少棘蜈蚣鉀通道毒素多肽KTX-Ssm175的表達(dá)、純化與鑒定

尹世金, 陳 璇, 聞閆瀚, 陸春蘭, 胡青蘭,鄒 艷,張 豐, 王 冠, 黃 鑫,黃 謹(jǐn)

(1中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢430074；2中南民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，武漢430074)

少棘蜈蚣鉀通道毒素多肽KTX-Ssm175的表達(dá)、純化與鑒定

尹世金1, 陳 璇1, 聞閆瀚1, 陸春蘭2, 胡青蘭1,鄒 艷1,張 豐1, 王 冠1, 黃 鑫1,黃 謹(jǐn)1

(1中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢430074；2中南民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，武漢430074)

采用Illumina II代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了湖北少棘蜈蚣毒腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，從中篩選到一個(gè)全新的毒素多肽編碼基因KTX-Ssm175.經(jīng)序列比對(duì)顯示KTX-Ssm175多肽與κ-SLPTX-Ssm1a高度同源，提示KTX-Ssm175多肽為一種新的電壓門控性鉀通道阻斷劑.采用基因工程技術(shù)構(gòu)建了pGEX-4T-1-KTX-Ssm175原核表達(dá)載體，通過(guò)GST融合蛋白表達(dá)法對(duì)KTX-Ssm175多肽在大腸桿菌Rosetta中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化.MALDI-TOF-MS質(zhì)譜測(cè)定顯示純化的KTX-Ssm175多肽分子量與理論值相吻合，說(shuō)明成功實(shí)現(xiàn)了KTX-Ssm175多肽的基因工程制備，為深入研究其結(jié)構(gòu)與功能提供了物質(zhì)基礎(chǔ).

少棘蜈蚣；轉(zhuǎn)錄組；KTX-Ssm175；鉀通道阻斷劑；基因工程

作為一大類跨膜蛋白家族，離子通道選擇性介導(dǎo)帶電離子進(jìn)出細(xì)胞而維持細(xì)胞正常的膜電位水平和離子濃度，參與機(jī)體多種重要的病理生理過(guò)程[1].隨著基因敲出技術(shù)的廣泛運(yùn)用，越來(lái)越多的離子通道蛋白功能得以闡明，并直接證明多種疾病的發(fā)生與離子通道蛋白結(jié)構(gòu)和功能異常密切相關(guān)[2].但由于動(dòng)物體本身具有代償機(jī)制，當(dāng)選擇性敲出某個(gè)離子通道蛋白編碼基因時(shí)，機(jī)體會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)其他具有類似功能的蛋白表達(dá)水平作為補(bǔ)償，進(jìn)而可能掩蓋被敲出的離子通道蛋白功能[3]，所以高選擇性阻斷離子通道蛋白的生物活性多肽仍然是闡明某些通道蛋白結(jié)構(gòu)和功能的重要分子工具[4].此外，靶向離子通道的生物活性多肽往往也是具有潛在藥用價(jià)值的先導(dǎo)化合物[5].

繼蝎子[6]、蜘蛛[7]、芋螺[8]等有毒動(dòng)物之后，近期研究表明蜈蚣毒腺是發(fā)現(xiàn)離子通道調(diào)節(jié)肽的重要資源庫(kù).賴韌等[9]直接從江蘇少棘蜈蚣毒液中分離了多種離子通道調(diào)節(jié)肽，并進(jìn)行了功能鑒定，其中μ-SLPTX-Ssm6a能夠阻斷哺乳動(dòng)物Nav1.7型鈉通道，產(chǎn)生了優(yōu)于嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)[10]；Rh Tx降低熱激活閾值激活TRPV1通道的門控機(jī)制，開(kāi)啟了一條嶄新的控制痛覺(jué)感受器途徑[11]；阻斷哺乳動(dòng)物鉀通道的κ-SLPTX-Ssm1a，能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的殺昆蟲(chóng)活性[9].對(duì)于能夠?qū)嵭写笠?guī)模養(yǎng)殖的蜈蚣，如少棘蜈蚣，其毒液中高豐度表達(dá)的活性多肽可以直接分離提取[9,10,11]，然而對(duì)于低豐度表達(dá)的蜈蚣毒素多肽，尤其是對(duì)于不能大規(guī)模養(yǎng)殖的蜈蚣，直接從蜈蚣毒液中提取離子通道調(diào)節(jié)肽必然受限，而聯(lián)合使用現(xiàn)代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和基因工程制備技術(shù)，能有效克服這一弊端.

本研究通過(guò)對(duì)湖北少棘蜈蚣毒腺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了一條新的蜈蚣毒素多肽編碼基因KTX-Ssm175，其成熟肽與另一蜈蚣毒素多肽κ-SLPTX-Ssm1a存在三個(gè)氨基酸殘基的差異，既然KTX-Ssm175多肽未曾在以往的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中報(bào)道，提示其可能是一低豐度表達(dá)的多肽，不易直接從蜈蚣毒液中分離提取.本研究擬采用外源基因的原核表達(dá)技術(shù)，對(duì)KTX-Ssm175進(jìn)行表達(dá)純化，以期實(shí)現(xiàn)蜈蚣源性離子通道調(diào)節(jié)肽的常規(guī)基因工程制備，提高蜈蚣源性離子通道調(diào)節(jié)肽的挖掘效率，也為進(jìn)一步深入研究KTX-Ssm175多肽的結(jié)構(gòu)與功能提供物質(zhì)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

pGEX-4T-1、實(shí)驗(yàn)菌株DH5α、E.coli/Rosetta(DE3)等為本實(shí)驗(yàn)室保存.限制性內(nèi)切酶BamH I、NdeI和XhoI、PCR所用pfu酶、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自Takara公司；T4DNA連接酶、DNA Marker、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自Fermentas公司；PCR引物由武漢天一輝遠(yuǎn)合成；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、還原型谷胱甘肽GSH和氧化性谷胱甘肽GSH購(gòu)自武漢眾一生物技術(shù)公司；小腸激酶(Enterokinase, EK)購(gòu)自武漢摩爾生物公司，小分量蛋白Marker購(gòu)自武漢丁香園科技有限公司；10 KD、3 KD截留超濾管購(gòu)自Milipore公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2 pGEX-4T-1-KTX-Ssm175重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)KTX-Ssm175的編碼序列分別設(shè)計(jì)4條overlap PCR引物：KTX-Ssm175-FP1，5′CTGGGATCCGATGACGATGACAAGACCGATGATAAAAGCAGCAACAAATGCGCGAAAA3′，單劃線為BamH I酶切位點(diǎn)，雙下劃線為編碼EK酶酶切位點(diǎn)的核酸序列；KTX-Ssm175 -FP2，5′ACAAATGCGCGAAAACCAAACGCCGCGAAGATGTGTGCCGCGT GTGCGGCAACCGCAG3′；KTXSsm175-RP2，5′ATAATCGCTTTCGCAGCATTCGCTATAATATTC ATCGTTGCCGCTGCGGTTGCCGCAC3′；KTXSsm175-RP1，5′CCGCTCGAGTCAGTT GCGCAGCAGATCCAGGCAGCGTTCATAGCGATAATCGCTTTCGCA3′，單劃線為XhoI酶切位點(diǎn).

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，72℃終延伸2 min，28次循環(huán).PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收純化.將純化的質(zhì)粒pGEX-4T-1和KTX-Ssm175用BamH I和XhoI雙酶切后連接過(guò)夜.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)菌中.挑取陽(yáng)性克隆子，進(jìn)行PCR鑒定并進(jìn)行序列測(cè)定.

1.3 KTX-Ssm175多肽的表達(dá)、純化與質(zhì)譜鑒定

將測(cè)序正確的KTX-Ssm175重組子轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌種E.coli/Rosetta(DE3)中.挑取的陽(yáng)性菌株于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為1 mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，28℃培養(yǎng)4 h，離心收集菌體，超聲破碎，離心取上清液，采用GSH親和層析法對(duì)GST-KTX-Ssm175融合蛋白進(jìn)行分離，分離后的融合蛋白用EK酶酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物采用RP-HPLC技術(shù)進(jìn)行目的蛋白的分離純化.在純化過(guò)程中取樣進(jìn)行Tricine系統(tǒng)的SDS-PAGE電泳，純化后的KTX-Ssm175多肽使用MALDI-TOF-MS技術(shù)精確測(cè)量其分子量.

2 結(jié)果

2.1 KTX-Ssm175的一級(jí)結(jié)構(gòu)特征分析

KTX-Ssm175的編碼基因信息由本驗(yàn)室構(gòu)建的湖北少棘蜈蚣轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得.KTX-Ssm175的先導(dǎo)cDNA序列全長(zhǎng)402 bp，由5′未翻譯區(qū)(5′UTR)、開(kāi)放閱讀框(ORF)和3′未翻譯區(qū)(3′UTR)三部分組成，其中5′UTR長(zhǎng)31 bp，3′UTR長(zhǎng)146 bp，在3′UTR區(qū)多聚腺苷酸尾巴上游33 bp處可發(fā)現(xiàn)AATAAA加尾信號(hào)(圖1a).ORF編碼74個(gè)氨基酸殘基的前肽，SignalPV3.0 http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/在線預(yù)測(cè)提示KTX-Ssm175前肽中含有23個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的信號(hào)肽，緊跟其后的是由51個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的成熟肽，成熟肽通過(guò)六個(gè)半胱氨酸形成的三對(duì)二硫鍵維持空間結(jié)構(gòu).同源序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，KTX-Ssm175多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)與已報(bào)道的蜈蚣毒素多肽κ-SLPTX-Ssm1a具有94.12%的相似性(圖1b)，提示KTX-Ssm175可能具有阻斷哺乳動(dòng)物初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元電壓門控性鉀通道的生物學(xué)功能[9].

單下劃線：信號(hào)肽；雙下劃線：加尾信號(hào)aataaa；灰色背景字：半胱氨酸殘基；數(shù)字：氨基酸殘基位次；灰色字體：差異氨基酸殘基圖1 KTX-Ssm175的cDNA和氨基酸序列(a)及其與κ-SLPTX-Ssm1a成熟肽序列比對(duì)結(jié)果(b)Fig.1 cDNA and amino acids sequence of KTX-Ssm175(a) and sequence alignments of peptide KTX-Ssm175 with κ-SLPTX-Ssm1a(b)

2.2 pGEX-4T-1-KTX-Ssm175原核表達(dá)載體的構(gòu)建

本研究室以往采用pGEX-4T-1質(zhì)粒為表達(dá)載體，成功實(shí)現(xiàn)了蜈蚣源性活性多肽的基因工程制備[12]，與課題組以往研究方法類似，本研究采用BamH I和XhoI內(nèi)切酶將KTX-Ssm175編碼基因插入到pGEX-4T-1質(zhì)粒GST編碼基因下游的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建了pGEX-4T-1-KTX-Ssm175原核表達(dá)載體(圖2a).通過(guò)兩輪的overlap PCR擴(kuò)增得到KTX-Ssm175的全長(zhǎng)片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見(jiàn)約200 bp的亮帶，與理論堿基數(shù)值相符(圖2b).對(duì)PCR產(chǎn)物和PGEX-4T-1質(zhì)粒進(jìn)行BamH I和XhoI雙酶切連接轉(zhuǎn)化后，獲得了轉(zhuǎn)化有PGEX-4T-1-KTX-Ssm175重組質(zhì)粒的Rosetta陽(yáng)性菌落，陽(yáng)性菌提取質(zhì)粒后進(jìn)行BamH I和XhoI雙酶切，也獲得了約200 bp的DNA片段(圖2c)，DNA測(cè)序證明重組的原核表達(dá)載體PGEX-4T-1-KTX-Ssm175構(gòu)建成功，可用于GST-KTX-Ssm175融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá).

BamH I和Xho I之間為KTX-Ssm175的基因插入位點(diǎn)a) pGEX-4T-1-KTX-Ssm175載體的構(gòu)建

M)marker；1)KTX-Ssm175 b)KTX-Ssm175基因擴(kuò)增產(chǎn)物

M) marker；1) 雙酶切后目的基因和PGEX-4T-1載體；2)陽(yáng)性對(duì)照c)pGEX-4T-1-KTX-Ssm175的BamH I和Xho I雙酶切結(jié)果 圖2 pGEX-4T-1-KTX-Ssm175載體的構(gòu)建和質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Construction of pGEX-4T-1-KTX-Ssm175 vectors and plasmid identification by double enzyme digestion

2.3 GST-KTX-Ssm175融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道，28℃下將Rosetta基因工程菌培養(yǎng)到OD600值介于0.6～0.8時(shí)，通過(guò)改變加入的IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)程來(lái)優(yōu)化GST-KTX-Ssm175融合蛋白表達(dá)條件.在28℃、 IPTG濃度為1.0 mM時(shí)，一定時(shí)程內(nèi)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，多肽表達(dá)產(chǎn)量逐漸升高，當(dāng)延長(zhǎng)到4 h后達(dá)到較為理想的效果，此后再延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間，目的蛋白表達(dá)量并無(wú)顯著提高(圖3a).在28℃誘導(dǎo)4 h的固定條件下，進(jìn)一步比較不同濃度IPTG誘導(dǎo)劑對(duì)GST-KTX-Ssm175融合蛋白表達(dá)產(chǎn)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.5, 1.0, 1.5 mmol/L 濃度的IPTG均達(dá)到比較理想的誘導(dǎo)效果(圖3b)，為保證目的蛋白能夠得以穩(wěn)定誘導(dǎo)，本研究選用1.0 mM 中間濃度的IPTG、28℃誘導(dǎo)4 h后收獲誘導(dǎo)菌體進(jìn)行目的蛋白的分離純化和鑒定.

2.4 KTX-Ssm175多肽的制備和鑒定

將pGEX-4T-1-KTX-Ssm175重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，依據(jù)本研究?jī)?yōu)化的條件進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)GSH親和層析、超濾脫鹽并濃縮后，獲得GST-KTX-Ssm175融合蛋白，用EK酶酶切后，在SDS-PAGE電泳圖上顯示兩條主要的條帶，一條為26 KD的GST，另一條約6 KD條帶可能為KTX-Ssm175多肽(圖4a第4泳道).將EK酶酶切后的蛋白混合物經(jīng)RP-HPLC的C18柱分離純化，采用50 min的溶液梯度線性洗脫，在190 nm的紫外波長(zhǎng)下檢測(cè)顯示，在32 min穩(wěn)定出現(xiàn)的峰應(yīng)該為GST所在位置(根據(jù)以往的文獻(xiàn)報(bào)道推斷)，而在之前14 ～15 min時(shí)段出現(xiàn)了3個(gè)峰，這3個(gè)峰之一可能為目的蛋白KTX-Ssm175多肽所在位置(圖4b).收集14 min和15 min時(shí)段出現(xiàn)的兩個(gè)主峰A和B對(duì)應(yīng)的蛋白，SDS-PAGE電泳顯示A蛋白分子量要略高于B蛋白(圖4a第5和第6泳道).經(jīng)MALDI-TOF-MS分子質(zhì)量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)A蛋白分子量為6041.7(圖4c)，B蛋白分子量為5298.5，而KTX-Ssm175多肽的分子量理論值為6041.6，表明A蛋白就是KTX-Ssm175多肽.實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：在采用GST親和層析法進(jìn)行KTX-Ssm175多肽的基因工程制備時(shí)，應(yīng)高度重視RP-HPLC分離純化過(guò)程混雜蛋白對(duì)KTX-Ssm175多肽的干擾，需重點(diǎn)收集14 ～15 min時(shí)段出現(xiàn)的第1個(gè)主峰所對(duì)應(yīng)的蛋白樣品.

a)純化的KTX-Ssm175多肽SDS-PAGE電泳分析：M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，1為未誘導(dǎo)蛋白，2為誘導(dǎo)4 h后的蛋白，3為純化并超濾脫鹽后濃縮的GST-KTX-Ssm175，4為GST-KTX-Ssm175融合蛋白EK酶酶切后的混合物，5為RP-HPLC在15 min分離出的產(chǎn)物，6為RP-HPLC在14 min分離出的產(chǎn)物；b)KTX-Ssm175多肽的RP-HPLC純化結(jié)果：A為14 min的出鋒圖，B為15 min的出鋒圖；c)KTX-Ssm175多肽的MALDI- TOF-MS質(zhì)譜分析圖4 KTX-Ssm175多肽的制備和鑒定Fig.4 Preparation and identification of polypeptide KTX-Ssm175

3 討論

目前獲得有毒動(dòng)物來(lái)源的生物活性多肽主要有三種途徑，直接從有毒動(dòng)物分泌的毒液中分離[9,10]、人工合成[11]和基因工程制備[14].如果有毒動(dòng)物的毒液易于獲取，且生物活性多肽表達(dá)豐度高，就可以直接從有毒動(dòng)物的毒液中提取分離；如果生物活性多肽結(jié)構(gòu)不復(fù)雜，含二硫鍵少，就可以根據(jù)生物活性多肽氨基酸殘基順序進(jìn)行人工合成.利用真核或者原核表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)生物活性多肽進(jìn)行基因工程制備，則不受上述條件的限制，是目前獲得有毒動(dòng)物源性離子通道調(diào)節(jié)肽的主要方式.越來(lái)越多的研究表明蜈蚣毒腺分泌了多種類型的離子通道調(diào)節(jié)肽[15]，這些鑒定了功能的蜈蚣毒素多肽大多直接從蜈蚣毒液中分離提取[9,10,11]，由于受動(dòng)物毒液來(lái)源限制，這些離子通道調(diào)節(jié)肽多來(lái)自大規(guī)模養(yǎng)殖的少棘蜈蚣.相比于蝎子[14]、蜘蛛[7]等有毒動(dòng)物來(lái)源的離子通道調(diào)節(jié)肽，蜈蚣源性離子通道調(diào)節(jié)肽的基因工程制備相對(duì)滯后.

本研究從湖北少棘蜈蚣毒腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了一條新的蜈蚣毒素多肽編碼基因KTX-Ssm175，該基因編碼的成熟肽與已報(bào)到的另一蜈蚣毒素多肽k-SLPTX-Ssm1a高度同源(圖1b)，均含有51個(gè)氨基酸殘基和三對(duì)二硫鍵，二者僅存在三個(gè)氨基酸殘基的差異，提示KTX-Ssm175可能是一個(gè)鉀離子通道調(diào)節(jié)肽[9].對(duì)應(yīng)于κ-SLPTX-Ssm1a多肽N末端第4位的谷氨酸、第17位的天冬酰胺和第43位的組氨酸，KTX-Ssm175依次為賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，二者的差異均體現(xiàn)在帶電荷氨基酸殘基上，而帶電荷氨基酸殘基引起的靜電相互作用是毒素多肽識(shí)別離子通道的主要分子間作用力[16]，提示KTX-Ssm175與κ-SLPTX-Ssm1a在調(diào)節(jié)離子通道功能上可能存在一定的差異.KTX-Ssm175多肽的編碼基因是從湖北少棘蜈蚣毒腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得，無(wú)論是編碼基因還是成熟肽信息均未在以往的文獻(xiàn)中報(bào)道，提示KTX-Ssm175在少棘蜈蚣毒腺中可能呈低豐度表達(dá)狀態(tài).

因此，本研究采用本室以往的蝎毒素多肽原核表達(dá)技術(shù)[13]，通過(guò)基因工程的方法構(gòu)建了PGEX-4T-1-KTX-Ssm175表達(dá)載體，在基因工程菌Rosseta中實(shí)現(xiàn)了GST-KTX-Ssm175融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，融合蛋白經(jīng)EK酶酶切后在RP-HPLC系統(tǒng)中進(jìn)行了KTX-Ssm175多肽的分離，并經(jīng)MALDI-TOF-MS成功鑒定了KTX-Ssm175多肽的分子量.與以往蝎毒素多肽基因工程制備結(jié)果有所不同，GST-KTX-Ssm175融合蛋白在進(jìn)行EK酶酶切后，經(jīng)RP-HPLC系統(tǒng)分離出了多個(gè)組分(圖4b)，MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定表明，僅有其中一個(gè)組分的分子量與KTX-Ssm175多肽的理論值相吻合(圖4b)，另一組分的分子量要略微小于KTX-Ssm175多肽理論值，可能是由于EK酶對(duì)GST-KTX-Ssm175融合蛋白產(chǎn)生了非特異性切割，或本研究的表達(dá)條件不夠理想，還需要不斷優(yōu)化.總之，本研究為實(shí)現(xiàn)蜈蚣源性離子通道調(diào)節(jié)肽的基因工程制備提供了重要的技術(shù)參考，也為深入研究KTX-Ssm175多肽的結(jié)構(gòu)與功能奠定了物質(zhì)基礎(chǔ).

[1] Gu Y,Gu C.Physiological and pathological functions of mechanosensitive ion channels [J].Mol Neurobiol,2014,50(2):339-347.

[2] Verkman A S.Knock-out models reveal new aquaporin functions [J].Handb Exp Pharmacol,2009,190(190):359-381.

[3] Zhou C,Huang Z,Ding L,et al.Altered cortical GABAA receptor composition,physiology,and endocytosis in a mouse model of a human genetic absence epilepsy syndrome [J].J Biol Chem,2013,288(29):21458-21472.

[4] Morales-Lázaro SL,Hernández-García E,Serrano-Flores B,et al.Organic toxins as tools to understand ion channel mechanisms and structure [J].Curr Top Med Chem,2015,15(7):581-603.

[5] Kirchhof P,Tal T,Fabritz L,et al.First report on an inotropic peptide activating tetrodotoxin-sensitive,″neuronal″ sodium currents in the heart [J].Circ Heart Fail,2015,8(1):79-88.

[6] Kuzmenkov A I,Grishin E V,Vassilevski A A.Diversity of potassium channel ligands: focus on scorpion toxins [J].Biochemistry (Mosc),2015,80(13):1764-1799.

[7] Klint J K,Chin Y K,Mobli M.Rational engineering defines a molecular switch that is essential for activity of spider-venom peptides against the analgesics target NaV1.7 [J].Mol Pharmacol,2015,88(6):1002-1010.

[8] Mir R,Karim S,Kamal M A,et al.Conotoxins: structure,therapeutic potential and pharmacological applications [J].Curr Pharm Des,2016,22(5):582-589.

[9] Yang S,Liu Z,Xiao Y,et al.Chemical punch packed in venoms makes centipedes excellent predators [J].Mol Cell Proteomics,2012,11(9):640-650.

[10] Yang S,Xiao Y,Kang D,et al.Discovery of a selective NaV1.7 inhibitor from centipede venom with analgesic efficacy exceeding morphine in rodent pain models [J].PNAS,2013,110(43):17534-17539.

[11] Yang S,Yang F,Wei N,et al.A pain-inducing centipede toxin targets the heat activation machinery of nociceptor TRPV1 [J].Nat Commun,2015,6: 8297.

[12] 尹世金，李羽欣，陸春蘭，等.少棘蜈蚣鈉通道毒素NTX-Ssm97的表達(dá)純化及鑒定 [J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014，33(2)：49-53.

[13] Dai H,Yin S,Li T,et al.Recombinant expression,purification,and characterization of scorpion toxin BmαTX14 [J].Protein Expr Purif,2012,82(2):325-331.

[14] Zhang C,Xie Z,Li X,et al.Molecular basis for the toxin insensitivity of scorpion voltage-gated potassium channel MmKv1 [J].Biochem J,2016,473(9):1257-1266.

[15] Liu Z C,Zhang R,Zhao F,et al.Venomic and transcri- ptomic analysis of centipede Scolopendra subspinipes dehaani [J].J Proteome Res,2012,11(12):6197-6212.[16] Han S,Yin S,Yi H,et al.Protein-protein recognition control by modulating electrostatic interactions [J].J Proteome Res,2010,9(6):3118-3125.

Expression, Purification and Identification of Potassium Channel Toxins KTX-Ssm175 fromScoropendrasubspinipesmutilans

Yin Shijin1, Chen Xuan1,Wen Yanhan1, Lu Chunlan2, Hu Qinglan1, Zou Yan1,ZhangFeng1,WangGuan1,HuangXing1,HuangJin1

(1 College of Pharmacy, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074，China;2 College of Biomedical Engineering, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074，China)

A new toxin polypeptide gene ofKTX-Ssm175 was screened by constructing the venomous transcriptome database ofScolopendrasubspinipesmutilansfrom Hubei Province, using Illumina second generation transcriptome sequencing technology. Sequence alignment showed that the polypeptide of KTX-Ssm175 was highly homologous to κ-SLPTX-Ssm1a, suggesting KTX-Ssm175 polypeptide might be a novel voltage-gated potassium channel blocker. A prokaryotic expression vector pGEX-4T-1-KTX-Ssm175 was constructed by genetic engineering and KTX-Ssm175 polypeptides were expressed and purified inE.coliRosetta by GST fusion protein expression. MALDI-TOF-MS mass spectrometry showed that the molecular weight of the purified KTX-Ssm175 were consistent with the theoretical value. So genetic engineering preparation of KTX-Ssm175 polypeptide was successfully achieved, providing the material foundation for further study about its structure and function.

Scolopendrasubspinipesmutilans; transcriptome; KTX-Ssm175; potassium channel blocker; genetic engineering

2016-05-12

尹世金(1974-) ，男，教授，博士，研究方向: 電生理學(xué)與基因工程制藥，E-mail: yinshijinyf@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373379)；湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015CFB491)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(GCX15009)

Q812

A

1672-4321(2016)04-0043-05