人參莖葉提取物及配伍石菖蒲揮發(fā)油的大鼠在體腸吸收動(dòng)力學(xué)的研究

鄭夢(mèng)成+杜守穎+賈山+馬軍明+張晴+白潔+陸洋

[摘要]該試驗(yàn)通過(guò)研究復(fù)方金思維方中君藥人參莖葉提取物配伍使藥石菖蒲揮發(fā)油后有效成分人參皂苷 Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd腸吸收的變化，驗(yàn)證該方中佐藥石菖蒲能否協(xié)助君藥人參莖葉總皂苷加強(qiáng)其療效。試驗(yàn)采用大鼠在體單向腸吸收模型考察3種皂苷成分及配伍石菖蒲揮發(fā)油后的腸吸收情況，以高效液相色譜法測(cè)定灌流液中人參皂苷 Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd的質(zhì)量濃度，計(jì)算其腸吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)；人參莖葉提取物中人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd在小腸上段吸收速率較大；藥物濃度對(duì)其吸收速率沒有顯著性影響，提示吸收機(jī)制為被動(dòng)擴(kuò)散；石菖蒲揮發(fā)油對(duì)其在小腸的吸收有顯著促進(jìn)作用，說(shuō)明方中人參皂苷提取物與石菖蒲的配伍科學(xué)合理。

[關(guān)鍵詞]人參莖葉提取物； 石菖蒲； 在體單向腸吸收

[Abstract]To investigate the changes in intestinal absorption of ginsenosides Rg1， ginsenosides Re and ginsenosides Rd after combined administration of Ginseng Radix et Rhizoma extract and Acori Tatarinowii Rhizoma， in order to confirm whether the combined administration is scientific and rational， and provide experimental basis for pharmaceutical studies of the formula. Anin vivosingle-pass perfusion method was performed to study the effect of various concentrations of ginsenosides Rg1， ginsenosides Re， ginsenosides Rd on the intestinal absorption at duodenum， jejunum， ileum and colon. The concentrations of ginsenosides Rg1， ginsenosides Re， ginsenosides Rd were determined by RP-HPLC.The absorption rate constant （Ka） and the apparent absorption coefficient（Papp） of ginsenosides Rg1， ginsenosides Re， ginsenosides Rd were calculated.The result showed that ginsenosides Rg1， ginsenosides Re， ginsenosides Rd had a high absorption rate on upper portion of the small intestine. The drug concentration had not significantly impact on the absorption rate， suggesting that ginsenosides Rg1， ginsenosides Re， ginsenosides Rd were absorbed via passive diffusion.Volatile oil of Acori Tatarinowii Rhizoma had obvious effect in enhancing intestinal absorption of ginsenosides Rg1， ginsenosides Re， ginsenosides Rd， indicating that the combined administration of Ginseng extract and Acorus tatarinowii Schott is scientific and rational.

[Key words]extracts of Ginseng Radix et Rhizoma； Acori Tatarinowii Rhizoma；in vivosingle-pass perfusion method

doi：10.4268/cjcmm20162124

中醫(yī)方劑中有使用“藥引子”的歷史，即在君臣配伍時(shí)添加使藥作為“藥引”起到“引藥上行”“助藥效”之作用，而芳香類中藥因其辛香走竄之性多作為使藥應(yīng)用到臨床組方中，如冰片、石菖蒲等。復(fù)方金思維來(lái)源于臨床經(jīng)驗(yàn)方，主要以人參莖葉提取物配伍石菖蒲治療老年癡呆癥。人參莖葉具有大補(bǔ)元?dú)?、安神益?sup>[1]之功效，為方中君藥。人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd是人參的主要活性成分，現(xiàn)代研究表明其具有改善記憶功能^[2]、抗腫瘤抗衰老^[3-4]、抗菌抗病毒^[5]、促進(jìn)細(xì)胞增殖^[6]等作用。其腸道吸收受其自身性質(zhì)、胃腸道酸性環(huán)境、場(chǎng)內(nèi)菌群、肝臟首過(guò)效應(yīng)等多重因素的影響，口服生物利用度很低^[7-10]。石菖蒲為方中使藥，具有芳香開竅、引藥上行的作用，揮發(fā)油是其有效成分?，F(xiàn)代研究表明其在治療阿爾茨海默病方面具有確切療效^[11-12]，對(duì)腦自由基損傷有保護(hù)作用，并提高血腦屏障通透性。人參莖葉提取物配伍石菖蒲后能否改善有效成分的腸吸收情況，是處方設(shè)計(jì)的重要依據(jù)。

課題組前期對(duì)復(fù)方金思維的藥效學(xué)研究，確定了最佳提取工藝，并根據(jù)臨床給藥的需要制成顆粒劑。對(duì)于口服給藥劑型來(lái)說(shuō)，藥物的腸吸收特性能直接反應(yīng)口服后的吸收效果。因此本文擬根據(jù)處方配比，采用大鼠在體腸吸收模型研究人參莖葉提取物及配伍石菖蒲后有效成分的吸收動(dòng)力學(xué)特征探討人參莖葉提取物中人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd的吸收機(jī)制及配伍石菖蒲后的腸吸收變化情況，旨在為復(fù)方金思維的制劑研制提供生物藥劑學(xué)依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260高效液相色譜儀；DDB-300電子蠕動(dòng)泵（上海之信儀器有限公司）；TGL-16G飛鴿離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；VORTEX-5旋渦混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；賽多利斯 BSA 224S型電子分析天平（北京賽多利斯公司）。

人參皂苷Rg1對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110703-201430）；人參皂苷Re對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110754-201425）；人參皂苷Rd對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111818-201302）；人參莖葉提取物（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；石菖蒲揮發(fā)油（處方量石菖蒲經(jīng)水蒸氣蒸餾，至油量不再增加）；乙腈（Sigma，色譜純），甲醇（Sigma，色譜純），娃哈哈純凈水，其他試劑為分析純。

SD大鼠，雄性，220～240 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)SCXK（京）2012-0001。

2 方法

2.1 試液配制

2.1.1 Krebs-Ringers營(yíng)養(yǎng)液的配制 參考文獻(xiàn)[13]配制Krebs-Ringers營(yíng)養(yǎng)液。

2.1.2 腸循環(huán)液的配制 灌流液A：分別精密稱取人參莖葉提取物125，250，500 mg于250 mL量瓶中，K氏液溶解并稀釋至刻度，作為低、中、高濃度的藥物腸灌流液。

灌流液B：精密稱取人參莖葉提取物250 mg于250 mL量瓶中，另取50 μL石菖蒲揮發(fā)油，用50 μL乙醇溶解后加入量瓶中，K氏液溶解并稀釋至刻度，作為石菖蒲揮發(fā)油配伍中濃度人參莖葉提取物的腸灌流液。

2.1.3 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制 精密稱取人參皂苷Rg1 10 mg，人參皂苷Re 15 mg，人參皂苷Rd 10 mg，置25 mL量瓶中，用K氏液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2 灌流液樣品處理方法

吸取灌流液1 mL，加入甲醇3 mL沉淀蛋白，吸取上清液，氮?dú)獯蹈桑? mL甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

2.3 腸灌流液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 CAPCELL PAK C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫，0～28 min，20% A，28～58 min，20%～39% A，58～60 min，39% A；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；柱溫30 ℃；流速1.5 mL·min^-1。對(duì)照品溶液及灌流供試品溶液的色譜圖見圖1。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rd對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5，1，2，4，6，8 mL于10 mL量瓶中，用空白腸灌流液稀釋并定容至刻度，分別得到一系列質(zhì)量濃度的人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rd對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下方法處理，測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸。人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd的回歸方程分別為Y=1.338 2X-2.030 3，r=0.999 9；Y=1.390 3X-2.706 9，r=0.999 9；Y=1.92X-4.720 1，r=0.999 9。表明人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd分別在20.26～405.20，25.02～500.40，20.26～405.20 mg·L^-1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 分別精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd對(duì)照品適量，用空白腸灌流液稀釋至不同倍數(shù)，得低、中、高（人參皂苷Rg1依次為81.04，162.08，324.16 mg·L^-1，人參皂苷Re依次為100.08，200.16，400.32 mg·L^-1，人參皂苷Rd依次為81.04，162.08，324.16 mg·L^-1）3個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下方法處理，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，低濃度組人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd的RSD分別為1.4%，1.2%，0.40%，中濃度組RSD分別為1.5%，2.0%，1.1%，高濃度組RSD分別為0.40%，0.50%，0.80%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 回收率試驗(yàn) 取大鼠空白腸液1 mL，分別加入1 mL低、中、高濃度的人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下方法處理分析測(cè)定，計(jì)算回收率，低濃度組人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd分別為96.61%，97.26%，96.38%，中濃度組分別為98.22%，98.68%，97.91%，高濃度組分別為96.37%，96.48%，96.78%，RSD均小于5.0%，符合藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)要求。

2.4 人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd在空白腸灌流液中的穩(wěn)定性研究

用空白腸灌流液配制 1.0 g·L^-1的人參莖葉提取物溶液3 份，37 ℃水浴孵育4 h，分別于0，0.5，1，2，3，4 h取樣，按2.2項(xiàng)下方法處理，分析比較不同時(shí)間的濃度變化。結(jié)果在37 ℃水浴中放置4 h，樣品中人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd的RSD分別為1.1%，1.3%，1.5%，灌流液樣品基本穩(wěn)定（RSD<3.0%）。

2.5 蠕動(dòng)泵管路的物理吸附情況考察

以灌流液A，37 ℃水浴恒溫，于體外空循環(huán)3 h，在0，0.25，0.5，1，2，3 h取樣測(cè)定，考察人參Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd在蠕動(dòng)泵管路的吸附情況。結(jié)果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd的RSD分別為0.50%，0.20%，1.7%，說(shuō)明管路對(duì)樣品中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd沒有吸附（RSD<3.0%）。

2.6 大鼠在體單向腸灌流試驗(yàn)

大鼠手術(shù)^[14]后，以37 ℃預(yù)熱的生理鹽水以1 mL·min^-1沖凈腸內(nèi)容物，排凈生理鹽水，用預(yù)熱37 ℃的灌流液以0.2 mL·min^-1灌流30 min平衡，收集流出液并開始計(jì)時(shí)，于15，30，45，60，75 min收集灌流液，并精確稱量流出液質(zhì)量。試驗(yàn)結(jié)束后，參考文獻(xiàn)方法^[14]測(cè)量腸段長(zhǎng)度及內(nèi)徑。

2.7 吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算

參考文獻(xiàn)[14]采用重量法計(jì)算藥物吸收速率常數(shù)Ka和表觀吸收系數(shù)Papp。

2.8 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），當(dāng)P<0.05時(shí)判定具有顯著性差異。

3 結(jié)果

用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA檢驗(yàn)，結(jié)果表明在0.5～2.0 g·mL^-1，藥物質(zhì)量濃度對(duì)人參莖葉提取物中人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd在小腸的吸收速率沒有顯著性影響，吸收機(jī)制為被動(dòng)擴(kuò)散。人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd在各腸段的吸收速率常數(shù)大小：十二指腸≈結(jié)腸>空腸≈回腸，表明其在小腸上端吸收較好。配伍石菖蒲揮發(fā)油后，可使人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd的Ka分別增加7.8，6.3，3.8倍，表明石菖蒲揮發(fā)油對(duì)其小腸吸收有明顯的促吸收效果，見表1～4。

4 討論

復(fù)方金思維是中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)方，治療老年癡呆癥療效顯著。人參莖葉提取物為方中君藥，石菖蒲為使藥。配伍石菖蒲后能否改善方中主要有效成分人參莖葉皂苷的腸道吸收是本研究的主要內(nèi)容。

本試驗(yàn)首先采用大鼠在體單向腸灌流模型對(duì)人參莖葉提取物單味組吸收動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行了初步探究，證實(shí)人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd的腸內(nèi)吸收機(jī)制為被動(dòng)擴(kuò)散，提示可將含人參皂苷Rg1，Re，Rd的藥物設(shè)計(jì)成藥物緩釋系統(tǒng)，且在小腸上端吸收較好的成分可以通過(guò)靶向給藥技術(shù)（如漂浮、黏附滯留技術(shù)等）提高制劑的生物利用度。

人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd是君藥人參莖葉的主要成分，石菖蒲揮發(fā)油是方中使藥石菖蒲的主要成分，文獻(xiàn)報(bào)道，中藥揮發(fā)性成分對(duì)相伍成分的吸收及生物利用度存在不同程度的影響^[15]，多有促透劑的作用，能促進(jìn)其他藥物成分的吸收^[16]。本試驗(yàn)利用大鼠在體腸灌流模型考察配伍石菖蒲后人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd在小腸不同腸段的吸收情況，試驗(yàn)結(jié)果顯示，石菖蒲對(duì)人參皂苷Rg1，Re，Rd的小腸吸收具有明顯的促進(jìn)作用，這符合文獻(xiàn)結(jié)果的推斷，也驗(yàn)證了復(fù)方金思維配伍的合理性。究其作用機(jī)制，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明^[17]芳香開竅藥不僅自身具有良好的細(xì)胞通透性，還能促進(jìn)其他藥物在某些器官組織的細(xì)胞通透性。另外，胡園等^[18]證實(shí)了石菖蒲作為使藥可“醒腦開竅”的藥理作用，其作用機(jī)制是使內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接松弛，導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，因而可以提高腦組織中配伍藥物的含量。該研究提示石菖蒲促進(jìn)人參皂苷在腸道的吸收機(jī)制也可能與此類似，石菖蒲可能通過(guò)調(diào)節(jié)胃腸道多肽激素或緊密連接蛋白，使胃腸壁細(xì)胞間緊密連接松弛，通透性增加，從而促進(jìn)藥物胃腸道運(yùn)動(dòng)、透過(guò)和吸收。本文只對(duì)石菖蒲揮發(fā)油對(duì)人參皂苷Rg1，Re，Rd的促腸道吸收作用做了初步探討，其確切的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究的推進(jìn)。

同時(shí)，本試驗(yàn)結(jié)果表明，石菖蒲揮發(fā)油對(duì)于3種皂苷成分促吸收作用的程度不同，具體表現(xiàn)為對(duì)于人參皂苷Rg1，Re（人參三醇型）促吸作用較人參皂苷Rd（人參二醇型）稍大，推測(cè)可能與其母核結(jié)構(gòu)有關(guān)，也與其代謝后產(chǎn)物的種類與性質(zhì)有關(guān)。皂苷類成分在體內(nèi)并不是完全以原形吸收，必然受到酸堿環(huán)境，胃腸道菌群，肝臟代謝的影響而發(fā)生一系列降解和變化^[7-10]，而關(guān)于石菖蒲揮發(fā)油的促吸收作用在3種皂苷成分中顯示出差異的原因，還有待進(jìn)一步的深入研究。

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[責(zé)任編輯 曹陽(yáng)陽(yáng)]