烯丙孕素口服液對靶動物豬的安全性研究

夏良友，李士洋，李宇琛，李龍飛，楊海峰，卜仕金

(1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州 225009；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009； 3.寧波第二激素廠，浙江寧波 315000)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.10.07

烯丙孕素口服液對靶動物豬的安全性研究

夏良友，李士洋，李宇琛，李龍飛，楊海峰，卜仕金*

(1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州 225009；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009； 3.寧波第二激素廠，浙江寧波 315000)

為評價烯丙孕素口服液對豬的安全性，將24頭達(dá)到性成熟的蘇姜母豬隨機分為4組，每組6頭，采用多劑量水平給藥進行靶動物安全性研究，其中受試藥物設(shè)最大推薦劑量每頭動物每日20 mg烯丙孕素(相當(dāng)于每次5 mL)、2倍最大推薦劑量每頭動物每日40 mg烯丙孕素(相當(dāng)于每次10 mL)和3倍最大推薦劑量每頭動物每日60 mg烯丙孕素(相當(dāng)于每次15 mL)三個劑量組；另設(shè)一空白對照組，每頭動物每日15 mL潔凈自來水，體積相當(dāng)于3倍受試藥推薦劑量的體積。通過一般臨床觀察、各組動物體重、血液學(xué)和血液生化學(xué)參數(shù)等指標(biāo)及組織病理學(xué)檢測或觀察，評價烯丙孕素在臨床用藥的安全性。結(jié)果表明，試驗期間各組豬均未死亡且健康良好，期間臨床表現(xiàn)正常，3倍最大推薦劑量組剖檢動物各組織器官未發(fā)現(xiàn)病理變化。在血液生理指標(biāo)及生化指標(biāo)方面，推薦劑量組、2倍推薦劑量組、3倍最大推薦劑量組與空白對照組相比，除少部分指標(biāo)外，其他各指標(biāo)并無顯著差異。試驗結(jié)果說明，烯丙孕素在推薦劑量下使用在靶動物豬上具有較高的安全性。

豬；烯丙孕素；靶動物安全性

烯丙孕素(Altrenogest,又名四烯雌酮)是一種人工合成的甾類促孕激素，屬于19-去甲睪酮類化合物[1-2]。烯丙孕素是一種口服有活性的孕激素，其藥理活性已在多種動物模型中得到了證實，類似于其他的類固醇，烯丙孕素可憑借其脂溶性穿透靶細(xì)胞，與特定受體結(jié)合[3-5]。烯丙孕素通過降低內(nèi)源促性腺激素(LH和FSH)的血漿濃度而起作用。低促性腺激素濃度誘導(dǎo)大卵泡(>5 mm)消退，并且使卵泡生長無法大于3 mm，使得動物在給藥期間不會發(fā)情和無法排卵。給藥結(jié)束之后，LH血漿濃度增加，使得卵泡能夠生長和成熟[6-8]。之后，動物同步開始發(fā)情周期。在獸醫(yī)臨床烯丙孕素已被歐盟和美國批準(zhǔn)用于母豬和母馬的同步發(fā)情。烯丙孕素口服給藥之后，可迅速吸收，1～4 h后達(dá)血漿峰濃度。烯丙孕素主要在肝代謝，然后通過膽汁排泄消除[9]。消除半衰期大約為14 h[10]。由于國內(nèi)對該藥的安全性研究鮮有報道，為評價烯丙孕素口服液的安全性，本試驗對豬喂食相應(yīng)臨床推薦劑量藥物，以探究該藥對靶動物豬的安全性[11]。

1 材 料

1.1 受試藥 試驗藥品：烯丙孕素口服液，含量規(guī)格為1 mL∶4 mg，包裝規(guī)格為450 mL/瓶，批號為160415；生產(chǎn)商為寧波第二激素廠。用法與用量：灑在飼料的表層，經(jīng)口攝入。一日量，每頭動物20 mg烯丙孕素(相當(dāng)于每次5 mL)。連用18 d。

1.2 實驗動物及入選標(biāo)準(zhǔn) 試驗擬選擇達(dá)到性成熟的蘇姜后備母豬進行靶動物安全性試驗，實驗地點為江蘇泰興蘇姜種豬有限公司豬場，采用耳號標(biāo)記識別，編號1～24。入選豬在試驗前1 d須經(jīng)獸醫(yī)檢查確認(rèn)是處于良好的健康狀況下。處于下列情況下的豬應(yīng)從實驗中剔除：①適應(yīng)期內(nèi)瀕死的豬；②適應(yīng)期內(nèi)生病或受傷的豬；③試驗期內(nèi)因疾病需要用其他藥治療的豬。

1.3 儀器 全自動生化分析儀和全自動血常規(guī)分析儀由泰州第四人民醫(yī)院提供，一次性注射器，酒精棉球，記號筆，生化管與血常規(guī)管數(shù)個。

2 方 法

2.1 試驗動物飼養(yǎng)管理 試驗動物在實驗前適應(yīng)新環(huán)境1周。飼料采用江蘇蘇姜種豬有限公司專用飼料，定量采食，每日飼喂2次，一次0.6 kg，清糞2次，每天24 h自由飲用干凈的自來水。

2.2 動物分組與給藥 24頭達(dá)到性成熟的蘇姜母豬隨機分為4組，每組6頭。受試藥設(shè)三個劑量組，分別為1倍、2倍和3倍推薦劑量組，另設(shè)一空白對照組。具體分組和給藥劑量如下：受試藥物推薦劑量組，編號1～6，每頭動物每日20 mg烯丙孕素(相當(dāng)于每次5 mL)。藥液灑在飼料的表層，經(jīng)口攝入。連用18 d。受試藥物2倍推薦劑量組，編號7～12，每頭動物每日40 mg烯丙孕素(相當(dāng)于每次10 mL)。藥液灑在飼料的表層，經(jīng)口攝入。連用18 d。受試藥物3倍推薦劑量組，編號13～18，每頭動物每日60 mg烯丙孕素(相當(dāng)于每次15 mL)。藥液灑在飼料的表層，經(jīng)口攝入。連用18 d。安慰劑(或空白)對照組，編號19～24：每頭動物每日15 mL潔凈自來水，體積相當(dāng)于3倍受試藥推薦劑量的體積。水灑在飼料的表層，經(jīng)口攝入。

2.3 評價指標(biāo) ①臨床觀察：在給藥前、給藥后對受試豬進行一般臨床觀察(脫水情況、排便情況，例如是否出現(xiàn)稀糞、軟糞或便秘等)；每天2次記錄臨床體征。②攝食量：給藥前至實驗結(jié)束時每天記錄各組受試豬的攝食量。③體重、體溫變化：試驗前、第9天和第18天(實驗結(jié)束時)各組動物分別稱量一次體重和體溫，并予以記錄。④死亡率：試驗期間記錄各組動物死亡率和存活率。⑤臨床病理學(xué)檢查：給藥前及給藥第9天和18天時(每次給藥結(jié)束后4 h內(nèi))，采集血樣進行血液學(xué)參數(shù)和血液生化學(xué)參數(shù)檢測，其中全血作血液學(xué)指標(biāo)檢驗，檢測參數(shù)包括紅細(xì)胞總數(shù)(RBC)、白細(xì)胞(WBC)總數(shù)、血紅蛋白(HGB)、血小板總數(shù)(PLT)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均血紅蛋白含量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)；血清用作生化指標(biāo)檢測，檢測參數(shù)包括總膽紅素(TBIL)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、白/球比值(A/G)、堿性磷酸酶(ALP)、肌酐 (CREA)、尿素(UREA)、血糖(GLU)、鉀、鈉、鈣、磷等指標(biāo)。⑥尸體剖檢：對實驗中死亡的所有豬尸檢。對來自或與藥物毒性，疾病或其他原因有關(guān)的死亡豬應(yīng)通過可接受的診斷技術(shù)加以確認(rèn)，并予以記錄。在最后一次給藥結(jié)束后對動物進行剖檢和肉眼檢查，對豬的卵巢、子宮及其他肉眼檢查發(fā)現(xiàn)病變的組織采用福爾馬林固定保存組織病理學(xué)檢查。

尸檢時對下列組織進行常規(guī)檢查：肝臟、腎臟、心臟、脾臟、肺臟、卵巢、子宮。根據(jù)出現(xiàn)的毒性情況決定是否對其他組織進行檢查。如果與不給藥對照組相比，高濃度劑量組的組織未出現(xiàn)與藥物相關(guān)的組織病理學(xué)變化，則較低濃度劑量組的組織不必再進行組織學(xué)檢查。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 用SPSS應(yīng)用軟件系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)的顯著性檢驗。采用t檢驗判定試驗組與對照組間均增重、血液學(xué)和血液生化學(xué)等各項指標(biāo)的差異顯著性[12]。

3 結(jié)果與分析

3.1 臨床表現(xiàn) 整個試驗期間各組動物均無死亡，存活率為100%。其中對照組20號在給藥第三天有稀便，一倍劑量組2號在給藥第四天上午、第五天下午有嘔吐現(xiàn)象，其他臨床表現(xiàn)正常，精神狀態(tài)良好，無嘔吐反應(yīng)，排便正常，攝食和飲水亦表現(xiàn)正常。受試豬給藥前、給藥第九天及最后一次給藥結(jié)束后，各組體重、飼料消耗等參數(shù)見表1，體溫變化見表2。數(shù)據(jù)顯示，與對照組相比各用藥組在試驗期間體重均基本保持穩(wěn)定或小幅增長，體溫保持穩(wěn)定(正常體溫為38～39.5 ℃)，且各劑量組在用藥第9、18天與第0天相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。說明該藥對試驗豬無毒性作用，不影響受試豬的正常生長。

3.2 血液生理學(xué)和血清生化測定結(jié)果 各組豬給藥前和試驗結(jié)束時的血液學(xué)和血清生化指標(biāo)測定結(jié)果分別見表3～表4。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，與對照組血液生理學(xué)參數(shù)相比，第九天，一倍劑量組平均血紅蛋白濃度差異顯著，三倍劑量組白細(xì)胞總數(shù)、平均血紅蛋白含量、中性粒細(xì)胞計數(shù)、單核細(xì)胞計數(shù)差異顯著(P<0.05)，平均血紅蛋白濃度差異極顯著(P<0.01)，第18天，一倍劑量組嗜堿性粒細(xì)胞計數(shù)差異顯著(P<0.05)，其他無顯著差異；與對照組血清生化參數(shù)相比，第九天，二倍劑量組氯、鈉，三倍劑量組的白蛋白、尿素差異極其顯著(P<0.01)，第18天，一倍劑量組的血糖差異顯著(P<0.05)，白蛋白差異極其顯著(P<0.01)；二倍劑量組的血糖、氯差異顯著(P<0.05)，肌酐差異極其顯著(P<0.01)，三倍劑量組鈉差異顯著(P<0.05)，白蛋白、氯差異極其顯著(P<0.01)，這些差異性與用藥劑量無關(guān)，表明烯丙孕素在3倍最大推薦劑量下對豬的血液學(xué)和臨床生化學(xué)參數(shù)無影響(表5～表6)。

“*”為差異顯著(P<0.05)，“#”為差異極顯著(P<0.01)

“*”為差異顯著(P<0.05)，“#”為差異極顯著(P<0.01)

3.3 病理學(xué)變化 試驗結(jié)束后將各組存活的豬宰殺剖檢，其中對照組、推薦劑量組、2倍推薦劑量組隨機選擇1頭，3倍推薦劑量組隨機選擇2頭，肉眼觀察剖檢豬的臟器未發(fā)現(xiàn)任何異?；蚩梢刹∽?。對3倍劑量組和對照組進行組織病理學(xué)檢查，均未發(fā)現(xiàn)明顯組織病理學(xué)變化。心：心肌細(xì)胞排列整齊，間隙正常；肝：肝板排列整齊，肝細(xì)胞正常；脾：細(xì)胞形態(tài)比較完整，無明顯病變；肺：肺泡形態(tài)正常，肺泡腔內(nèi)不存在炎細(xì)胞；腎：腎小球、腎小囊、腎小管管腔正常；胃：漿膜層、肌層、粘膜層各細(xì)胞也均正常；十二指腸：皺襞及腸絨毛形態(tài)正常；空腸：皺襞及腸絨毛形態(tài)正常，各層形態(tài)結(jié)構(gòu)均正常；卵巢：細(xì)胞形態(tài)正常，無明顯病變[13]。代表性病例切片圖見圖1。

4 討論與小結(jié)

目前國內(nèi)未見相關(guān)文獻對烯丙孕素口服液的安全性研究報道，本研究表明，烯丙孕素口服液對豬的血常規(guī)指標(biāo)無明顯影響。血常規(guī)指標(biāo)是藥物對靶動物安全性試驗指導(dǎo)原則里必須測評的指標(biāo)[14]，在各組指標(biāo)與對照組的對比中，肌酐呈整體上升趨勢，但在正常范圍之內(nèi)，且對照組存在同樣情況，肌酐是由骨骼肌肌肉內(nèi)肌酸的代謝產(chǎn)生的肌酐和食物等外源性肌酸和肌酐組成，可經(jīng)腎小球自由濾過，且不被腎小管重吸收，是腎小球濾過功能的診斷和過篩指標(biāo)，無證據(jù)表明與用藥存在相關(guān)性；白蛋白是由肝實質(zhì)細(xì)胞合成，是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，肝功能受損通常引起白蛋白降低，一倍組與三倍組雖然與對照組存在差異性，但從縱向時間與自身對照來看，并不存在差異性，無證據(jù)表明與用藥存在相關(guān)性；堿性磷酸酶是判斷膽汁淤積的酶指標(biāo)，各組在第九天出現(xiàn)了較大波動，但在第十八天恢復(fù)正常，應(yīng)是環(huán)境因素影響，無證據(jù)表明與用藥存在相關(guān)性；谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶是反應(yīng)肝細(xì)胞是否損傷以及嚴(yán)重程度的指標(biāo)，各組間含量均在正常范圍內(nèi)且無差異性。綜合試驗結(jié)果表明，各試驗組在給藥后9、18 d相應(yīng)的檢測指標(biāo)均處于正常范圍，各試驗組間無顯著差異，表明烯丙孕素口服液對豬的肝腎功能無明顯影響。

烯丙孕素作為一種人工合成的甾類促孕激素，憑借其脂溶性穿透靶細(xì)胞，與特定受體結(jié)合，降低內(nèi)源促性腺激素(LH和FSH)的血漿濃度而起作用。給藥結(jié)束之后，LH血漿濃度增加，使得卵泡能夠生長和成熟，動物同步開始發(fā)情周期。同期發(fā)情可使母豬分娩時間集中，便于母豬集中斷奶、全進全出、進入下一個繁殖周期，有效地提高母豬的繁殖率，減少病原的傳播，利于規(guī)?；i場實行嚴(yán)格的防疫制度和保證生物安全體系。

綜上所述，在血液生理學(xué)、血液生化檢測方面，推薦劑量組、2倍推薦劑量組、3倍推薦劑量組與空白對照組相比，各指標(biāo)并無顯著差異，證實烯丙孕素口服液20～60 mg內(nèi)服給藥對豬具有較大的安全性。本實驗結(jié)果為烯丙孕素的其他相關(guān)研究提供了科學(xué)依據(jù)，進而指導(dǎo)臨床合理安全用藥。

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StudyontheSafetyofAltrenogestOralSolutiontoSows

XIA Liang-you,LI Shi-yang,LI Yu-chen,LI Long-fei,YANG Hai-feng,BU Shi-jin*

(1.VeterinaryMedicineCollege,YangzhouUniversity,Yangzhou，Jiangsu225009，China; 2.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,Yangzhou，Jiangsu225009,China; 3.SecondHormoneFactoryofNingbo,Ningbo,Zhejiang315000，China)

BuShijin,E-mail:pushijin@aliyun.com

In order to evaluate the safety of altrenogest oral solution to sows, 24 heads Sujiang sows were randomly divided into 4 groups with 6 head in this test, objective is to study the safety of target animals by multi dose administration, which is the maximum recommended dose per animal daily 20 mg altrenogest (equivalent to 5 mL each time), 2 times the maximum recommended dose each animal daily 40 mg altrenogest (equivalent to 10 mL each time) and 3 times the maximum recommended dose per animal daily 60 mg altrenogest (equivalent to 15 mL each time) ; another control group, each animal gave 15 mL clean tap water, the volume is equivalent to 3 times the recommended drugs dose volume. Through the clinical observation, the weight of each group of animals, hematology and blood biochemical parameters and histopathological examination or observation, to evaluate the safety of clinical use of altrenogest. The results showed that the sows in each group did not die and were in good health during the trial period. The clinical manifestations were normal. The pathological changes were not found in the tissues of 3 times the maximum recommended dose groups. The recommended dose group,2 times the recommended dose group and the 3 times the maximum recommended dose group compared with the blank control group, there were no significant differences in the hematology and blood biochemical parameters.The test results show that altrenogest oral solution has high safety at the recommended dose for sows.

sows;altrenogest;safety of target animals

2017-04-25

A

1002-1280 (2017) 10-0046-10

S859.79

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程(PAPD)

夏良友，碩士，從事獸醫(yī)藥理及毒理學(xué)研究。

卜仕金。E-mail:pushijin@aliyun.com

(編輯：侯向輝)