AntagomiR-103協(xié)同阿霉素對TGF-β1誘導的HepG2細胞轉化及生長的影響*

王金利， 張 敏

(1.無錫市惠山區(qū)人民醫(yī)院, 江蘇 無錫 214187； 2.貴州醫(yī)科大學, 貴州 貴陽 550004)

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AntagomiR-103協(xié)同阿霉素對TGF-β1誘導的HepG2細胞轉化及生長的影響*

王金利1， 張 敏2**

(1.無錫市惠山區(qū)人民醫(yī)院, 江蘇 無錫 214187； 2.貴州醫(yī)科大學, 貴州 貴陽 550004)

目的： 探討antagomiR-103協(xié)同阿霉素(ADM)對TGF-β1誘導肝癌細胞(Hep G2)發(fā)生上皮-間質細胞轉化(EMT)及Hep G2細胞存活率的影響。方法： Hep G2細胞體外培養(yǎng)，設為control組、TGF-β1組、TGF-β1+ADM組、TGF-β1+microRNA inhibitor N.C組、TGF-β1+ADM+microRNA inhibitor N.C組、TGF-β1+antagomiR-103組、TGF-β1+ADM+antagomiR-103組及使用western-blot檢測EMT標志蛋白N-Cadherin、E-Cadherin、vimentin的表達水平；設control組、TGF-β1組、antagomiR-103組、TGF-β1+antagomiR-103組，用不同濃度的ADM作用于各組細胞24 h，使用MTT法檢測細胞存活率，并計算IC50。結果： 與control組相比，antagomiR-103+ADM組E-Cadherin表達上調，N-Cadherin、Vimentin表達下調；細胞存活率隨ADM濃度的增高而逐漸降低；在ADM濃度相同的條件下，不同藥物預處理組之間進行比較，當ADM濃度為25 mg/L時，antagomiR-103+ADM組的細胞存活率明顯低于其他組。結論： antagomiR-103聯(lián)合ADM可抑制TGF-β1誘導發(fā)生EMT的Hep G2細胞存活。

藥物療法，聯(lián)合； 肝腫瘤； 細胞； antagomiR-103； 阿霉素； 上皮細胞-間充質細胞轉換； TGFβ-1

目前臨床上治療肝癌一般采取手術為主，輔以化療的綜合治療方案[1]，化療藥物是通過誘導腫瘤細胞凋亡而達到治療效果，但腫瘤細胞容易對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥性導致化療失敗[2]。臨床常用于治療肝癌的化療藥物阿霉素(doxorubicin,ADM)是一種周期非特異性抗癌化療藥，對各期細胞均有很強的細胞毒性作用，其作用機制是通過插入并解開DNA的雙螺旋鏈，改變DNA的模板性質，抑制DNA聚合酶，從而抑制細胞DNA和RNA合成[3-4]。鄧立力等[5]發(fā)現(xiàn)，ADM可以促進細胞表面死亡受體的表達，誘導肝癌細胞凋亡，肝癌患者在長期使用ADM后很容易產(chǎn)生耐藥性。有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生上皮-間質細胞轉化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)過程中，miRNA作為具有調控功能的小分子RNA與腫瘤對化療藥物的反應有密切聯(lián)系[6]。本實驗通過微小RNA(microRNA，miRNA)干擾技術，設計合成miRNA-103的阻斷試劑antagomiR-103，對肝癌細胞(Hep G2)進行干預，將antagomiR-103與ADM共同作用于Hep G2細胞，觀察兩者對腫瘤細胞存活率的影響，檢測EMT標志蛋白N-Cadherin、E-Cadherin、vimentin的表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

人肝癌細胞系Hep G2購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫，胎牛血清為HyClone公司產(chǎn)品，DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，胰蛋白酶為美國Ameresco公司產(chǎn)品，antagomiR-103、antagomiRNA-MUT、has-miR-103、microRNA mimics N.C、microRNA inhibitor N.C由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成，阿霉素為深圳萬樂藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，E-Cadherin、N-CadherinBioworld和Vimentin抗體均購自Bioworld生物科技有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純試劑。超凈工作臺(SW-CJ-2FD，蘇州凈化設備有限公司)，倒置顯微鏡(CKX41，日本Olympus公司)，超低溫冰箱(MDF-382E，日本SANYO公司)，恒溫CO2 培養(yǎng)箱(Model 310，美國Thermo公司)，全自動雪花制冰機(IMS-40，常熟市雪科電器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞株HepG2 使用10%胎牛血清(FBS)+DMEM培養(yǎng)基混合液，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5% 孵箱中培養(yǎng)，將2×107/mL的Hep G2細胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM置于5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后，更換無酚紅無血清的DMEM培養(yǎng)2 h，加入含10%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后收集細胞，完成后續(xù)試驗。

1.2.2 EMT標志蛋白E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin檢測 將體外培養(yǎng)的Hep G2細胞分為control組、TGF-β1組、TGF-β1+ADM組、TGF-β1+microRNA inhibitor N.C組、TGF-β1+ADM+microRNA inhibitor N.C組、TGF-β1 + antagomiR-103組及TGF-β1+ ADM+antagomiR-103組；收集培養(yǎng)細胞，加入全細胞裂解液每皿80 μL，-20 ℃、14 000 r/min離心20 min；收集上清，BCA法測定蛋白濃度，取30 μg總蛋白行SDS-PAGE電泳，在300 mA、1 h的條件下將蛋白轉移至PVDF膜，用5 g/L脫脂奶粉TBST稀釋液封閉1 h后用E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和GAPDH抗體4 ℃孵育過夜，用TBST洗滌后加入相應二抗孵育2 h后ECL法進行顯影，檢測E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin蛋白的表達。

1.2.3 細胞增殖能力 對數(shù)生長期的Hep G2細胞用0.25%的胰酶消化后，以細胞濃度為 8×103/mL接種于96孔板內，每張板設空白調零組、陰性對照組、ADM組、ADM+TGF-β1組、ADM+antagomiR-103組及ADM+TGF-β1+antagomiR-103組；ADM設8個藥物濃度(C1～C8)分別為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78 mg/L；ADM+TGF-β1組為加入上述C1～C8的ADM和5 μg/L TGF-β1，ADM+antagomiR-103組為加入上述C1～C8的ADM和100 nmol/L antagomiR-103，ADM+TGF-β1+antagomiR-103組為加入上述C1～C8的ADM和100 nmol/L antagomiR-103及5 μg/L TGF-β1；每組均設6個復孔。細胞加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，向各孔加入MTT液，使細胞與0.25% MMT在37 ℃、5% CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加入DMSO 200 μL低速振蕩10 min，結晶震蕩溶解后，通過酶標儀于490 nm波長處測定各孔光密度，計算IC50值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1N-Cadherin、E-Cadherin、vimentin表達

western-blot結果顯示，與control組細胞相比，TGF-β1組中N-Cadherin、Vimentin表達上調、E-Cadherin表達下調；與TGF-β1組細胞相比，TGF-β1+antagomiR-103組中N-Cadherin、Vimentin表達下調、E-Cadherin表達上調;TGF-β1+ADM+antagomiR-103組中N-Cadherin、Vimentin表達下調、E-Cadherin表達上調；差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這些結果說明antagomiR-103與ADM共同作用于TGF-β1誘導的HepG2細胞，可以明顯抑制細胞發(fā)生EMT。

注：1為control組,2為TGF-β1組,3為TGF-β1+ADM組,4為TGF-β1+microRNA inhibitor N.C組,5為TGF-β1+ADM+microRNA inhibitor N.C組,6為TGF-β1 + antagomiR-103組,7為TGF-β1+ ADM+antagomiR-103組圖1 各實驗組EMT相關蛋白的表達(western blot)Fig.1 Expression of EMT related protein in each experimental group

2.2 ADM對Hep G2細胞存活率的影響

將Hep G2細胞分為control組、8個不同濃度ADM組，體外培養(yǎng)24 h后，使用MTT法檢測不同濃度ADM對Hep G2細胞存活率的影響。結果顯示，與control組細胞相比，隨著ADM濃度的增高，細胞存活率隨之顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。當ADM濃度增高至50、100 mg/L時，HepG2細胞存活率與其他劑量組相比略有增高，原因不明。經(jīng)統(tǒng)計學分析計算得出ADM的半數(shù)抑制濃度(IC50)為6.699 mg/L，見圖2。

表1 ADM對Hep G2細胞存活率 的影響Tab.1 The negative effect of ADM onHep G2 cell survival

(1)與control組比較，P<0.01

注：(1)與control組比較，P<0.01圖2 ADM對Hep G2細胞存活率的影響Fig.2 The negative effect of ADM on Hep G2 cell survival

2.3 ADM對TGF-β1誘導發(fā)生EMT的Hep G2細胞存活率的影響

用TGF-β1(5 μg/L)誘導Hep G2細胞發(fā)生EMT，同時給予不同濃度ADM處理細胞24 h，MTT法檢測ADM對細胞存活率的影響。結果顯示，與TGF-β1組相比，細胞存活率明顯下降, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。經(jīng)統(tǒng)計學分析計算，ADM的IC50為8.698 mg/L，是ADM作用于未發(fā)生EMT的Hep G2細胞的IC50的1.3倍，提示ADM對TGF-β1誘導發(fā)生EMT的Hep G2細胞的作用減弱，促進細胞凋亡的能力降低，當ADM濃度增高至50、100 mg/L時，細胞存活率與其他劑量組相比略有增高，見圖3。

表2 ADM對TGF-β1誘導發(fā)生EMT的Hep G2細胞存活率的影響Tab.2 The negative effect of ADM on TGF-β1 induced EMT's Hep G2 cell survival

注：(1)與control組比較，P<0.01

注：(1)與control組比較，P<0.01圖3 ADM對TGF-β1誘導發(fā)生EMT的Hep G2細胞存活率的影響Fig.3 The negative effect of ADM on TGF-β1 induced EMT's Hep G2 cell survival

2.4 antagomiRNA-103與ADM共同作用對Hep G2細胞存活率的影響

用antagomiR-103(100 nmol/L)和8個不同濃度的ADM共同作用于Hep G2細胞24 h，MTT法檢測ADM對Hep G2細胞存活率的影響。結果顯示，與antagomiR-103組相比，ADM+antagomiR-103組的細胞存活率明顯下降(P<0.01),見表3。經(jīng)統(tǒng)計學分析計算，ADM和antagomiR-103共同作用于Hep G2細胞，其IC50為3.826 mg/L，與ADM單獨作用于Hep G2細胞的IC50相比明顯降低， ADM組中ADM的IC50是ADM+antagomiR-103組中ADM的IC50的1.75倍，ADM+TGF-β1組中ADM的IC50是ADM+antagomiR-103組中ADM的IC50的2.27倍，見圖4。提示antagomiR-103可以促進ADM誘導的細胞凋亡，兩者有協(xié)同作用。當ADM濃度增高至50、100 mg/L時，細胞存活率與其他劑量組相比略有增高。

表3 antagomiR-103與ADM共同作用對Hep G2細胞存活率的影響Tab.3 The negative effect of antagomiR-103 and ADM on Hep G2 cell survival

(1)與antagomiR-103組相比，P<0.01

(1)與antagomiR-103組相比，P<0.01圖4 antagomiR-103與ADM共同作用對Hep G2細胞存活率的影響Fig.4 The negative effect of antagomiR-103 and ADM on Hep G2 cell survival

2.5 antagomiR-103與ADM共同作用對TGF-β1誘導發(fā)生EMT的Hep G2細胞存活率的影響

用antagomiR-103(100 nmol/L)和8個不同濃度的ADM共同作用于TGF-β1誘導發(fā)生EMT的Hep G2細胞24 h，MTT法檢測antagomiR-103與ADM對TGF-β1誘導發(fā)生EMT的Hep G2細胞存活率的影響。結果顯示，與control組、antagomiR-103+TGF-β1組相比，ADM+antagomiR-103+TGF-β1組的細胞存活率明顯下降(P<0.01),見表4。經(jīng)統(tǒng)計學分析計算，ADM和antagomiR-103共同作用于TGF-β1誘導發(fā)生EMT的Hep G2細胞，ADM的IC50為3.913 mg/L，與ADM單獨作用于Hep G2細胞時ADM的IC50相比明顯降低， ADM組中ADM的IC50是ADM+antagomiR-103+TGF-β1組中ADM的IC50的1.71倍；ADM+TGF-β1組中ADM的IC50是ADM+antagomiR-103+TGF-β1組中ADM的IC50的2.22倍，見圖5。提示antagomiR-103與ADM共同作用于TGF-β1誘導發(fā)生EMT的Hep G2細胞，可以促進細胞凋亡，兩者有協(xié)同作用。當ADM濃度增高至50、100 mg/L時，細胞存活率與其他劑量組相比略有增高。

表4 antagomiR-103與ADM共同作用對TGF-β1 誘導發(fā)生EMT的Hep G2細胞 存活率的影響Tab.4 The negative effect of antagomiR-103 and ADM on TGF-β1 induced EMT's Hep G2 cell survival

(1)與antagomiR-103+ TGF-β1組相比，P<0.01

(1)與antagomiR-103+ TGF-β1組相比，P<0.01圖5 antagomiR-103與ADM共同作用對TGF-β1誘導發(fā)生EMT的Hep G2細胞存活率的影響Fig.5 The negative effect of antagomiR-103 and ADM on TGF-β1 induced EMT's Hep G2 cell survival

3 討論

EMT的發(fā)生與多種因素有關，受到多種細胞調控因子的調控，如TGF-β[7]、FGF[8]、EGF[9]等，可以誘導EMT的發(fā)生，也可以引起腫瘤細胞的增殖。Akhurst RJ[10]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞系被轉入外源性TGF-β1后都出現(xiàn)不同程度的上皮表型缺失，獲得侵襲特征，阻礙TGF-β受體可以阻止EMT的發(fā)生和腫瘤細胞侵襲。ADM是一種廣譜、高效抗腫瘤的蒽環(huán)類化合物，對各期細胞有很強的細胞毒性作用，可破壞細胞膜的結構和功能，可以通過p53依賴或p53非依賴的途徑來誘導細胞凋亡[11]，這可能是ADM引起細胞存活率下降的原因之一。

在本實驗中，TGF-β1誘導發(fā)生了EMT的Hep G2細胞存活率與對照組相比無明顯差異，原因可能是EMT的抗凋亡作用，推測發(fā)生EMT的細胞激活了抗凋亡的信號通路或抗凋亡的因子生成，如Wnt/β-連環(huán)素信號通路下游靶基因survivin、eyelinDI，可促進細胞周期進程、引起細胞增殖和抑制細胞凋亡[12]。但是細胞由上皮細胞表型轉化為間質細胞表型，可能也是抗凋亡的一個關鍵因素。TGF-β1可誘導肝臟實質細胞發(fā)生凋亡，存活下來的細胞發(fā)生EMT，獲得一定的抗凋亡活性[13]。

在本實驗中，ADM單獨作用于TGF-β1誘導的Hep G2細胞，與control組、TGF-β1組相比，EMT的標志性蛋白E-Cadherin、N-Cadherin及Vimentin表達變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義；antagomiR-103與ADM共同作用于TGF-β1誘導的Hep G2細胞，與TGF-β1組相比，N-Cadherin表達下調、E-Cadherin表達上調、Vimentin表達下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這些結果表明，ADM對TGF-β1誘導的Hep G2細胞發(fā)生EMT未表現(xiàn)出抑制作用，antagomiR-103與ADM共同作用于TGF-β1誘導的Hep G2細胞，對細胞發(fā)生EMT有抑制作用。antagomiR-103聯(lián)合化療藥物ADM共同作用于TGF-β1誘導發(fā)生EMT的Hep G2細胞，使用MTT法檢測ADM對Hep G2細胞存活率的影響, 結果顯示，細胞存活率隨著ADM濃度的增高而降低，ADM對TGF-β1誘導發(fā)生EMT的Hep G2細胞存活率的影響；細胞存活率隨著ADM濃度的增高而降低，但與單獨使用ADM組相比，在相同濃度ADM作用下，細胞存活率變化并無明顯差異，可能與TGF-β1的增殖和誘導EMT的作用有關，antagomiR-103與化療藥物ADM共同作用于Hep G2細胞對其存活率的影響。結果顯示，細胞存活率隨著ADM濃度的增高而明顯降低，在ADM濃度為25 mg/L時，與單獨使用ADM組、單獨使用antagomiR-103組細胞存活率相比明顯降低(P<0.01)，有統(tǒng)計學意義；antagomiR-103與ADM共同作用于TGF-β1誘導發(fā)生EMT 的Hep G2細胞，MTT檢測細胞存活率，結果還顯示，與control組、antagomiR-103+TGF-β1組相比，ADM+antagomiR-103+TGF-β1組的細胞存活率明顯下降(P<0.01)。

綜上所述，antagomiR-103對TGF-β1誘導的Hep G2細胞EMT的發(fā)生有抑制作用，與ADM共同作用于Hep G2細胞也明顯引起細胞存活率降低，使ADM半數(shù)抑制濃度明顯降低，這些結果的發(fā)現(xiàn)考慮可能與其它信號通路或miRNA協(xié)同、拮抗作用相關，但是具體的作用機制本實驗尚未深入探討，將在今后的實驗中繼續(xù)深入研究。利用miRNA的基因干預調控阻斷肝癌細胞的EMT，同時輔以化療藥物治療肝癌具有很高的可行性，將對臨床肝癌轉移、復發(fā)的防治具有重大意義。這可能為揭秘腫瘤侵襲和轉移的機制提供更為可靠的理論依據(jù)，為腫瘤患者的治療帶來新的希望。

[1] 原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)[J]. 臨床肝膽病雜志, 2011(11):1141-1159.

[2] Philip J,Johnson．Systemic chemotherapy of liver tumors[J]．Semin Surg Oncol， 2000(2)：116-124．

[3] Tomris O．Mechanisms and strategies to overcome multilple drug resistance in cancer[J]．FEBS Lett， 2006(12)：2903-2909．

[4] Perez EA．Impact，mechanisms，and novel chemotherapy strategies for overcoming resistance to anthracyclines and taxanes in metastatic breast cancer[J]．Breast Cancer Res Treat， 2009(2)：195-201．

[5] 鄧立力，呂慧芳，王文秀，等．阿霉素對肝癌細胞增殖及TRAIL受體表達影響的實驗研究[J]．中國腫瘤， 2011(7)：515-520．

[6] 薛逸荃,曹雪濤. RNA異常與腫瘤調控研究進展[J]. 中國腫瘤生物治療雜志, 2013(1):1-12.

[7] Tanahashi T,Osada S,Yamada A,et al.Extracellular signal-regulated kinase and Akt activation play a critical role in the process of hepatocyte growth factor-induced epithelial-mesenchymal transition.[J].Int J Oncol, 2013(2): 556-564.

[8] Nguyen L,Fifis T,Malcontenti-Wilson C,et al.Spatial morphological and molecular differences within solid tumors may contribute to the failure of vascular disruptive agent treatments.[J].BMC Cancer, 2012(12):522.

[9] Alipio ZA, Jones N, Liao W, et al. Epithelial to mesenchymal transition (EMT) induced by bleomycin or TFG-β1/EGF in murine induced pluripotent stem cell-derived alveolar Type II-like cells[J]. Differentiation, 2011(2): 89-98.

[10]Akhurst RJ，Derynck R．TGF-beta signaling in cancer-a double-edged sword[J]．Trends Cell Biol， 2001(11)：44-51.

[11]Fornari F,Gramantieri L，Giovannini C，et al．MiR-122/cydinG1 interaction modulates p53 activity and afects doxorubicin sensitivity of human hepatocarcinoma cells[J].Cancer Res， 2009(14)：5761-5767．

[12]Robson EJ，Khaled WT，Abell K，et al．Epithelial-to-mesenchymal transition confers resistance to apoptosis in three murine mammary epithelial cell lines[J].Differentiation， 2006(5)：254-264．

[13]Del Castillo G，Murillo MM，Alvarez-Barrientos A，et al．Autocrine production of TGF-beta confers resistance to apoptosis after an epithelial-mesenchymal transition process in hepatocytes： Role of EGF receptor ligands[J]．Exp Cell Res， 2006(15)：2860-2871．

(2016-08-29收稿，2016-11-06修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 劉 華

Effects of AntagomiR-103 and ADM on TGF-β1 Induced EMT and Growth of Hep G2 Cell

WANG Jinli1, ZHANG Min2

(1.thePeople'sHospitalofHuishanDistrict,Wuxi214187,Jiangsu,China; 2.DepartmentofPharmacology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the effect of antagomir-103 synergized by ADM on epithelial mesenchymal transition (EMT) in Hep G2 induced by TGF-β1 and on the cell survival rate of and Hep G2 cells. Methods: Hep G2 cells were cultivated in DMEM with 10% fetal calf serum and divided into the control group, the TGF-β1 group, TGF-β1+ADM group, TGF-β1+microRNA inhibitor N.C group, TGF-β1+ADM+microRNA inhibitor N.C group, the TGF-β1+antagomiR-103 group, and the TGF-β1+ ADM+antagomiR-103 group. Western-blot was adopted to detect the expression level of EMT, E-cadherin, vimentin and N-cadherin in all these groups. On the other hand, the Hep G2 cells were also divided into the control group, TGF-β1group, antagomiR-103 group, TGF-β1+antagomiR-103. With different concentrations of ADM on each above group for 24 h, MTT method was used to detect cell survival rate, and IC 50 was calculated. Results: Compared with control group, the expression of E-cadherin was up-regulated in antagomiR-103+ADM group, while N-cadherin, vimentin expression was down regulated. The cell survival rate decreased with the increase of ADM concentration. The cell survival rate of antagomiR-103+ADM group was significantly lower than that of the other groups at the same ADM concentration and when the ADM concentration was 25 mg/L. Conclusion: antagomiR-103 combined with ADM can inhibit transformation of TGF-β1 induced EMT and growth of Hep G2 cell.

drug therapy,combination; liver neoplasms; cells; antagomiR-103; adriamycin; epithelial-mesenchymal transitions; TGFβ-1

貴陽市科技局基金項目[(2011103)17號]

時間：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.010.html

R329.25； R575.2

A

1000-2707(2016)12-1424-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.013

**通信作者 E-mail:1071632869@qq.com