細(xì)菌性軟腐菌對人參根系分泌物中糖類和氨基酸類的化學(xué)趨向性響應(yīng)

張愛華+安寧波+雷鋒杰+馬文麗+匙坤+張連學(xué)

[摘要]采用毛細(xì)管法測定了人參細(xì)菌性軟腐菌在4種趨化參數(shù)（濃度、時間、溫度和pH）下對不同氨基酸和糖的趨向性響應(yīng)。與對照組結(jié)果顯示，賴氨酸趨化率為2.509 7（pH 8，質(zhì)量濃度為0.025 mg· L^-1、培養(yǎng)溫度為25 ℃、培養(yǎng)時間為60 min），精氨酸趨化率為2.218 8（pH 6、質(zhì)量濃度為0.25 mg· L^-1、培養(yǎng)溫度為25 ℃、培養(yǎng)時間為60 min），L-鼠李糖趨化率為3.091 2（pH 7、質(zhì)量濃度為0.25 mg· L^-1、培養(yǎng)溫度為30 ℃、培養(yǎng)時間為60 min）和D-阿拉伯糖趨化率為3.026 3 （pH 6、質(zhì)量濃度為0.25 mg· L^-1、培養(yǎng)溫度為30 ℃、培養(yǎng)時間為45 min）。糖類和氨基酸類對人參細(xì)菌性軟腐菌有明顯的趨化作用，且高濃度的氨基酸和糖對人參細(xì)菌性軟腐菌的化學(xué)趨向性有抑制作用，但趨化作用隨濃度的減弱反而增加。

[關(guān)鍵詞]人參； 氨基酸； 糖； 細(xì)菌性軟腐菌； 化學(xué)趨向性

[Abstract]The chemotaxis response ofErwinia carotovora to different sugars and amino acids in four kinds of chemotactic parameters （concentration， time， temperature and pH ） was determined by capillary method. The results showed that when pH was 8， concentration was 0.025 mg·L^-1， culture temperature was 25 ℃ and the duration was 60 minutes， the optimal chemotaxis rate of lysine was 2.509，when pH was 6， concentration was 0.25 mg·L^-1， culture temperature was 25 ℃ and the duration was 60 minutes， the optimal chemotaxis rate of arginine was 2.218 8，when pH was 7， concentration was 0.25 mg·L^-1， culture temperature was 30 ℃ and the duration was 60 minutes， the optimal chemotaxis rate of L-rhamnose was 3.091 2， when pH was 6， concentration was 0.25 mg·L^-1， culture temperature was 30 ℃ and the duration was 45 minutes， the optimal chemotaxis rate of D-arabinose was 3.026 3. Sugars and amino acids had obvious chemotaxis withE. carotovora，the high concentration of carbohydrate and amino acid exited an inhibitory effect on chemotaxis response ofE. carotovora， and the chemotaxis response decreased with the increase of concentration of carbohydrates and amino acids.

[Key words]Panax ginseng； amino acid； sugars；Erwinia carotovora； chemotaxis

doi：10.4268/cjcmm20162109

人參Panax ginseng C. A. Mey. 為五加科多年生宿根植物，是傳統(tǒng)名貴中藥材。人參病害是影響人參產(chǎn)量與質(zhì)量的一個重要因素。人參細(xì)菌性軟腐菌作為人參生長過程中的重要病害，長期危害著人參的根或莖基部，且防治困難^[1-2]。人參根系分泌的某些次生代謝物質(zhì)被視為根際微生物的基質(zhì)，作為化感因子調(diào)節(jié)植物與細(xì)菌不同種間的互作關(guān)系，在植物與環(huán)境互相作用中具有一定現(xiàn)實意義^[3]。根系分泌物中含有諸如糖、氨基酸等初生代謝物質(zhì)，其中至少有 10種糖和 25種氨基酸已得到鑒定^[4-5]，并對根際微生物的選擇性促進發(fā)揮著重要作用^[6-7]。甄文超等^[8]在研究草莓根系分泌物和腐解物中8種氨基酸的含量時發(fā)現(xiàn)，不同氨基酸對尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum和立枯絲核菌Rhizoctonia solani表現(xiàn)抑制或促進作用。韓麗梅等^[9]研究大豆連作土壤中有機物對大豆根腐病菌的影響時發(fā)現(xiàn)，土壤中糖類物質(zhì)對半裸鐮刀菌、粉紅粘帚菌、尖孢鐮刀菌的生長多表現(xiàn)低促高抑，而氨基酸和有機酸組分對3種病菌的生長多表現(xiàn)顯著的促進作用。陳子英等^[10]研究小麥根系分泌物中，含有14種氨基酸。楊靖春等^[11]首次從人參根系分泌物中發(fā)現(xiàn)人參十多種氨基酸和可溶性糖的存在，從人參根系分泌物對人參根際霉菌作用試驗中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)在10×10-6或10 mL時，分泌物對人參根際微生物中的各類霉菌，均表現(xiàn)出明顯地刺激作用，但這種作用并非依著分泌物濃度的增加而表現(xiàn)為等量的增加。

由人參根系分泌物產(chǎn)生的糖和氨基酸是否能引起人參病原微生物的化學(xué)趨向性響應(yīng)與之的相關(guān)因素以及作用機制等，尤其是在細(xì)菌方面目前未見相關(guān)報道。前期實驗室從人參根系分泌物中測得含有人參皂苷，天冬氨酸、賴氨酸、甘氨酸、異亮氨酸等15種氨基酸，鼠李糖、木糖、甘露糖、巖澡糖等7種糖，并以人參皂苷為化學(xué)驅(qū)動因子得出其對人參繡腐菌、人參黑霉菌等真菌有明顯的化學(xué)趨向性^[12]，細(xì)菌方面以及糖和氨基酸等驅(qū)動因子沒有進一步進行研究。作者前期以外源性糖類和氨基酸類選取賴氨酸、精氨酸、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖4種物質(zhì)，采用改進的毛細(xì)管法測定了人參細(xì)菌性軟腐菌對其化學(xué)趨向性響應(yīng)，以期為人參細(xì)菌性病害的深入研究以及藥用植物連作現(xiàn)象提供理論基礎(chǔ)。后續(xù)對木糖、甘露糖等糖類以及異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和半胱氨酸氨酸等氨基酸類進行研究。

1 材料

1.1 供試菌種 人參細(xì)菌性軟腐菌Erwinia carotovora subsp.carotovora （Jones） Bergey et al.取自吉林省人參工程技術(shù)研究中心，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)高潔教授鑒定。

1.2 供試藥品 賴氨酸（BR，純度99%）；精氨酸（BR，純度99%）；L-鼠李糖（High，純度98%）；D-阿拉伯糖（BR，純度98%）；氯化鈉（AR，上海源葉生物有限公司北京化工廠）；牛肉膏（BR）；蛋白胨（BR，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；瓊脂粉（H8145，上海稼豐園藝用品有限公司）。

1.3 培養(yǎng)基：牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基（g·L^-1）：牛肉膏 5.0，蛋白胨 10.0，NaCl 5.0，pH 7.2～7.4；固體培養(yǎng)基（g·L^-1）：牛肉膏 5.0，蛋白胨 10.0，NaCl 5.0，瓊脂15～20，pH 7.2～7.4。

2 方法

2.1 菌液的制備 將-70 ℃保存的菌種接種到牛肉膏-蛋白胨固體培養(yǎng)基上，于25 ℃條件下培養(yǎng)24 h。挑取單菌落于適量稀釋液（0.90% NaCl，pH 7.2）中，充分振蕩混勻后制成一定濃度的菌液（1×108 CFU·mL^-1），通過稀釋得到1×106 CFU·mL^-1的菌液，備用。

2.2 不同氨基酸和糖溶液的制備 對照組為無菌水；配制賴氨酸、精氨酸、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖溶液的質(zhì)量濃度分別為0.025，0.25，2.5，25 mg·L^-1，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，備用。

2.3 化學(xué)趨向性反應(yīng)試驗 采用改進的毛細(xì)管法進行化學(xué)趨向性反應(yīng)試驗^[13]，玻璃毛細(xì)管（內(nèi)徑為0.5 mm）一端吸入待測趨化液，另一端用熱熔膠封閉。將毛細(xì)管插入到含 500 μL 菌液的1 mL 注射器中，25 ℃下水平孵育 60 min。用無菌水沖毛細(xì)管外壁再用濾紙擦拭以去除附著的菌液，折斷毛細(xì)管后將內(nèi)含物轉(zhuǎn)入 EP 管中，加入 50 μL無菌水稀釋3倍，再將溶液吸出均勻涂抹在固體平板上，反復(fù)操作5次。平板于25 ℃下培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計5次重復(fù)試驗單菌落的平均個數(shù)。以毛細(xì)管中的細(xì)菌菌數(shù)來衡量人參細(xì)菌性軟腐菌化學(xué)趨向性響應(yīng)的大小。

2.4 不同濃度氨基酸和糖對人參細(xì)菌性軟腐菌化學(xué)趨向性的影響 將配制好的不同濃度的氨基酸和糖溶液按2.3的方法進行趨化試驗。

2.5 時間對人參細(xì)菌性軟腐菌化學(xué)趨向性的影響 在不同時間 （0，30，45，60，75 min） 下按2.3的方法進行趨化試驗（其中，賴氨酸為0.025 mg·L^-1，精氨酸、L-鼠李糖和D-阿拉伯糖為0.25 mg·L^-1）。

2.6 溫度對人參細(xì)菌性軟腐菌化學(xué)趨向性的影響 按2.3的方法測定不同溫度（15，20，25，30 ℃）下細(xì)菌對賴氨酸（質(zhì)量濃度0.025 mg·L^-1、培養(yǎng)時間 60 min）、精氨酸（質(zhì)量濃度為0.25 mg·L^-1、培養(yǎng)時間 60 min）、L-鼠李糖（質(zhì)量濃度為0.25 mg·L^-1、培養(yǎng)時間 60 min）、D-阿拉伯糖（質(zhì)量濃度0.25 mg·L^-1、培養(yǎng)時間 45 min）。

2.7 pH對人參細(xì)菌性軟腐菌化學(xué)趨向性的影響 按2.3的方法測定在不同pH（5，6，7，8）下按2.3的方法進行趨化實驗，其中賴氨酸（質(zhì)量濃度0.025 mg·L^-1、培養(yǎng)時間 60 min、培養(yǎng)溫度 25 ℃）；精氨酸（質(zhì)量濃度 0.25 mg· L^-1、培養(yǎng)時間 45 min、培養(yǎng)溫度 25 ℃）；L-鼠李糖（質(zhì)量濃度 0.25 mg·L^-1、培養(yǎng)時間 60 min、培養(yǎng)溫度 30 ℃）；D-阿拉伯糖（質(zhì)量濃度為0.25 mg·L^-1、培養(yǎng)時間 45 min、培養(yǎng)溫度 30 ℃）。

2.8 人參細(xì)菌性軟腐菌在最優(yōu)趨化參數(shù)下對4種成分化學(xué)趨向性的響應(yīng) 綜合篩選出的上述4種條件下趨化現(xiàn)象最為明顯的參數(shù)，按2.3的方法進行趨化試驗。

2.9 數(shù)據(jù)分析 趨化作用強度以趨化率（Rche）表示，R=實驗組的菌落數(shù)/對照組菌落數(shù)，趨化率R>2表示有正趨化作用。數(shù)據(jù)采用Excel（2016版）軟件進行處理，利用SPSS 19.0中的單因素方差分析（One-Way ANOVA） 結(jié)合LSD法對統(tǒng)計結(jié)果進行顯著性方差分析。不同英文字母表示不同處理間有顯著性差異（P<0.05）。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同濃度的糖和氨基酸對人參細(xì)菌性軟腐菌化學(xué)趨向性的影響 人參細(xì)菌性軟腐菌分別對賴氨酸、精氨酸、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖表現(xiàn)出化學(xué)趨向性響應(yīng)，實驗組菌落數(shù)高于對照組（圖1）。其中，人參細(xì)菌性軟腐菌對賴氨酸表現(xiàn)出的化學(xué)趨向性隨著濃度的逐漸減弱而升高，在質(zhì)量濃度0.025 mg·L^-1時的化學(xué)趨向性最強且顯著高于同組試驗（P<0.05），趨化率為2.131 3；人參細(xì)菌性軟腐菌對精氨酸、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖表現(xiàn)出的化學(xué)趨向性都隨濃度的逐漸減小而呈現(xiàn)出由弱到強的變化趨勢，都在質(zhì)量濃度0.25 mg·L^-1時的化學(xué)趨向性最強且顯著高于同組試驗（P<0.05），趨化率分別為2.143 5，2.579 2，2.495 1。

3.2 時間對人參細(xì)菌性軟腐菌化學(xué)趨向性的影響 人參細(xì)菌性軟腐菌對不同培養(yǎng)時間下的賴氨酸、精氨酸、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖均表現(xiàn)出化學(xué)趨向性響應(yīng)，都明顯高于0 min試驗組，且都隨著培養(yǎng)時間的增加出現(xiàn)由強到弱的變化（圖2）。其中，人參細(xì)菌性軟腐菌對賴氨酸、精氨酸、L-鼠李糖在培養(yǎng)到60 min時達到最大趨化值，對D-阿拉伯糖在培養(yǎng)到45 min時出現(xiàn)最大趨化值，且都顯著高于同組試驗（P<0.05）。在相同的培養(yǎng)時間里，人參細(xì)菌性軟腐菌對2種糖的化學(xué)趨向性明顯要強于2種氨基酸。

3.3 溫度對人參細(xì)菌性軟腐菌化學(xué)趨向性的影響 人參細(xì)菌性軟腐菌在4種試驗溫度下分別對賴氨酸、精氨酸、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖表現(xiàn)出化學(xué)趨向性響應(yīng)（圖3）。其中，在25 ℃培養(yǎng)時，人參細(xì)菌性軟腐菌對賴氨酸、精氨酸的化學(xué)趨向性最強，顯著高于同組試驗（P<0.05），且都隨著溫度的升高而減弱；然而人參細(xì)菌性軟腐菌在30 ℃培養(yǎng)時，L-鼠李糖、D-阿拉伯糖的化學(xué)趨向性為最強，顯著高于同組試驗（P<0.05），隨著溫度的升高而加強。在相同的培養(yǎng)溫度下，人參細(xì)菌性軟腐菌對2種糖的化學(xué)趨向性要強于2種氨基酸。

3.4 pH對人參細(xì)菌性軟腐菌化學(xué)趨向性的影響 人參細(xì)菌性軟腐菌對不同pH的賴氨酸、精氨酸、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖均表現(xiàn)出化學(xué)趨向性響應(yīng)（圖4）。其中，賴氨酸隨著pH的逐級遞增呈現(xiàn)逐漸增加的變化趨勢，pH 8時趨化性最強，顯著高于同組試驗（P<0.05）；精氨酸、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖隨著pH的逐級遞增呈現(xiàn)由強到弱的變化趨勢，其pH分別6，7，6時化學(xué)趨向性最強，顯著高于同組試驗（P<0.05）。從整體來看，賴氨酸試驗組的化學(xué)趨向性在堿性（pH 8）最強，L-鼠李糖試驗組的化學(xué)趨向性在中性（pH 7）最強，精氨酸和D-阿拉伯糖的酸性試驗組（pH 5，pH 6）的化學(xué)趨向性明顯高于中性和堿性（pH 7，pH 8），且在中性與偏酸性條件下糖類趨化性明顯高于氨基酸類。

3.5 人參細(xì)菌性軟腐菌在最優(yōu)趨化參數(shù)下對4種物質(zhì)成分化學(xué)趨向性的響應(yīng) 人參細(xì)菌性軟腐菌在最優(yōu)趨化參數(shù)下對賴氨酸、精氨酸、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖均表現(xiàn)出化學(xué)趨向性，實驗組菌落數(shù)明顯強于對照試驗組（圖5）。其中，人參細(xì)菌性軟腐菌對pH 8、質(zhì)量濃度0.025 mg·L^-1的賴氨酸在25 ℃下培養(yǎng)60 min時達到最大趨化值，趨化率為2.509 7；

對pH 6、質(zhì)量濃度 0.25 mg·L^-1的精氨酸在25 ℃下培養(yǎng)60 min時達到最大趨化值，趨化率為2.218 8，對pH 7、質(zhì)量濃度為0.25 mg·L^-1的L-鼠李糖在30 ℃下培養(yǎng)60 min時達到最大趨化值，趨化率為3.091 2；對pH 6、質(zhì)量濃度 0.25 mg·L^-1的L-鼠李糖在30 ℃下培養(yǎng)45 min時達到最大趨化值，趨化率為3.026 3。且在最優(yōu)參數(shù)下4種物質(zhì)趨化率R>2，均表示有正趨化作用。

4 結(jié)論與討論

化學(xué)趨向性（chemotaxis）作為微生物適應(yīng)環(huán)境變化而生存的一種基本屬性所引起的定向移動，它能夠幫助微生物感知周圍環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)的濃度梯度變化，尋找食源和躲避毒性環(huán)境，具有生存上的競爭優(yōu)勢。更為重要的是，它是許多病原菌感受寄主植物信號并成功入侵寄主的重要方式^[14-15]。植物根分泌物如糖類、氨基酸類、維生素類、有機酸類等都是微生物生長繁殖所需要的C，N源及生長素，為根際微生物的繁殖提供了所需的能源，影響根際環(huán)境微生物種類和數(shù)量的分布。自然條件下，次生代謝物質(zhì)的濃度效應(yīng)對于闡明化學(xué)趨向性具有重要意義，許多報道已證實低濃度下的植物次生代謝產(chǎn)物促使其病原菌顯示出較強的化學(xué)趨向性響應(yīng)。有研究指出，桉樹根系分泌的低濃度的次生代謝物質(zhì)對野生型產(chǎn)酸克氏菌Klebsilla oxytoca具有強烈的吸引作用，極大地促進了野生菌株的正趨向性^[16]。景貴成等^[17]以原油為碳源的Pseudomonassp.菌化學(xué)趨向性研究中發(fā)現(xiàn)，在有效的營養(yǎng)物濃度梯度范圍內(nèi)，化學(xué)趨向性運移速度與細(xì)菌活動能力有關(guān)，受溫度的影響很大。胡小加等^[18]發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌 A6 對油菜根系分泌物有趨化性，油菜根系分泌物所測定出的 10種糖類中，A6 對 8種糖類有趨化性。匙坤等^[19]研究發(fā)現(xiàn)人參根系分泌物中的人參皂苷在低濃度時對人參根腐菌和銹腐菌有明顯的化學(xué)趨向性。這說明人參根系分泌低濃度的次生代謝物質(zhì)有可能促進了趨化性病原細(xì)菌向人參根際的游動聚集和定植，最終完成侵染。本研究結(jié)果表明，人參細(xì)菌性軟腐菌在不同時間、溫度及pH條件下對實驗所選賴氨酸、精氨酸、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖4種物質(zhì)都表現(xiàn)出較強的化學(xué)趨向性，且高濃度的氨基酸和糖對人參細(xì)菌性軟腐菌的化學(xué)趨向性有抑制作用，但隨濃度的減弱反而增加。Parkinson等^[20]和Bourret等^[21]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌膜表面存在各種專一性的化學(xué)受體，它使得細(xì)菌能檢測到細(xì)胞外環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)的濃度變化，并通過細(xì)胞內(nèi)的傳遞系統(tǒng)將感受到的化學(xué)信息轉(zhuǎn)變成細(xì)胞內(nèi)的信號，進而由這種信號改變細(xì)菌鞭毛運動的方向，由此決定了細(xì)菌的化學(xué)趨向性運動行為。近10年來國內(nèi)外學(xué)者對化學(xué)趨向性的機制進行了大量的研究，并詳細(xì)闡明了有關(guān)的細(xì)節(jié)^[22]。但對于人參細(xì)菌性軟腐菌的化學(xué)趨向性具體機制還有待進一步研究。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]