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    miRNA-1181抑制人胰腺癌細胞的增殖*

    2017-01-17 08:56:00周顯飛朱昌豪江建新
    關(guān)鍵詞:成瘤細胞株細胞系

    王 杰, 喻 超, 周顯飛, 朱昌豪, 黃 巍, 江建新

    (貴州醫(yī)科大學(xué)附院 肝膽外科, 貴州 貴陽 550004)

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    ·專題研究2·

    miRNA-1181抑制人胰腺癌細胞的增殖*

    王 杰, 喻 超, 周顯飛, 朱昌豪, 黃 巍, 江建新**

    (貴州醫(yī)科大學(xué)附院 肝膽外科, 貴州 貴陽 550004)

    目的: 探討miRNA-1181(miR-1181)對人胰腺癌細胞增殖能力的影響。方法: 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-RCR)檢測miR-1181在4株人胰腺癌細胞系及1株人正常胰腺上皮細胞系中的表達,選取miR-1181表達差異較明顯的PANC-1和MIA PaCa-2細胞系進行后續(xù)實驗;構(gòu)建miR-1181過表達慢病毒載體(miR-1181U)以及空載慢病毒載體(NC),采用qRT-PCR檢測感染效率;在體外采用CCK-8實驗,平板克隆實驗檢測miR-1181對胰腺癌細胞增殖能力的影響;建立裸鼠皮下成瘤模型,用免疫組化實驗檢測miR-1181對胰腺癌細胞成瘤能力的影響。結(jié)果: qRT-PCR顯示4株胰腺癌細胞系中miR-1181表達量低于正常胰腺上皮細胞(P<0.05);過表達miR-1181后PANC-1和MIA PaCa-2細胞增殖能力明顯受到抑制(P<0.05),細胞集落形成數(shù)量明顯減少(P<0.05);裸鼠皮下成瘤模型顯示過表達miR-1181后腫瘤體積及免疫組化指標Ki67均明顯低于對照組(P<0.05)。結(jié)論: 過表達的miR-1181能在體內(nèi)體外抑制胰腺癌細胞的增殖,有望成為胰腺癌治療的新靶點。

    胰腺腫瘤; 細胞; 增殖; 慢病毒感染; 微小RNA; miR-1181

    胰腺癌因其早期不易診斷,治療效果差,預(yù)后不理想,被譽為致死性最高的消化道惡性腫瘤之一[1],因此早期精確的診斷以及新型的治療手段對胰腺癌的診治尤其重要[2]。miRNA是一類非編碼的微小RNA,可以在轉(zhuǎn)錄后或者翻譯水平與靶mRNA結(jié)合,使其降解并抑制基因的表達從而參與調(diào)控細胞的一系列生物行為[3]。本課題組前期研究表明miR-1181能抑制腫瘤干細胞成球形成率以及腫瘤干細胞標記物CD133的表達,并且能減少側(cè)群細胞的形成[4];還有研究表明miR-1181可通過直接抑制SOX2和STAT3來抑制腫瘤干細胞的干擾[4],本研究主要探討miR-1181對胰腺癌細胞增殖的影響。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 細胞株及試劑 人胰腺癌細胞株AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2以及人正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞株HPDE由華中科技大學(xué)附屬同濟醫(yī)院膽胰外科實驗室饋贈,高糖DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司,慢病毒載體由上海吉凱公司負責(zé)包裝和構(gòu)建,CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所,Ki67抗體購自美國CST公司。

    1.1.2 動物 免疫缺陷小鼠(Balb/c nude mice)購于北京華阜康生物科技股份有限公司,雌性,4周齡,體質(zhì)量14~15 g。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng) 人正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞HPDE、人胰腺癌細胞AsPC-1、BxPC-3用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%FBS),置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),人胰腺癌細胞PANC-1和MIA PaCa-2用高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS),置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

    1.2.2 miR-1181在人胰腺癌及正常胰腺細胞中的表達 根據(jù)Trizol說明書提取各類細胞中總RNA,選取吸光度為1.8~2.0(A260/A280)的樣本用于實驗。再根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書,以U6作為內(nèi)參,分別逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為25 μL反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為70 ℃ 10 min,42 ℃ 50 min,70 ℃ 10 min,4 ℃保存。以U6作為內(nèi)參,實時熒光定量PCR(qRT-PCR)反應(yīng)為25 μL反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為95 ℃ 15 min,94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s,45個循環(huán)。采用相對定量法(relative quantitative,RQ)表示miR-1181的表達量。

    1.2.3 慢病毒感染及效率檢測 根據(jù)PCR結(jié)果選取兩株胰腺癌細胞系,待其貼壁生長至70%~80%融合時,用0.05%胰酶消化傳代培養(yǎng),按慢病毒感染手冊感染胰腺癌細胞。實驗分為過表達組(miR-1181U),陰性對照組(NC)和空白對照組(BC)3組,待其感染1周后采用RT-PCR檢測感染效率。

    1.2.4 CCK-8實驗 制備細胞懸液,調(diào)整細胞密度為1×108個/L,接種到96孔板中,每孔約100 μL細胞懸液,每個樣約5個副孔。分別于4、24、48、72、96 h加入含10% CCK8的培養(yǎng)液,培養(yǎng)3 h后測定波長為450 nm時每孔的吸光度。

    1.2.5 平板克隆實驗 收集對數(shù)生長期細胞,調(diào)整細胞懸液濃度為1×106個/L,于六孔板中種植2 000個細胞,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7~8 d后,4%多聚甲醛固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染色30 min,計數(shù)每孔克隆形成數(shù)量并拍照記錄。

    1.2.6 裸鼠皮下成瘤模型 將6只裸鼠隨機分成陰性對照組(NC組)和過表達組(miR-1181U組),分別收集對數(shù)生長期穩(wěn)定表達的細胞,用PBS重懸后棄上清,再將PBS與Matrigel基質(zhì)膠按1∶1體積混合,將混合液重懸并調(diào)整細胞濃度為1×1010個/L,于每只裸鼠的右后腿部皮下注射200 μL細胞懸液。在相同條件下(間斷12 h光照與黑暗,自由進食等)飼養(yǎng)6周,每周觀察1次裸鼠,記錄裸鼠體質(zhì)量及腫瘤大小。6周后采用頸部脫臼法處死裸鼠,解剖裸鼠取出腫瘤并拍照。

    1.2.7 Ki67在裸鼠腫瘤中的表達 將解剖后的裸鼠腫瘤組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,HE染色;將細胞增殖相關(guān)蛋白Ki67按1∶400稀釋后染色。每組腫瘤切片隨機選取5張切片,每張切片隨機選取3個視野,觀察并拍照。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 miR-1181的表達

    與正常胰腺導(dǎo)管上皮細胞HPDE相比,4株胰腺癌細胞miR-1181均為低表達,其中AsPC-1、PANC-1、MIA PaCa-2細胞株中miR-1181,顯著低于HPDE細胞株,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。BxPC-3細胞株中miR-1181表達量與HPDE比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖1A。

    2.2 miR-1181慢病毒在胰腺癌中的感染效率

    根據(jù)細胞系表達情況,選取PANC-1和MIA PaCa-2作為實驗所用細胞系,并感染慢病毒。PANC-1、MIA PaCa-2兩株細胞miR-1181U組均比BC組和NC組顯著升高(P<0.05),見圖1B,1C。

    注:A為miR-1181在胰腺癌細胞系中低表達,B為PANC-1感染慢病毒后各組miR-1181的表達, C為MIA PaCa-2感染慢病毒后各組miR-1181的表達;(1)P<0.05,(2)P < 0.01圖1 qRT-PCR檢測miR-1181表達Fig.1 MiR-1181 expression evaluated by PCR

    2.3 miR-1181對胰腺癌細胞增殖能力的影響

    當PANC-1細胞培養(yǎng)72 h及96 h時,miR-1181U組吸光度值較NC組和BC組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖2A);當MIA PaCa-2細胞培養(yǎng)96 h時,miR-1181組吸光度值較NC組和BC組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖2B)。

    注:A為PANC-1細胞系,B為MIA PaCa-2細胞系;(1)P<0.05圖2 miR-1181U對胰腺癌細胞增殖能力的影響(CCK-8)Fig.2 The effect of miR-1181U on proliferation of pancreatic cancer cells

    2.4 miR-1181對胰腺癌細胞集落形成的影響

    平板克隆實驗結(jié)果顯示,miR-1181U組集落形成數(shù)量PANC-1為(334.7±16.48),MIA PaCa-2為 (153.7±8.51);NC組集落形成數(shù)量PANC-1為(917.0±37.58),MIA PaCa-2為(308.0±11.15);BC組集落形成數(shù)量PANC-1為(910.7±36.99),MIA PaCa-2為(316.7±13.16);miR-1181U組較NC組及BC組集落形成數(shù)量均明顯減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖3)。

    注:(1)P<0.05圖3 miR-1181U對胰腺癌細胞克隆形成的影響(平板克隆)Fig.3 The effect of miR-1181U on colony forming of pancreative cancer cells

    2.5 miR-1181對胰腺癌細胞體內(nèi)成瘤的影響

    裸鼠每組3只,注射細胞懸液后飼養(yǎng)6周,取出腫瘤,測定腫瘤體積volume(mm3),miR-1181U組(155.3±9.03)mm3,NC組(291.0±11.37)mm3,miR-1181U組較NC組腫瘤體積明顯變小,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖4)。

    2.6 miR-1181對腫瘤增殖膜指標Ki67的影響

    免疫組化結(jié)果顯示,Ki67的相對表達量miR-1181U組為(0.18±0.02),NC組為(0.55±0.03),miR-1181U組Ki67表達量明顯低于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖5)。

    (1)P<0.05圖4 miR-1181裸鼠皮下成瘤能力Fig.4 Subcutaneous tumor formation in nude mice to detect subcutaneous tumor forming ability of miR-1181

    (1)P<0.05圖5 miR-1181對增殖指標Ki67的影響(免疫組化,×400)Fig.5 The effect of miR-1181on Ki67 expression

    3 討論

    近期研究顯示,約30%的蛋白編碼基因受miRNA所調(diào)控,每條miRNA都能特異性結(jié)合靶基因mRNA的3′-UTR序列,從而參與調(diào)控成千上萬的基因表達[5]。miRNA作為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列,參與機體的各種生理功能,如胚胎發(fā)育,細胞增殖以及細胞凋亡等。miRNA的異常表達在疾病發(fā)生、發(fā)展包括腫瘤形成過程中起到了顯著的作用[6]。有研究表明,miRNA-330-5p在結(jié)腸癌中表達量明顯低于癌旁組織,當過表達miR-330-5p后能顯著抑制結(jié)腸癌細胞的增殖能力,并通過“雙熒光素酶報告分析”確定人整合素5(ITGA5)是其直接作用靶基因[7]。Pei YF等[8]研究發(fā)現(xiàn),miR-29a不僅能促進乳腺癌細胞的增殖,還能促進乳腺癌上皮細胞向間(充)質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化進而獲得遷徙能力。而在胰腺癌的報道中,Tanaka R等[9]研究發(fā)現(xiàn)miR-17-92能通過MEK-ERK信號通路影響胰腺癌細胞MIA PaCa-2的細胞周期,阻滯細胞從G1期進入到S期,進而影響增殖能力。Chang W等[10]通過癌癥基因組圖譜中發(fā)現(xiàn)miR-377在胰腺癌中呈低表達,并實驗證實miR-377在組織及細胞中均呈低表達,進一步確定Pim-3為其直接作用靶點,miR-377通過抑制Pim-3的表達來抑制胰腺癌細胞的增殖。迄今為止,對miR-1181的研究甚少,只在卵巢癌和肝癌報道中有所提及[11-12]。本課題組前期研究只表明miR-1181能影響胰腺癌細胞干性[4],并未直接闡明miR-1181對胰腺癌細胞生物學(xué)效應(yīng)的影響。另一方面,miR-1181的直接作用靶蛋白尚未明確,是否通過影響某些通路(如MAPK通路,PI3K/AKT通路和Hedgehog通路)進而影響細胞的增殖,均需進一步實驗探究[13-15]。

    本研究重點從體內(nèi)體外兩方面說明miR-1181對胰腺癌細胞的增殖有明顯影響。體外采用CCK-8實驗、平板克隆實驗分別表明miR-1181能抑制胰腺癌細胞的增殖以及減少克隆集落的形成。體內(nèi)建立裸鼠皮下成瘤模型證實miR-1181能抑制胰腺癌細胞的體內(nèi)成瘤,且腫瘤免疫組化切片顯示miR-1181能抑制Ki67的表達。故我們可以得出結(jié)論,miR-1181能抑制胰腺癌細胞的增殖。

    綜上,miR-1181在胰腺癌中是作為一種抑癌基因的形式而存在的,能顯著抑制胰腺癌細胞體外增殖以及體內(nèi)成瘤,為進一步研究其具體機制提供了一定的理論基礎(chǔ),miR-1181有望成為胰腺癌診治的潛在靶點。

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    (2016-10-06收稿,2016-11-28修回)

    中文編輯: 劉 平; 英文編輯: 劉 華

    The Inhibiting Effect of miRNA-1181 on Cell Proliferation of Pancreatic Cancer Cell

    WANG Jie, YU Chao, ZHOU Xianfei, ZHU Changhao, HUANG Wei, JIANG Jianxin

    (DepartmentofHepatic-Biliary-PancreaticSurgery,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

    Objective: To investigate the effect of microRNA-1181 on the proliferation of pancreatic cancer. Methods: Quantitative polymerase chain reaction (qRT-RCR) was adopted to detect the expression of miR-1181 in 4 human pancreatic cancer cell lines and 1 human normal pancreatic epithelial cell lines. The PANC-1 and MIA PaCa-2 cell lines with significantly different miR-1181 expression were selected for subsequent experiments. The miR-1181 over-expression lentiviral vector (miR-1181U) and the empty lentiviral vector vector (NC) were constructed and qRT-PCR was used to detect infection efficiency. The effect of miR-1181 on the proliferation of pancreatic cancer cells was detected by CCK-8 assay and Plate cloning experiment in vitro. The subcutaneous tumor model of nude mice was established, and the effect of miR-1181 on the ability of pancreatic cancer cells was detected by immunohistochemistry. Results: qRT-PCR showed that the expression of miR-1181 in 4 pancreatic cancer cell lines was significantly lower than that in normal pancreatic epithelial cells (P<0.05). The proliferation ability of PANC-1 and MIA PaCa-2 cells was significantly inhibited after over-expression of miR-1181 (P<0.05), and the number of colony formation was significantly decreased (P<0.05). Subcutaneous tumor model in nude mice showed that the tumor size and immunohistochemistry index Ki67 were significantly lower than those in the normal control group (P<0.05) after over-expression of miR-1181. Conclusion: Over-expression of miR-1181 can inhibit the proliferation of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo, and is expected to become a new target for the treatment of pancreatic cancer.

    pancreatic neoplasms; cells; proliferation; lentivirus infections; micro RNA; miR-1181

    國家國際科技合作專項資助(2014DFA31420); 國家自然科學(xué)基金(81160311,81572429,81660483)

    時間:2016-12-15

    http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.005.html

    R735.9

    A

    1000-2707(2016)12-1382-05

    10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.004

    **通信作者 E-mail:jjx731003@163.com

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