黃丹蘭顆粒劑對肝癌Hca-F荷瘤小鼠的抗腫瘤作用及其機(jī)制

馬文杰 ，龐淑婉，李繼彬，邢正英，房志仲*

(1.天津市河?xùn)|區(qū)上杭路街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，天津 300161； 2.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點實驗室，天津 300070)

黃丹蘭顆粒劑對肝癌Hca-F荷瘤小鼠的抗腫瘤作用及其機(jī)制

馬文杰1，龐淑婉2，李繼彬2，邢正英2，房志仲2*

(1.天津市河?xùn)|區(qū)上杭路街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，天津 300161； 2.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點實驗室，天津 300070)

目的：研究黃丹蘭顆粒劑對小鼠Hca-F肝癌的生長抑制作用及機(jī)制。方法：建立小鼠Hca-F肝癌模型，口服灌胃不同濃度的黃丹蘭顆粒劑連續(xù)10 d。稱重檢測黃丹蘭顆粒劑對腫瘤生長、脾臟和胸腺指數(shù)的影響；采用ELISA法分析黃丹蘭顆粒劑對荷瘤小鼠脾巨噬細(xì)胞的吞噬活性、細(xì)胞因子分泌等免疫指標(biāo)的影響。結(jié)果：黃丹蘭顆粒劑對小鼠實體瘤生長具有抑制作用，黃丹蘭顆粒劑中劑量組與對照組相比有顯著差異(P<0.05)；實驗組小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均高于對照組。黃丹蘭顆粒劑中劑量組即可明顯促進(jìn)IL-2的產(chǎn)生，降低VEGF蛋白的表達(dá)。結(jié)論：黃丹蘭顆粒劑對Hca-F肝癌小鼠腫瘤生長有抑制作用，可能與提高荷瘤小鼠細(xì)胞和分子免疫活性有關(guān)。

黃丹蘭顆粒劑，Hca-F，抗腫瘤，免疫

黃丹蘭顆粒劑是由苦參堿、黃芪多糖、丹參乙醇提取物、三七總苷、螺旋藻、絞股蘭總皂苷和蝙蝠蛾孢菌絲體粉添加藥用輔料等組成。該方劑是以中藥湯劑的形式在臨床中應(yīng)用，具有調(diào)節(jié)免疫功能、逆轉(zhuǎn)纖維化進(jìn)程、溶解纖維斑塊的功效，主治各器官系統(tǒng)纖維化，如慢阻肺、肝硬化、動脈粥樣硬化、心肌肥大等臨床癥狀。本研究對處方中藥材的有效成分分別進(jìn)行提取及精制，并將其制成顆粒劑，并初步探討了黃丹蘭顆粒劑對小鼠Hca-F肝癌的生長抑制作用及機(jī)制，為申報新藥奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物與試劑 昆明種小鼠，雌雄各半，6～8周齡，體重(20±2) g，中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗中心提供，SPF級實驗室喂養(yǎng)；小鼠肝癌Hca-F細(xì)胞系(由大連醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室提供)；環(huán)磷酰胺粉劑(0.2 g/瓶，山西普德醫(yī)藥股份有限公司)；免疫組化試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)；黃丹蘭顆粒劑(自制)；生理鹽水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對Hac-F肝癌小鼠體內(nèi)抑瘤的作用 從液氮罐中取出小鼠肝癌Hac-F小鼠細(xì)胞株解凍，加無菌生理鹽水調(diào)整為瘤細(xì)胞濃度1×107/ml，在無菌操作下對小鼠進(jìn)行右腋皮下注射0.2 ml。24 h后隨機(jī)分為5 組，每組10 只。黃丹蘭顆粒劑低、中、高3 個劑量組(分別給予200、400和800 mg/kg的混懸液)，口服灌胃給藥1次/d(0.8 ml)，連續(xù)10 d，模型組給予等容積生理鹽水，陽性對照組注射環(huán)磷酰胺20 mg/kg。給藥后，每日觀察小鼠食欲、排便、尿液、活動等情況。停藥后次日斷頸處死小鼠，剝瘤稱重，稱胸腺和脾臟(待用)重量；計算抑瘤率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)[1，2]。黃丹蘭顆粒劑能夠抑制肝癌Hca-F荷瘤小鼠腫瘤的生長，低、中、高 3個劑量組的抑瘤率分別為22.44%、40.24%和59.78%；其中，與模型組比較，黃丹蘭顆粒劑高、中劑量組抑瘤率分別呈高度顯著性差異(P<0.01)和一般顯著性差異(P<0.05)，低劑量組與模型組的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見表1。

表1 黃丹蘭顆粒劑對肝癌 Hca-F 荷瘤小鼠抑瘤率的影響

與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 荷瘤小鼠脾巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響 取荷瘤小鼠隨機(jī)分成6組，每組10只，分別為正常組、模型組、陽性對照組和黃丹蘭低、中、高劑量組，各組給藥方法同“2.1”項。于第10次給藥后1～2 h內(nèi)，每只鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞0.4 ml，8 h后將動物脫頸椎處死，仰位固定于鼠板，腹部消毒處理，剪開皮膚經(jīng)腹部注入生理鹽水2 ml。轉(zhuǎn)動鼠板1 min，然后抽取腹腔洗液1 ml，滴涂于載玻片上，每片0.2 ml，共2片，放在墊有濕紗布的搪瓷盤中，置37 ℃孵箱中溫育30 min，取出玻片，置生理鹽水中輕輕漂洗，除去未貼片的細(xì)胞。晾干，以丙酮-甲醇(1∶1)固定5 min，再用瑞氏-吉姆薩染液，染色3～5 min，用蒸餾水輕輕沖洗，晾干，油鏡下觀察。鏡下可見巨噬細(xì)胞核呈藍(lán)色，被吞噬的雞紅細(xì)胞呈橢圓形，核呈藍(lán)色，而胞質(zhì)被染成紅色。鏡下隨機(jī)計數(shù)100 個巨噬細(xì)胞，記錄吞噬有雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)和被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)。按下列公式計算吞噬率和吞噬指數(shù)：吞噬率=100個巨噬細(xì)胞中吞噬雞紅細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)/100×100%。試驗結(jié)果顯示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠脾臟指數(shù)沒有顯著的改變，胸腺指數(shù)顯著降低；黃丹蘭顆粒劑高劑量組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)與正常組小鼠和模型組小鼠比較具有顯著性差異(P<0.01)，表明黃丹蘭顆粒劑在一定程度上能夠提高荷瘤小鼠的免疫功能，結(jié)果見表 2。

表2 黃丹蘭顆粒劑對荷瘤 小鼠免疫器官指數(shù)的影響±s，n=10)

與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 對小鼠細(xì)胞分泌細(xì)胞因子(IL-2)的水平測定 取各試驗組小鼠，眼眶球取血0.5 ml，先抽取20 μl 血液，用3%的冰醋酸稀釋20倍，輕輕搖勻后使用細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行白細(xì)胞計數(shù)。白細(xì)胞計數(shù)：在顯微鏡下用低倍鏡(100×)計數(shù)4 個大方格的白細(xì)胞總數(shù)，然后將該數(shù)乘以 50，即得每 mm3的白細(xì)胞數(shù)。將剩余血液離心(3 000 r/min)10 min，取血清待測IL-2 含量，IL-2 測定采用ELISA 酶聯(lián)免疫檢測法測定細(xì)胞因子的含量[3，4]。黃丹蘭顆粒劑組小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能與模型組相比明顯提高(P<0.01)，表明黃丹蘭顆粒劑能夠通過促進(jìn)肌體巨噬細(xì)胞的吞噬能力，提高肌體的免疫力，結(jié)果見表3。

2.4 免疫組化檢測 黃丹蘭顆粒劑低、中、高劑量各組及環(huán)磷酰胺治療組和模型組瘤體剝離后，切取標(biāo)本組織約2 mm×2 mm×2 mm，固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，5 μm 連續(xù)切片5 張，行VEGF免疫組織化學(xué)染色[5，6]。ELISA法檢測結(jié)果顯示，黃丹蘭顆粒劑中、高劑量組均能顯著升高血清中IL-2水平。VEGF表達(dá)的結(jié)果顯示，黃丹蘭顆粒劑各劑量組與模型組比較均能明顯抑制VEGF蛋白的表達(dá)，結(jié)果見表4。

表3 黃丹蘭顆粒劑對小鼠 脾巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響±s，n=10)

與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

表4 各組小鼠血清中 IL-2 和VEGF表達(dá)水平比較

與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

小鼠腹水型肝癌(Hca)細(xì)胞系是上海藥物研究所從小鼠實體型肝癌模型轉(zhuǎn)變而來，多年來用于抗腫瘤藥物的研究[7]。有研究表明，腫瘤可通過不同途徑影響肌體的免疫功能, 使荷瘤宿主呈現(xiàn)不同程度的免疫抑制狀態(tài)。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與整個肌體的免疫功能衰退或失調(diào)密切相關(guān)[8]。為研究黃丹蘭顆粒劑對小鼠Hca-F肝癌的生長抑制作用及機(jī)制，建立小鼠Hca-F肝癌模型，口服灌胃不同濃度的黃丹蘭顆粒劑，通過稱重法檢測黃丹蘭顆粒劑對腫瘤生長、脾臟和胸腺指數(shù)的影響；通過鏡檢計數(shù)檢測黃丹蘭顆粒劑對荷瘤小鼠脾巨噬細(xì)胞的吞噬活性；采用ELISA法和免疫組化法分析黃丹蘭顆粒劑對細(xì)胞因子分泌等免疫指標(biāo)的影響。實驗結(jié)果提示中、高劑量組黃丹蘭顆粒劑對小鼠實體瘤生長具有抑制作用，高劑量組更明顯(P<0.01)，并且黃丹蘭顆粒劑可以促進(jìn)荷瘤小鼠免疫功能的提高。黃丹蘭顆粒劑中劑量組即可明顯促進(jìn)IL-2的產(chǎn)生，3個給藥組均可降低VEGF蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果顯示黃丹蘭顆粒劑能夠極大地減緩Hca-F肝癌小鼠腫瘤生長速度，這或許與其能促進(jìn)細(xì)胞和分子免疫功能更好地發(fā)揮有關(guān)。

黃丹蘭顆粒劑是由苦參、黃芪、丹參、三七總苷、螺旋藻、絞股蘭總皂苷和蝙蝠蛾孢菌絲體粉等組成?？鄥⑺乜垢卫w維化的作用機(jī)制是多方面的，一方面為抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB、結(jié)締組織生長因子蛋白表達(dá)，抑制肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活與增殖，促進(jìn)肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分解；另一方面為苦參素通過調(diào)節(jié)TIMP-1/MMP-1 來抑制ECM在肝臟的沉積，從而起到對肝纖維化的拮抗作用[9,10]。臨床藥理研究證實，黃芪含有錳鐵鈣硒等微量元素，還含有黃芪多糖、黃芪皂苷和γ-氨基丁酸等，具有調(diào)節(jié)肌體免疫功能、促進(jìn)肌體代謝、抗菌等作用。黃芪主要通過抗氧化作用、抑制星狀細(xì)胞活化作用、抑制炎癥、調(diào)節(jié)免疫功能、抑制膠原合成及減少膠原蛋白沉積，起到預(yù)防和治療器官纖維化的效果。丹參能消除固有的膠原纖維[11]，同時實驗研究發(fā)現(xiàn)丹參具有良好的抗炎、抗氧化作用，通過調(diào)節(jié)Bcl-2 基因表達(dá)從而發(fā)揮抗肝纖維化作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)[13]，丹參能明顯降低肝硬化患者血清透明質(zhì)酸、層粘蛋白、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的含量，提示丹參能較好地改善肝硬化。同時丹參還具有抑制肝星狀細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的作用[14]。三七總苷具有保肝利膽的作用[15]，抑制肝細(xì)胞的凋亡可能是抗肝纖維化的作用機(jī)制[16]。螺旋藻屬稀有藻類生物，營養(yǎng)豐富，富含藻多糖、藻藍(lán)蛋白等多種生物活性成分[17]，經(jīng)研究證實具有抗氧化活性比較強(qiáng)的物質(zhì)是超氧化物歧化酶(SOD)，可以通過抗氧化作用來消除肌體內(nèi)的氧自由基損傷自身組織細(xì)胞，從而增強(qiáng)免疫功能，增加對肝腎功能的保護(hù)[18]。目前研究發(fā)現(xiàn)，螺旋藻富含有機(jī)硒，可降低小鼠纖維化肝組織的氧化應(yīng)激水平、具有抗肝纖維化、促進(jìn)肝細(xì)胞再生、抑制肝臟癌前病變的作用[19]。絞股藍(lán)含有很多種活性成分，包括黃酮類、水溶性氨基酸、絞股藍(lán)糖苷(多糖)、絞股藍(lán)皂苷、多種維生素等。絞股藍(lán)總皂苷是一種清除劑，能夠清除自由基，能夠發(fā)揮抗自由基損傷的特殊功能，能改善肝功能，對各項指標(biāo)的改善有很大作用[20]。絞股藍(lán)皂苷中，絞股藍(lán)皂苷A的抗氧化能力最突出，能提高SOD、GSH-PX酶的活性從而使抗氧化功能大大提高，能夠阻止過氧化反應(yīng)，保護(hù)肌體免受損傷，能使肝纖維化形成的速度減緩[21]。蝙蝠蛾孢菌絲體俗稱蟲草菌絲體，目前有許多關(guān)于其展開的研究，主要針對的是其對肝纖維化的延緩作用，但作用機(jī)制目前仍未有一個統(tǒng)一定論。在纖維化過程中，有諸多細(xì)胞因子的參與，例如較重要的VEGF、TGF-β1因子。有實驗研究發(fā)現(xiàn)蟲草菌絲可以抑制TGF-β1 和VEGF 表達(dá)從而能有效減輕大鼠肝纖維化過程[22]。中醫(yī)理論認(rèn)為肝纖維化的病理機(jī)制有兩個主要原因，分別是濕熱瘀毒和正氣不足，使肝纖維化發(fā)展的外因是濕熱瘀毒，正氣不足是肝纖維化發(fā)展的另外原因，在其發(fā)展中起著內(nèi)在作用，而且很重要[23]。黃丹蘭顆粒劑方中的黃芪、丹參、螺旋藻、絞股蘭總皂苷和蝙蝠蛾孢菌絲體粉均有良好的抗氧化作用[12,21,24]，可以增強(qiáng)肌體免疫功能；苦參中主要活性成分為苦參堿和氧化苦參堿，近年來研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗炎、抗菌、抗病毒、抑制免疫、抗纖維化、抗腫瘤等生物學(xué)作用[25]；三七總苷具有保肝利膽的作用[15]，研究發(fā)現(xiàn)其可以通過多種機(jī)制發(fā)揮抗肝纖維化的作用[26-29]。

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2016-09-14

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*通信作者：房志仲，E-mail:fangzhizhong@tmu.edu.cn。