癌基因YAP1促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)遷移和腫瘤形成

胡麗梅

(白城中心醫(yī)院，吉林 白城137000)

癌基因YAP1促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)遷移和腫瘤形成

胡麗梅

(白城中心醫(yī)院，吉林 白城137000)

目的 研究YAP1在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響。方法 采用免疫組織化學(xué)的方法在30例三陰性乳腺癌樣本中進(jìn)行YAP1染色；通過RNA干擾技術(shù)研究YAP1對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖、遷移及皮下成瘤的影響。結(jié)果 與對(duì)照的正常乳腺組織相比，三陰性乳腺癌樣本中YAP1的表達(dá)量顯著升高；在MDA-MB-231細(xì)胞中敲低YAP1能夠顯著抑制其細(xì)胞增殖、遷移及腫瘤形成能力。結(jié)論 YAP1是潛在的三陰性乳腺癌診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。YAP1可以通過影響乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移來(lái)促進(jìn)三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

YAP1；三陰性乳腺癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

(ChinJLabDiagn,2016,20:1995)

乳腺癌是女性排名第一的常見惡性腫瘤，約占女性新發(fā)惡性腫瘤的30%[1]。大部分的乳腺癌可以通過手術(shù)和放化療進(jìn)行治療，然而一些惡性程度比較高的乳腺癌，如三陰性乳腺癌，仍然威脅著患者的生命。三陰性乳腺癌是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長(zhǎng)因子受體(Her-2)均為免疫組織化學(xué)檢測(cè)陰性的一種乳腺癌病理類型，占所有乳腺癌的15%[2]。相對(duì)于其它乳腺癌分型，三陰性乳腺癌預(yù)后更差且發(fā)病年齡更年輕[2]。遺憾的是，目前并沒有針對(duì)三陰性乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療指南。因此，加快三陰性乳腺癌的早期診斷和治療靶點(diǎn)的尋找成為乳腺癌研究的重要問題。

Hippo 信號(hào)通路是從果蠅到哺乳動(dòng)物中高度保守的一條信號(hào)通路，這條信號(hào)通路可以同時(shí)調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡來(lái)調(diào)節(jié)組織器官大小。近年，Hippo信號(hào)通路在人類腫瘤中的研究備受關(guān)注[3,4]。Hippo 信號(hào)通路由一條激酶鏈和轉(zhuǎn)錄共激活子組成。簡(jiǎn)單來(lái)說，上游信號(hào)激活MST1/2(serine/threonine kinase 4/3)和它的調(diào)節(jié)亞基SAV1 (Salvador family WW domain containing protein 1)，它們相互結(jié)合后促進(jìn)MST1/2的活化并進(jìn)一步磷酸化LATS1/2 (large tumor suppressor kinase 1/2)[5];當(dāng)LATS1/2被激活后，YAP1/TAZ (yes associated protein 1/WW domain containing transcription regulator 1)立刻被其磷酸化而并定位在細(xì)胞漿中，從而限制了YAP1/TAZ進(jìn)入細(xì)胞核中執(zhí)行轉(zhuǎn)錄激活的功能。與此同時(shí)，細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子 TEAD(TEA domain transcription factor family)失去了YAP/TAZ 的結(jié)合和共激活作用，直接導(dǎo)致下游轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)下調(diào)，從而降低細(xì)胞增殖速度和遷移能力[6-10]。越來(lái)越多的研究表明， Hippo信號(hào)通路的成員在多種腫瘤中發(fā)生突變或擴(kuò)增。例如，NF2在腦瘤中多發(fā)突變[11]；LATS2 表達(dá)量降低直接導(dǎo)致白血病對(duì)化療藥物敏感性降低[12]；TAZ在20%的侵潤(rùn)性乳腺癌腫組織樣本高表達(dá)，其表達(dá)量與乳腺癌惡性程度成正相關(guān)[13,14]；而YAP1被發(fā)現(xiàn)在前列腺癌和肝癌的染色體上發(fā)生擴(kuò)增[15]。這些數(shù)據(jù)表明Hippo信號(hào)通路的活化程度與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而，關(guān)于Hippo信號(hào)通路與三陰性乳腺癌的研究非常有限。本研究旨在揭示YAP1與三陰性乳腺癌之間的關(guān)聯(lián)。

本研究檢測(cè)了30例三陰性乳腺癌樣本中YAP1的表達(dá)，染色結(jié)果表明YAP1在三陰性乳腺癌中過量表達(dá)，提示YAP1可能成為三陰性乳腺癌早期診斷的分子標(biāo)志物。另外，YAP1的過量表達(dá)也預(yù)示著其在三陰性乳腺癌發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。細(xì)胞水平的研究表明YAP1可以促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和皮下成瘤能力。因此，靶向YAP1是一個(gè)潛在的三陰性乳腺癌的治療方向。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚胎腎細(xì)胞HEK293T和乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)是保存；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于Invitrogen公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine2000 購(gòu)自Invitrogen公司；transwell小室購(gòu)自于BD公司；YAP1 抗體購(gòu)買于Cell Signaling Technology公司。pMKO-shYAP1(TRCN0000107266和TRCN0000107267)質(zhì)粒購(gòu)買于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué) 5 μm厚的人乳腺癌樣本切片經(jīng)65℃二甲苯脫蠟以及梯度酒精水化后，在檸檬酸緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)。具體修復(fù)條件為：95℃,30 min；121℃高壓，10 s；溫度降至85℃后室溫放置20 min。自來(lái)水沖洗3次后，用3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶。30 min后，TBST(Tris-buffered saline,0.1% Tween 20)洗滌3次，5 min。然后用10%馬血清封閉1 h。YAP1抗體按照1∶100稀釋于封閉液中并均勻覆蓋在組織切片表面，切片置于濕盒中4℃過夜。次日，切片用TBST洗滌3次，每次5 min，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。經(jīng)TBST洗滌后進(jìn)行DAB顯色。最后進(jìn)行蘇木素復(fù)染、封片和拍照。三位研究者雙盲情況下對(duì)YAP1的表達(dá)水平給予評(píng)分(0-3分)。

1.2.2 YAP1敲低細(xì)胞株的建立 將狀態(tài)良好的HEK293T傳代。次日，按VSVG:GAG:pMKO-shYAP1(或pMKO空載體)=2∶2∶3的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染(具體操作參照 Invitrogen 說明書)，6 h后換液。轉(zhuǎn)染24 h后開始收集培養(yǎng)基中的病毒，每隔8 h收集1次。通過3 000 rpm/min離心將收集好的病毒中殘留的HEK293T細(xì)胞去除后，用上清中的反轉(zhuǎn)錄病毒感染密度約40%的三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞。感染48 h后開始加入嘌呤霉素篩選5 d至無(wú)細(xì)胞死亡。進(jìn)行細(xì)胞凍存以及細(xì)胞增殖、遷移和體外成瘤實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 免疫印跡 在1×107狀態(tài)良好的細(xì)胞中加入1 ml 細(xì)胞裂解液(50 mM Tris,150 mM NaCl,0.5%NP40,新鮮加入蛋白酶抑制劑)于冰上裂解30 min。將裂解后的蛋白加入上樣緩沖液后在99℃煮10 min。10%丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。5%牛奶室溫封閉1 h后，加入YAP1抗體4℃過夜。次日，TBST洗滌3次后，加入二抗室溫孵育1 h。最后顯色并于暗室顯影。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的穩(wěn)定表達(dá)pMKO-shYAP1細(xì)胞或者對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化及細(xì)胞計(jì)數(shù)；6孔板中每孔種植3×105個(gè)細(xì)胞，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)立三個(gè)重復(fù)。在生長(zhǎng)曲線計(jì)數(shù)過程中，隔天更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液。從種植后第二天開始，每天用紅血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 穩(wěn)定表達(dá)pMKO-shYAP1細(xì)胞或者對(duì)照細(xì)胞經(jīng)過血清饑餓16 h后，胰酶消化及細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基懸??；在24孔板下室中加入600 μl含5%胎牛血清的培養(yǎng)基，然后將小室放在24孔板中；取1×105個(gè)細(xì)胞加入Transwell小室，培養(yǎng)24 h；吸掉小室上層培養(yǎng)基，用PBS洗滌兩次，然后用4%多聚甲醛室溫固定20 min；用棉簽擦去上層小室內(nèi)的細(xì)胞；將整個(gè)Transwell小室浸入到0.1%結(jié)晶紫中染色10 min，顯微鏡下拍照(拍攝小室的正中以及上下左右的5個(gè)視野)，計(jì)算穿過Transwell膜的細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 皮下成瘤實(shí)驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的穩(wěn)定表達(dá)pMKO-shYAP1細(xì)胞或者對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化及細(xì)胞計(jì)數(shù)；將細(xì)胞以1×107的密度懸浮于PBS中，然后以皮下注射的方式注入到5-6周大的雌性BALB/c裸鼠中。每只裸鼠注射1×106個(gè)細(xì)胞，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)立14只裸鼠。定期觀察裸鼠成瘤及健康狀況，四周后處死裸鼠，取出皮下腫瘤進(jìn)行質(zhì)量稱重及拍照。

2 結(jié)果

2.1 YAP1在三陰性乳腺癌樣本中高表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，YAP1 在正常乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中呈中等表達(dá)，而在三陰性乳腺癌樣本中則大量表達(dá)(圖 1)。對(duì)YAP1染色強(qiáng)度進(jìn)行多名研究者雙盲打分后，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示YAP1在三陰性乳腺癌中表達(dá)量顯著高于正常乳腺組織(圖 1)。提示YAP1可能參與三陰性乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。另外，YAP1也是潛在的三陰性乳腺癌診斷標(biāo)志物。

圖1 YAP1 在三陰性乳腺癌中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)YAP1在正常乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞(左)和三陰性乳腺癌腫瘤細(xì)胞(中)中的表達(dá)，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較YAP1在正常和腫瘤組織中的表達(dá)差異(右)。免疫組化圖片為20倍放大。

2.2 特異性敲低三陰性乳腺癌細(xì)胞中YAP1的表達(dá) 為了研究YAP1在三陰性乳腺癌細(xì)胞中的作用，研究者運(yùn)用RNA干擾技術(shù)特異性靶向三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231內(nèi)的YAP1。如圖2所示，MDA-MB-231細(xì)胞中的YAP1表達(dá)量降低了90%。為了防止RNA干擾技術(shù)的脫靶效應(yīng)，2條不同的shRNA被選擇進(jìn)行敲低實(shí)驗(yàn)。穩(wěn)定敲低YAP1表達(dá)的細(xì)胞株的建立為后續(xù)研究YAP1對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和皮下成瘤能力的影響奠定了基礎(chǔ)。

圖2 特異性敲低YAP1的表達(dá)

免疫印跡檢測(cè)shRNA干擾技術(shù)建立的穩(wěn)定敲低YAP1的細(xì)胞株中YAP1表達(dá)量的變化，β-actin在這里視為內(nèi)參(左)。免疫印跡的灰度值定量分析比較對(duì)照和shYAP1敲低細(xì)胞中YAP1的表達(dá)水平(右)。***表示P<0.001。

2.3 敲低YAP1抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移 Hippo信號(hào)通路在腫瘤中的作用主要表現(xiàn)在精密調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、浸入和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等生物學(xué)過程。正如之前的研究報(bào)道，YAP1能夠顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[15]，因此研究者利用RNA干擾技術(shù)來(lái)檢測(cè)YAP1對(duì)于三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力的影響。如圖 3(左)所示，在三陰性乳腺癌細(xì)胞中給敲低YAP1后，細(xì)胞的增殖活力明顯減慢。同時(shí)，transwell實(shí)驗(yàn)表明，敲低YAP1顯著降低了MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力(圖 3右)。

2.4 敲低YAP1抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞皮下成瘤能力 裸鼠皮下成瘤模型是檢驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞成瘤能力的常規(guī)實(shí)驗(yàn)。為了測(cè)定YAP1敲低是否能夠影響三陰性乳腺癌的腫瘤形成能力，我們進(jìn)行了裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)。如圖 4所示，YAP1敲低的MDA-MB-231細(xì)胞仍然能夠在裸鼠體能形成腫瘤，但是腫瘤的體積和質(zhì)量較對(duì)照組顯著減小。這一結(jié)果提示，如果能夠有效干預(yù)三陰性乳腺癌中YAP1的表達(dá)，則可以顯著減小腫瘤的大小。因此YAP1是一個(gè)潛在的三陰性乳腺癌的治療靶標(biāo)。

3 討論

相對(duì)于其它病理類型的乳腺癌，三陰性乳腺癌患者具有較差的預(yù)后。這一現(xiàn)象的主要原因有兩個(gè)方面：不能有效的早期診斷和沒有行之有效的治療方案。究其根本，在于三陰性乳腺癌缺少早期診斷的標(biāo)志物和靶向治療藥物的靶點(diǎn)。本研究表明，YAP1在三陰性乳腺癌中高表達(dá)，成為潛在的診斷標(biāo)志物。同時(shí)。在三陰性乳腺癌細(xì)胞中敲低YAP1能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和皮下成瘤能力。這一發(fā)現(xiàn)首次將YAP1和三陰性乳腺癌聯(lián)系起來(lái)，而且在細(xì)胞水平上提供了YAP1促進(jìn)三陰性乳腺癌發(fā)生發(fā)展的證據(jù)。進(jìn)一步的研究可以嘗試用Hippo信號(hào)通路的靶向藥物，如維替泊芬，來(lái)干預(yù)三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和成瘤能力，為下一步的臨床研究奠定基礎(chǔ)。

圖3 YAP1影響三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移

圖4 YAP1影響三陰性乳腺癌細(xì)胞的成瘤能力

在MDA-MB-231細(xì)胞中敲低YAP1后，將細(xì)胞注射入裸鼠皮下，4周后取出瘤體拍照(左)。同時(shí)腫瘤的重量被記錄后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較對(duì)照組和YAP1敲低組之間腫瘤重量的差別。***表示P<0.001。

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Oncogenic protein YAP1 promotes triple-negative breast cancer cells proliferation,migration and tumorigenesis

HULi-mei.

(BaichengCentralHospital,Baicheng137000,China)

Objective To study the expression level of YAP1 in triple-negative breast cancer samples,and demonstrate the functional role of YAP1 in breast cancer cell.Methods IHC was performed for YAP1 staining in 30 pairs of triple-negative breast cancer specimens,and the staining intensity of YAP1 was scored;the effect of YAP1 on the proliferation,migration and tumorigenesis of triple-negative breast cancer cell line MDA-MB-231 was determined by shRNA knockdown system.Results compared with the normal breast tissue,triple-negative breast cancer samples have significantly higher level of YAP1 expression.Functionally,YAP1 could promote the proliferation,migration and tumorigenesis of triple-negative breast cancer cell line MDA-MB-231.Conclusion Our results indicate that YAP1 may serve as a biomarker for triple-negative breast cancer,and YAP1 could be a potential therapeutic target of triple-negative breast cancer via manipulating breast cancer cell proliferation,migration and tumor development.

YAP1;triple-negative breast cancer;cell proliferation;cell migration

1007-4287(2016)12-1995-04

Q291

A

2016-03-29)