宮頸癌組織中細(xì)胞周期相關(guān)激酶的表達(dá)功能與化療藥物敏感性的關(guān)系

李亞林 廖鴻純

(長沙醫(yī)學(xué)院病理教研室，湖南 長沙 410219)

宮頸癌組織中細(xì)胞周期相關(guān)激酶的表達(dá)功能與化療藥物敏感性的關(guān)系

李亞林 廖鴻純△

(長沙醫(yī)學(xué)院病理教研室，湖南 長沙 410219)

目的 探究宮頸癌組織中細(xì)胞周期相關(guān)激酶(CCRK)的表達(dá)功能與化療藥物敏感性的關(guān)系。方法 收集不同發(fā)展時(shí)期的90例宮頸癌樣本并從中提取出Caski細(xì)胞系，通過RT-PCR、Northern blot鑒定篩選最有效的細(xì)胞系克隆，建立穩(wěn)定沉默CCRK的宮頸癌細(xì)胞系模型，化療藥物順鉑、5-氟尿嘧啶處理Caski細(xì)胞系，分別檢測化療藥物處理前后的Caski細(xì)胞系的CCRK表達(dá)功能。結(jié)果 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的宮頸癌組織中CCRK蛋白表達(dá)量組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著宮頸癌臨床分期的增加，CCRK表達(dá)的陽性率逐漸升高，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的宮頸癌組織CCRK表達(dá)的陽性率組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；采用5-氟尿嘧啶處理的宮頸癌Caski細(xì)胞樣本CCRK陽性化療藥物敏感度為49.2%，采用順鉑的CCRK陽性化療藥物敏感度為62.7%，采用5-氟尿嘧啶+順鉑的CCRK陽性化療藥物敏感度為88.1%，三組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。采用5-氟尿嘧啶、順鉑及5-氟尿嘧啶+順鉑的CCRK陰性化療藥物敏感度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 宮頸癌組織中CCRK的表達(dá)功能與化療藥物敏感性具有顯著相關(guān)性，CCRK的表達(dá)能夠?yàn)閷m頸癌的臨床診斷提供參考，并能為宮頸癌的化療治療提供指導(dǎo)與參考。

宮頸癌； 細(xì)胞周期相關(guān)激酶； 化療敏感性

細(xì)胞周期相關(guān)激酶(cell cycle Related kinase，CCRK)是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶活化激酶(CAK)，在許多惡性腫瘤中均有明顯的過量表達(dá)反應(yīng)，因而成為多種惡性腫瘤的臨床檢查診斷指標(biāo)之一[1-3]。目前已有較多關(guān)于多種惡性腫瘤組織中CCRK表達(dá)功能的研究，但宮頸癌組織中CCRK的表達(dá)功能及其與化療藥物敏感性之間的相關(guān)性研究尚不多見[4]。因此，筆者將采用流式細(xì)胞檢測方法檢測宮頸癌中CCRK的表達(dá)功能，并采用四甲基偶氮唑鹽顯色法(MTT)檢測宮頸癌Caski及沉默CCRK的宮頸癌細(xì)胞系對(duì)化療藥物的敏感性，從而探索宮頸癌CCRK表達(dá)功能與化療藥物敏感性的相關(guān)性，為臨床診斷與治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本材料

收集2013年1月至2015年6月間90例不同分期宮頸癌患者的宮頸癌組織標(biāo)本作為研究對(duì)象，所有患者均經(jīng)過病理檢測已確診。年齡31～74歲，平均(57.2±12.4)歲；腫瘤分期：Ⅱ期23例，Ⅲ期44例，Ⅳ期23例，所有患者均未接受化療或放療。將病理標(biāo)本置于RNA酶抑制劑內(nèi)并低溫冷凍以備檢測之用。

1.2 試劑與儀器

RNA inhibitor，美國Sigma公司；D-Hanks液，上海Sangon生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；即用型兔抗人Survivin多克隆抗體，美國Abcam公司；即用型鼠抗人CCRK單克隆抗體，加拿大BBI公司；DAB試劑盒，美國Sigma公司；PBS緩沖液，上海Sangon生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；NC膜，上海Sangon生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；順鉑，齊魯制藥有限公司，批號(hào)：H37021362；5-氟尿嘧啶，沈陽藥大集團(tuán)琦藥業(yè)，批號(hào)：H21023380；MTT，晶美生物工程公司；流式細(xì)胞儀，美國Bacton Dickson公司；酶標(biāo)儀，BID-RAD公司。

1.3 CCRK檢測

將保存的宮頸癌病理樣本經(jīng)過研磨、分離、沉淀、溶解等處理后獲得Caski細(xì)胞系標(biāo)本，將上述細(xì)胞樣本置于80%的冰乙醇內(nèi)冷凍過夜。采用PBS緩沖液沖洗樣本2～3次，加入0.25%的去污劑(Triton X-100)處理樣本5 min，再次使用PBS緩沖液沖洗樣本2～3次。采用1%的BSA稀釋鼠抗人CCRK單克隆抗體，加入細(xì)胞樣本中，置于4 ℃恒溫下孵育12 h，使用PBS緩沖液沖洗樣本，加入標(biāo)有異硫氰酸熒光素(FITC)的羊抗鼠IgG抗體后置于室溫避光環(huán)境下孵育30min，使用PBS緩沖液洗滌標(biāo)本，再使用含有0.1%核糖核酸酶和10 μg/mL的碘化丙啶的PBS緩沖液室溫避光環(huán)境下處理30 min。之后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣本分析，檢測宮頸癌組織Caski細(xì)胞系中CCRK的表達(dá)情況[5]。

1.4 化療藥物敏感性檢測

將宮頸癌組織Caski細(xì)胞系樣本濃度配置為5×105～1×106/mL，接種到102孔板上，每個(gè)孔內(nèi)加入90 μL的細(xì)胞懸液，其中6個(gè)孔為不加化療藥物的宮頸癌細(xì)胞懸液的陽性對(duì)照組，另外6個(gè)孔內(nèi)為只有培養(yǎng)液的陰性對(duì)照組；其它90個(gè)孔加入化療藥物處理的細(xì)胞懸液樣本。具體化療藥物處理如下：200 μg/mL的5-氟尿嘧啶(5-Fu)10 μL、100 μg/mL的順鉑(DDP)10 μL，在37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)12 h；200 μg/mL的5-氟尿嘧啶10 μL+100 μg/mL的順鉑10 μL，在37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h。檢測時(shí)在每個(gè)板孔內(nèi)加入10 μL的5 mg/mL的MTT，在37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)4 h，之后加入酸化異丙醇并充分混合后檢測宮頸癌Csaki細(xì)胞系對(duì)化療藥物的敏感性[6]。每次加入藥物后只進(jìn)行本次檢測，換化療藥物時(shí)需要重復(fù)上述操作。

1.5 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)不同臨床分期的宮頸癌組織Caski細(xì)胞系中CCRK的表達(dá)情況，記錄Caski細(xì)胞系化療藥物敏感性，規(guī)定化療藥物對(duì)宮頸癌抑制率IR=(A實(shí)驗(yàn)組-A陰性對(duì)照組)/(A陽性對(duì)照組-A陰性對(duì)照組)×100%；以IR≥30%為對(duì)化療藥物敏感；IR<30%則表示對(duì)化療藥物不敏感，統(tǒng)計(jì)分析宮頸癌組織中CCRK表達(dá)與化療藥物敏感性的關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 不同分期宮頸癌組織中CCRK表達(dá)情況比較

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，分期不同的宮頸癌組織的CCRK蛋白表達(dá)水平亦不同，臨床分期越高，CCRK蛋白的表達(dá)水平越高，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的宮頸癌組織CCRK蛋白表達(dá)量組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著宮頸癌臨床分期的增加，CCRK表達(dá)的陽性率逐漸升高，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的宮頸癌組織CCRK表達(dá)的陽性率組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同分期宮頸癌組織CCRK表達(dá)情況比較

2.2 宮頸癌組織中CCRK表達(dá)與化療藥物敏感性的關(guān)系

采用5-氟尿嘧啶處理的宮頸癌Caski細(xì)胞樣本CCRK陽性化療藥物敏感度為49.2%，采用順鉑的CCRK陽性化療藥物敏感度為62.7%，采用5-氟尿嘧啶+順鉑的CCRK陽性化療藥物敏感度為88.1%，三組間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。采用5-氟尿嘧啶、順鉑及5-氟尿嘧啶+順鉑的CCRK陰性化療藥物敏感度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 宮頸癌組織中CCRK表達(dá)與化療藥物敏感性關(guān)系

3 討 論

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率一直居高不下，甚至有逐年上升趨勢[7]。據(jù)相關(guān)報(bào)道顯示，我國每年因?qū)m頸癌而死亡的病例人數(shù)多達(dá)5萬，且患病人群逐漸向年輕化發(fā)展，因此必須加強(qiáng)對(duì)宮頸癌的預(yù)防與治療意識(shí)，降低廣大女性罹患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)[8]。許多惡性腫瘤的發(fā)生與多種因素有關(guān)，除了受到外界環(huán)境的影響之外還會(huì)受到基因改變積累的影響。

CCRK是對(duì)細(xì)胞周期正向控制的關(guān)鍵因子，能夠通過磷酸化劑激活細(xì)胞周期的重要細(xì)胞調(diào)節(jié)因子的活性，從而對(duì)細(xì)胞生物行為產(chǎn)生影響。有研究證實(shí)CCRK在多種惡性腫瘤組織中存在過量表達(dá)反應(yīng)，因而可以反映細(xì)胞周期是否正常，為惡性腫瘤的臨床診斷提供參考[9-10]。吳武佳等[11]對(duì)肝細(xì)胞癌組織中的CCRK表達(dá)進(jìn)行了研究，認(rèn)為CCRK對(duì)肝細(xì)胞癌的發(fā)展具有促進(jìn)作用。邵澤偉等[12]研究了小細(xì)胞肺癌組織中CCRK的表達(dá)，認(rèn)為化療藥物的使用能夠影響CCRK的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，不同分期的宮頸癌組織中CCRK蛋白表達(dá)水平是不同的，臨床分期越高，其表達(dá)水平越高，隨著宮頸癌臨床分期的增加，CCRK表達(dá)的陽性率亦逐漸升高。此外，采用5-氟尿嘧啶處理的宮頸癌Caski細(xì)胞樣本CCRK陽性化療藥物敏感度為49.2%，采用順鉑的CCRK陽性化療藥物敏感度為62.7%，采用5-氟尿嘧啶+順鉑的CCRK陽性化療藥物敏感度為88.1%，證實(shí)宮頸癌組織中CCRK的表達(dá)與化療藥物的敏感性具有顯著的相關(guān)性。

本研究結(jié)果初步顯示，宮頸癌組織中CCRK的表達(dá)與化療藥物敏感性具有顯著相關(guān)性，CCRK的表達(dá)可能為宮頸癌的臨床診斷和化療提供一定的參考與指導(dǎo)。然而，由于樣本數(shù)量有限，所獲取的研究結(jié)果有一定的局限性，仍有待于后續(xù)深入探究宮頸癌組織中CCRK的表達(dá)與化療藥物的敏感性間的深層關(guān)系，為臨床診斷與治療宮頸癌提供參考。

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Correlation between the expression function of cell cycle related kinase (CCRK)in cervical cancer and the Chemosensitivity

LiYaling,LiaoHongchun.

DepartmentofPathology,ChangshaMedicalCollege,Changsha, 410219,Hunan,China.

Objective To explore the correlation between the expression function of cell cycle related kinase (CCRK)in cervical cancer and the Chemosensitivity. Methods Total of 90 patients with cervical cancer was collected and extracted Caski cell line from them to be researched. And the most effective cell line cloning was identified and screened by using RT-PCR, Northern blot to build a steady and silent CCRK of cervical cancer cell line model. The chemotherapeutic drugs Cisplatin and 5-fluorouracil was used to deal with Caski cell line. The expression function of CCRK of Caski cell line before and after the deal of chemotherapeutic drugs was respectively tested. Results There were statistical significantly differences in the protein expression of CCRK in cervical cancer of phase Ⅱ, phase Ⅲ and phase Ⅳ(P<0.05). As the growth of clinical stage of cervical cancer, the positive rate of CCRK expression was gradually increasing, and there were statistical significantly differences in the positive rate of CCRK expression of phase Ⅱ, phase Ⅲ and the phase Ⅳ(P<0.05). The CCRK positive chemosensitivity of Caski cell samples of cervical cancer used 5-fluorouracil was 49.2%, while it used Cisplatin was 62.7%. And the CCRK positive chemosensitivity of Caski cell samples of cervical cancer used 5-fluorouracil and Cisplatin was 88.1% and there were statistical significantly differences(P<0.05).Conclusion It has correlation between the expression function of cell cycle related kinase (CCRK)in cervical cancer and the Chemosensitivity, and the expression of CCRK can offer information guidance for clinical diagnosis and chemotherapy of cervical cancer.

Cervical cancer; Cell cycle related kinase; Chemosensitivity

湖南省教育廳資助科研項(xiàng)目(編號(hào)12C0501)

R737.33

A

1000-744X(2016)08-0801-03

2015-11-02)

△通信作者