)重復性和日間重復性)實驗，結(jié)果表明，歐前胡素和異歐前胡素的精密度、穩(wěn)定性RSD值均小于2%，說明本方法精密度良好，且在24 h內(nèi)供試品溶液保持穩(wěn)定。

重復性實驗結(jié)果顯示，歐前胡素和異歐前胡素的日內(nèi)重復性RSD值均小于2%，日間重復性RSD值均小于4% ，說明本方法的重復性良好。

歐前胡素和異歐前胡素的加樣回收率實驗結(jié)果分別列于表3、表4。

表3 歐前胡素的加樣回收率(n=6)Table 3 Recoveries of imperatorin (n=6)

表4 異歐前胡素的加樣回收率(n=6)Table 4 Recoveries of isoimperatorin (n=6)

2.2.4 基質(zhì)效應的考察 配制高、中、低(20、40、80 g/L)3個濃度的歐前胡素和異歐前胡素標準樣品各20 μL，置于小EP管中。分別以180 μL基質(zhì)(空白透皮接收液)和甲醇作為溶劑稀釋，渦旋混合均勻，制得加入基質(zhì)組和未加基質(zhì)組樣品溶液，每個濃度各做3個樣本。將加入基質(zhì)的標準樣品濃度與未加基質(zhì)的標準樣品濃度檢測結(jié)果相比，如果比值為1，證明基質(zhì)無影響，否則說明存在基質(zhì)效應。實驗結(jié)果顯示，歐前胡素高、中、低組的基質(zhì)效應分別為0.95±0.05、1.04±0.14、0.99±0.11；異歐前胡素高、中、低組的基質(zhì)效應分別為1.07±0.08、1.04±0.10、1.05±0.05，比值都接近1，說明基質(zhì)對歐前胡素和異歐前胡素檢測的影響很小，不影響其準確測定。

2.3 透皮實驗結(jié)果

分別以單位面積累積滲透量Q、累積滲透百分率Q%為縱坐標，以時間t為橫坐標，繪制48 h內(nèi)Q-t滲透動力學曲線，示于圖3。

注：a.歐前胡素Q-t曲線；b.異歐前胡素Q-t曲線；c.歐前胡素Q%-t曲線；d.異歐前胡素Q%-t曲線 圖3 歐前胡素和異歐前胡素的Q-t、Q%-t滲透動力學曲線(n=3)Fig.3 Q-t and Q%-t permeation kinetics curves of imperatorin and isoimperatorin (n=3)

由圖3可知，歐前胡素在1 h后即開始經(jīng)皮滲透,而異歐前胡素在12 h后才開始。在48 h處，歐前胡素的累積滲透百分率為37.75%，而異歐前胡素的累積滲透百分率為71.86%。該結(jié)果說明，異歐前胡素經(jīng)皮滲透雖然開始的時間較晚，但其48 h的累積滲透百分率遠遠高于歐前胡素。

對歐前胡素的體外經(jīng)皮滲透行為分別進行零級方程、一級方程和Higuchi方程擬合，其結(jié)果列于表5。

累積滲透量采用式(1)計算，穩(wěn)態(tài)滲透速率為最優(yōu)擬合方程的斜率，滯后時間為Q=0時計算得到的t值。經(jīng)計算，歐前胡素的各體外滲透相關(guān)參數(shù)列于表6。

表5 歐前胡素的體外經(jīng)皮滲透行為的擬合方程(n=3)Table 5 In vitro cumulative release fitting equation of imperatorin

表6 歐前胡素的體外滲透相關(guān)參數(shù)Table 6 Relative parameters of imperatorin in vitro

由表5中相關(guān)系數(shù)的大小可知，歐前胡素的體外經(jīng)皮滲透行為更接近于Higuchi方程(r=0.982 3)。表6中體外滲透各相關(guān)參數(shù)反應了歐前胡素的經(jīng)皮滲透特點，穩(wěn)態(tài)滲透速率反應了歐前胡素的經(jīng)皮滲透速度，滯后時間則表明歐前胡素在大鼠皮膚滯留的時間，說明其在0.233 5 h以后開始經(jīng)皮滲透。

3 結(jié)論

本實驗采用HPLC-MS/MS 法考察白芷提取液中歐前胡素和異歐前胡素的經(jīng)皮滲透能力。結(jié)果表明，二者均具有經(jīng)皮滲透的能力，歐前胡素的經(jīng)皮滲透起始時間明顯早于異歐前胡素，但在檢測的48 h中，異歐前胡素的累積滲透百分率遠遠高于歐前胡素。歐前胡素和異歐前胡素的累積滲透量均隨時間的延長而增加，兩種成分的累積滲透量在48 h后仍未完全達到穩(wěn)態(tài)，表明歐前胡素和異歐前胡素具有經(jīng)皮給藥釋藥緩慢的特點。歐前胡素的釋藥曲線經(jīng)擬合后與Higuchi模型基本吻合，表明其釋放主要遵循擴散控制機理，能以穩(wěn)定速率釋放。本實驗可為后續(xù)將歐前胡素和異歐前胡素制成經(jīng)皮給藥制劑提供理論基礎和可行性依據(jù)。

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In Vitro Percutaneous Permeability of Imperatorin and Isoimperatorin inRadixAngelicaeDahuricaeby Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Lin1, PI Zi-feng2, SUN Yun-xia1, LIU Zhi-qiang2, SONG Feng-rui2, HU Xiu-li1, HAN Hong-xiang3,4

(1.SchoolofPharmaceuticalSciences,JilinUniversity,Changchun130021,China;2.NationalCenterforMassSpectrometryinChangchun,JilinProvinceKeyLaboratoryofChineseMedicineChemistryandMassSpectrometry,Changchun130022,China;3.JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 4.JilinProvinceTraditionalChineseMedicineOffice,Changchun130041,China)

Imperatorin and isoimperatorin are 6,7-furocoumarin compounds, which are the major medicinal effective ingredients ofRadixAngelicaeDahuricae. Coumarin compounds are widely used in topical formulations because it has many properties, such as anti-bacterial, anti-inflammatory, antipyretic and analgesic effects. At present, the chemical components of traditional Chinese medicine are mainly analyzed by thin layer chromatography (TLC), gas chromatography (GC) and high performance liquid chromatography (HPLC). However, because there are some difficulties in Chinese medicine analysis, such as complex composition, difficulty in separation and low content, traditional methods (TLC, HPLC, etc.) were difficult to determine and analyze the composition sometimes. HPLC/MS is a comprehensive technique, it has become an important modern separation and analysis technique because of its high separation ability, high sensitivity, wide application range and strong specificity. Tandem mass spectrometry (MS/MS) has higher sensitivity and selectivity than unipolar mass spectrometry and can obtain more structural information. In this study, the in vitro percutaneous permeability of imperatorin and isoimperatorin inRadixAngelicaeDahuricaelextracting solution was evaluated by the modified Franz diffusion cell with isolated rat skin. The content of imperatorin and isoimperatorin was determined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The chromatographic conditions were as follows: Dimonsil C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), the temperature of column is 35 ℃, mobile phase was methanol-water (80∶20,V/V) and flow rate was 0.8 mL/min. A tandem mass spectrometer coupled with positive electro-spray ionization (ESI) source was used for detection. The quantitative and qualitative analysis were performed on selective ion chromatograms acquired by a multiple reaction monitoring (MRM) mode of following transitions:m/z271.1→m/z203.04,m/z271.1→m/z147.05. The results showed that the limits of detection (LODs) of imperatorin and isoimperatorin were 0.01 and 1 μg/L, and the limits of quantification (LOQs) of imperatorin and isoimperatorin were 0.25 and 2 μg/L, respectively. Calibration curves were linear over the range of 0.001-1 mg/L for imperatorin and isoimperatorin. Both the inter-day and intra-day reproducibility (RSDs) were lower than 4%, the precision and stability of the method were lower than 2%, which indicated that the method has good precision, and the test solution could keep steady within 24 h. The mean recoveries of imperatorin and isoimperatorin were 98.09% and 100.60%. The cumulative permeation amounts of imperatorin and isoimperatorin were 116.11 μg/cm2and 210.06 μg/cm2and the percentage of cumulative permeation were 37.75% and 71.86%, respectively. The steady state permeation rate of imperatorin was 26.5 μg/h·cm2and its in vitro percutaneous permeabilities was conformed to Higuchi equation. This study clarified the percutaneous permeation mechanism of imperatorin in vitro and provided a theoretical basis for the development ofRadixAngelicaeDahuricaeas a topical transdermal preparation.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS); imperatorin; isoimperatorin;RadixAngelicaeDahuricae; in vitro percutaneous permeability; Higuchi equation

2016-08-16;

2016-11-23

吉林省科技發(fā)展計劃項目(20140311096YY)資助

張 琳(1991—)，女(漢族)，吉林四平人，碩士研究生，藥學專業(yè)。E-mail: zhanglin14@mails.jlu.edu.cn

皮子鳳(1978—)，女(漢族)，山西運城人，副研究員，從事中藥活性成分篩選及代謝研究。E-mail: mslab21@ciac.ac.cn；韓紅祥(1983—)，男(漢族)，吉林長嶺人，助理研究員，從事中藥有效成分的分析研究。E-mail: hanhongxiang@163.com

O657.63

A

1004-2997(2017)01-0037-08

10.7538/zpxb.2017.38.01.0037