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    DNA甲基化檢測(cè)在結(jié)直腸癌診斷中的應(yīng)用

    2017-01-06 08:07:40白盈盈朱光旭潘興華
    關(guān)鍵詞:甲基化昆明特異性

    白盈盈,朱光旭,潘興華

    (1.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院 細(xì)胞生物治療中心、細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室、云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明650032;2.昆明醫(yī)科大學(xué) 成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院臨床學(xué)院,云南 昆明650500)

    DNA甲基化檢測(cè)在結(jié)直腸癌診斷中的應(yīng)用

    白盈盈1,2,朱光旭1*,潘興華1*

    (1.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院 細(xì)胞生物治療中心、細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室、云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明650032;2.昆明醫(yī)科大學(xué) 成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院臨床學(xué)院,云南 昆明650500)

    結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是全球男性第3、女性第2常見的惡性腫瘤,死亡率占全球癌癥的第4位,每年約有69.4萬人死于此病[1]。在中國(guó),CRC的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì),現(xiàn)已高居男女腫瘤發(fā)病率的第5位和第4位[2]。對(duì)于早期CRC患者,多數(shù)可以治愈,5年生存率可達(dá)90%,而對(duì)于晚期患者則不足10%[3],然而多數(shù)CRC患者確診時(shí)已到中晚期,早期CRC缺乏典型臨床癥狀不易察覺,因此有效的早期診斷方法可以降低CRC的發(fā)病率和病死率以及提高患者生存率。目前,侵入性的結(jié)腸鏡檢查和糞便隱血試驗(yàn)(Fecal occult blood teats,F(xiàn)OBT)是CRC診斷的主要手段,但是FOBT缺乏特異性,難以滿足結(jié)直腸癌診斷的要求。結(jié)腸鏡檢查的特異性可達(dá)95%,但屬于侵入性檢查,并且有高風(fēng)險(xiǎn)的并發(fā)癥,難以在人群中進(jìn)行大規(guī)模的篩查[4],因此急需方便、準(zhǔn)確的生物標(biāo)志物應(yīng)用于CRC的診斷。研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤形成過程中,表觀遺傳學(xué)改變可能比經(jīng)典遺傳學(xué)改變更早發(fā)生[5]。DNA甲基化作為表觀遺傳修飾的重要方式,與CRC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,且在癌癥的早期階段就已發(fā)生,使其可能成為CRC早期診斷的新型生物標(biāo)記物。

    1 DNA甲基化

    DNA甲基化(DNA methylation)是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,Dnmt)催化作用下,將 S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)的甲基共價(jià)結(jié)合到胞嘧啶磷酸鳥嘌呤二核苷酸(CpG)的 5’-末端,生成 5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mc)的過程[6]。在哺乳動(dòng)物中,70%-80% 的 CpG 位點(diǎn)發(fā)生 DNA 甲基化,剩余的分布于基因的啟動(dòng)子區(qū)處于未甲基化狀態(tài)[7]。在腫瘤細(xì)胞基因組中,CpG島呈現(xiàn)異常DNA甲基化狀態(tài),通過直接或間接作用抑制基因轉(zhuǎn)錄,從而影響基因表達(dá)[8]。

    2 DNA甲基化檢測(cè)與結(jié)直腸癌診斷的相關(guān)性

    DNA甲基化與CRC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)?;蚣谆瘷z測(cè)在CRC診斷的應(yīng)用中,檢測(cè)標(biāo)本來源主要有局部組織、血漿以及糞便三類,大量文獻(xiàn)基于這三種標(biāo)本進(jìn)行了基因甲基化檢測(cè)用于CRC診斷的研究,結(jié)果表明基因甲基化檢測(cè)對(duì)于CRC的診斷具有不同程度的敏感性和特異性(表1),同時(shí)也提示單一依靠局部組織、血漿或糞便標(biāo)本進(jìn)行甲基化檢測(cè)難以比較準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)CRC診斷。

    3 CRC患者DNA甲基化檢測(cè)

    在CRC患者中,多種來源的標(biāo)本,如血液、糞便、組織等中均檢測(cè)到異常DNA甲基化,因此進(jìn)行DNA甲基化檢測(cè)在臨床上對(duì)結(jié)直腸癌診斷可能具有較好的潛在價(jià)值[9]。迄今文獻(xiàn)對(duì)于CRC診斷的DNA甲基化檢測(cè)主要包括了一下幾種方式:

    3.1 組織DNA甲基化的檢測(cè)

    活體組織檢查是腫瘤診斷的重要手段,腫瘤樣本組織相比于血液、糞便等樣本具有更早的發(fā)生率、更高的準(zhǔn)確性,對(duì)CRC病變組織進(jìn)行DNA甲基化檢測(cè)有助于其準(zhǔn)確的診斷。研究發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌組織、癌前病變中啟動(dòng)子區(qū)域基因甲基化陽性率高于遠(yuǎn)離結(jié)直腸癌的正常組織,表明活檢組織基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)可以為CRC患者提供準(zhǔn)確的早期病情判斷和預(yù)后評(píng)估依據(jù),具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值[10]。但是,腫瘤組織標(biāo)本相較于血液、糞便,其提取過程是侵入性的,且取材部位也能影響診斷準(zhǔn)確性,因此不適于大范圍的CRC早期篩查。

    3.2 血液DNA 甲基化的檢測(cè)

    腫瘤細(xì)胞可向外周血釋放 DNA,在患者血清和血漿內(nèi)可以檢測(cè)到異常的較高濃度的DNA甲基化[11],因此檢測(cè)腫瘤患者血液中游離的 DNA 甲基化水平可能為CRC診斷及預(yù)后等提供新的方法和思路。Epi proColon是以細(xì)胞質(zhì)分裂基因9(Septin9)基因?yàn)榛A(chǔ)開發(fā)的,也是最早商業(yè)化并進(jìn)入臨床試驗(yàn)甲基化檢測(cè)試劑盒,尤其是第二代血漿 SEPI9甲基化檢測(cè)試劑盒(Eoi proColon 2.0)[12]的臨床應(yīng)用為CRC的早期診斷提供了一重要的新手段。目前國(guó)內(nèi)已有 BioChain公司授權(quán)代理第二代 SEPT9 基因甲基化CRC 檢測(cè)試劑盒(Epi proColon 2.0),并實(shí)現(xiàn)了國(guó)產(chǎn)化,初步臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示檢出CRC的總體特異性高達(dá)87.4%,敏感性為74.8%[13]。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)更多的特定基因甲基化可能作為生物標(biāo)志物用于CRC早期篩選及診斷(表1)。但是血液標(biāo)本不具有器官特異性,全身各部位器官的惡性腫瘤均會(huì)引起血液中甲基化指標(biāo)異常,因此血液DNA甲基化檢測(cè)難以作為CRC完全特異性的診斷手段。

    表1 CRC患者不同類型標(biāo)本中相關(guān)甲基化基因檢測(cè)

    3.3 糞便DNA甲基化的檢測(cè)

    糞便中的生物標(biāo)志物檢測(cè)是一種很有前途的結(jié)直腸癌篩查方法。在早期的結(jié)直腸癌中,腫瘤細(xì)胞可能脫落進(jìn)入腸腔,并與糞便混合;并且腸道是堿性環(huán)境,有利于 DNA 的保存,使從糞便提取的 DNA性質(zhì)穩(wěn)定、敏感性高[25]。糞便樣本檢測(cè)作為一種檢測(cè)相對(duì)高效能和高特異性的非侵入性手段,其基因甲基化檢測(cè)可作為結(jié)直腸癌早期篩查工具應(yīng)用于臨床實(shí)踐。Vimentin在CRC發(fā)生中扮演重要角色,并且很容易在糞便中檢測(cè)出來,其在診斷CRC和進(jìn)展期腺瘤的敏感性分別可高達(dá)81%和83%[26],目前Vimentin基因已成為市場(chǎng)上首次應(yīng)用糞便 DNA 甲基化作為大腸癌診斷性檢測(cè)的靶基因。ColoSure是以糞便標(biāo)本提取DNA樣本,通過定量檢測(cè)糞便中 Vimentin 基因高甲基化而開發(fā)的第一個(gè)商業(yè)化CRC篩選試劑盒[27]。但是由于糞便中混雜了多種物質(zhì),對(duì)提取高質(zhì)量的糞便DNA存在一定的阻礙,因此可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果,影響CRC的早期診斷。

    3.4 DNA甲基化聯(lián)合檢測(cè)

    研究表明基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)優(yōu)于單個(gè)基因甲基化檢測(cè),可以彌補(bǔ)以單一基因的甲基化檢測(cè)可能存在敏感性和特異性不足的問題[28]。對(duì)CRC患者、進(jìn)展期腺瘤患者和結(jié)腸鏡陰性組vimentin 和SFRP2 甲基化狀態(tài)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),大腸癌組中 vimentin和SFRP2 甲基化陽性檢出率分別為55.0%和70.0%;進(jìn)展期腺瘤組中為48.0%和64.0%;正常對(duì)照組中為 6.7%和0。在病例組中兩基因聯(lián)合檢測(cè)的敏感性為83.1%,明顯高于 vimentin 的52.3%和 SFRP2 的67.7%,更要高于 FOBT的27.7%,而在正常對(duì)照組中兩基因聯(lián)合檢測(cè)的陽性率均無明顯差異[27],提示在CRC診斷中,聯(lián)合檢測(cè)糞便中 vimentin 和 SFRP2 基因甲基化狀態(tài)在敏感性、特異性方面均優(yōu)于單個(gè)基因甲基化檢測(cè),表明基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)較單基因甲基化檢測(cè)更能提供較準(zhǔn)確的診斷。

    4 總結(jié)與展望

    隨著對(duì)腫瘤表觀遺傳學(xué)研究的深入,不斷發(fā)現(xiàn)可以用作腫瘤診斷的新型生物標(biāo)志物。DNA甲基化作為新的生物標(biāo)志在臨床上的微創(chuàng)診斷、預(yù)后評(píng)估、預(yù)測(cè)治療反應(yīng)、監(jiān)測(cè)病情等方面不斷展示其可能的潛在應(yīng)用價(jià)值,為CRC篩查和早期診斷提供了不同于傳統(tǒng)方法的全新手段,極具開發(fā)和臨床應(yīng)用潛力。目前已經(jīng)有為數(shù)不多的幾個(gè)以DNA甲基化檢測(cè)為基礎(chǔ)的商業(yè)化試劑盒投入了CRC臨床診斷應(yīng)用,這僅僅是該方法用于臨床診斷的開端,仍然存在一些問題需要進(jìn)一步解決,比如與CRC有關(guān)的標(biāo)志甲基化基因的篩選,在方法上如樣品儲(chǔ)存、糞便DNA或循環(huán)DNA提取、甲基化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化,以及單個(gè)基因甲基化檢測(cè)與多個(gè)基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)在敏感性和特異性方面的比對(duì)等,尚需進(jìn)行大量細(xì)致的工作加以論證和闡明。

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    國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81170316)

    1007-4287(2016)12-2139-04

    白盈盈,女,26歲,在讀碩士研究生,主要從事臨床實(shí)驗(yàn)診斷研究;朱光旭,男,副主任技師,主要從事心血管疾病發(fā)病機(jī)制及診斷研究;潘興華,男,主任醫(yī)師,主要研究方向?yàn)楦杉?xì)胞與組織工程。

    2016-07-19)

    *通訊作者

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