雞源丁酸梭狀芽孢桿菌的分離篩選與鑒定及益生性的研究

肖海蒂，張莉力，史東輝，許云賀

（遼寧省錦州市錦州醫(yī)科大學，遼寧 錦州 121001）

雞源丁酸梭狀芽孢桿菌的分離篩選與鑒定及益生性的研究

肖海蒂，張莉力，史東輝，許云賀*

（遼寧省錦州市錦州醫(yī)科大學，遼寧 錦州 121001）

為了降低抗生素的使用頻率，提高微生態(tài)制劑的利用率。本試驗從健康散養(yǎng)大骨雞的盲腸內(nèi)容物中分離與純化細菌，獲得多株芽孢桿菌，經(jīng)菌落觀察、鏡檢、生化試驗初步確定三株芽孢桿菌，并對其益生性進行研究發(fā)現(xiàn)D-19益生性能較好，進行16S rDNA序列分析，鑒定D-19株為丁酸梭狀芽孢桿菌。研究結(jié)果為進一步研究動物腸道內(nèi)微生物及應用該菌奠定了基礎。

丁酸梭狀芽孢桿菌；散養(yǎng)大骨雞；腸道微生物；鑒定

丁酸梭狀芽胞桿菌（Clostridium butyricum）又名酪酸梭菌、丁酸梭菌，屬于芽孢桿菌科，梭菌屬，革蘭氏陽性，有芽孢，孢子卵圓，偏心或次端生，可抵抗不良環(huán)境。丁酸梭菌是普遍存在于人和動物腸盲腸和結(jié)腸內(nèi)的一種益生菌，是腸黏膜細胞的主要能量來源，也是腸道健康水平的標志。通過改善胃腸道微生物區(qū)系，可穩(wěn)定胃腸道環(huán)境與腸道pH，為厭氧有益菌群的生長提供有利環(huán)境，也能抑制腸道內(nèi)葡萄球菌、大腸桿菌等有害菌的生長繁殖，從而調(diào)節(jié)菌群平衡，具有調(diào)節(jié)消化道菌群和促進畜禽生長的雙重作用[1]。2000年陸儉等[2]發(fā)現(xiàn)了丁酸梭菌對霍亂弧菌具有拮抗作用。

1944年，日本將丁酸梭菌活菌制劑以整腸劑藥品正式投入臨床應用。目前，丁酸菌在畜牧業(yè)中一般作為微生態(tài)制劑添加到飼料中。2002年趙建新等[3]從健康人的糞便中分離了4株丁酸梭菌，對這4株菌進行安全性評價，其中丁酸梭狀芽孢桿菌Z-10被證明可以安全的用于制造微生態(tài)制劑。2012年劉亭婷等[4]將丁酸梭菌添加到飼糧中對蛋用仔公雞腸道菌群的影響進行研究分析，結(jié)果表明，丁酸梭菌能夠增加乳桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量，降低大腸桿菌的數(shù)量，從而調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡，改善腸道微環(huán)境。2013年梁明振等[1]研究表明，在飼糧中添加適量的丁酸梭狀芽孢桿菌，不僅可以降低腸道pH和大腸桿菌的含量，還能提高腸道內(nèi)丁酸梭狀芽孢桿菌和乳酸桿菌的含量。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1 樣品來源 在20只85日齡散養(yǎng)大骨雞中挑選平均體重相近的6只進行解剖，解剖后取盲腸內(nèi)容物裝入EP管中液氮保存然后迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中。

1.1.2 試驗用培養(yǎng)基 RCM梭菌增殖培養(yǎng)基和TSN梭菌選擇性培養(yǎng)基參照杜云平等[5]試驗用培養(yǎng)基。

1.1.3 試驗儀器與設備 超凈工作臺、厭氧培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、搖床、顯微鏡、PCR儀、凝膠成像儀等。

1.2試驗方法

1.2.1 菌株的分離 菌株的富集培養(yǎng)：取-80℃保存的樣品10 g加入90 mL無菌生理鹽水中，搖床震蕩20 min后80℃水浴10 min，殺死非芽孢菌，在超凈工作臺中吸取10 mL加入100 mL RCM液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h再取菌液10 mL加入RCM液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后80℃水浴10 min，取富集后的菌液10 mL加入100 mL TSN選擇性液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)24 h。

菌株的分離：取10 mL菌液加入90 mL無菌生理鹽水中，進行梯度稀釋至10-6，每個稀釋度取100 μL涂布于TSN瓊脂平板上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)。

1.2.2 生理生化試驗 由于丁酸梭菌隸屬梭菌屬，根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰細菌鑒定手冊第8版》中鑒定梭菌屬的試驗方法對菌株鑒定到屬。

1.2.3 菌株益生性的研究

1.2.3.1 耐酸性 ①取斜面保藏的菌落活化24 h后按5%的接種量種于已經(jīng)配制好的10 mL pH為2、3、4的人工胃液中。②剛接入后搖勻即取樣，0 h計數(shù)作為對照組，然后在培養(yǎng)3 h后取樣，做3個平行，用PBS緩沖液稀釋平板計數(shù)，計算存活率（試驗組菌落數(shù)/對照組菌落數(shù)×100%）。

1.2.3.2 耐膽鹽性 ①取斜面保藏的菌落活化24 h后按5%的接種量種于已經(jīng)配制好的濃度為0.1%、0.2%、0.3%的人工腸液中。②剛接入后搖勻即取樣，0 h作為對照組，培養(yǎng)4 h后取樣用生理鹽水稀釋涂平板計數(shù)，計算存活率（試驗組菌落數(shù)/對照組菌落數(shù)×100%）。

1.2.3.3 細菌表面疏水性的測定（MATH法） 細菌培養(yǎng)物經(jīng)12 000 r/min，5 min離心，然后用無菌的50 mmol/L的K2HPO4（pH 6.5）洗脫2次，每次10 mL。調(diào)整重懸液在A600處的吸光值接近0.6，此時從其中吸取3 mL與0.6 mL二甲苯混合30 s，停頓10 s后震蕩30 s，室溫下靜置5～10 min分層，取下層水相，以緩沖液為空白對照，在波長600 nm處測量吸光值并記錄。試驗進行3次重復。

表面疏水率（H%）計算公式：H%=（A0-A）/A0式中A0和A分別是與二甲苯混勻前后菌液在600 nm處的吸光值。

1.2.3.4 抑菌性 丁酸梭菌的活化：取斜面保存的丁酸梭挑取一環(huán)放入RCM液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。

金黃色葡萄球菌的活化：實驗室保藏菌種，挑取一環(huán)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。

大腸桿菌的活化：實驗室保藏菌種，挑取一環(huán)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。

分別取100 μL大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌液涂布于平板上，靜置10 min，讓菌液充分吸附在固體培養(yǎng)基上，然后在培養(yǎng)基上間隔均勻的放置3個牛津杯，里面注入丁酸梭菌菌液100 μL，蓋上培養(yǎng)皿上蓋，37℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.2.4 16s rDNA的分子鑒定 變性：挑取菌體于50 μL TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR中變性后離心取上清液作為模板。

反應條件：80℃，15 min。

PCR擴增：使用TaKaRa 16s rDNA Bacterial identification PCR Kit，進行PCR擴增目的片段。

反應條件： 94℃，5 min，1個循環(huán)；94℃，1 min，55℃，1 min，30個循環(huán)；72℃，1.5 min，72℃，5 min，1個循環(huán)。

PCR產(chǎn)物的回收純化并測序由寶生物工程（大連）有限公司完成。

1.2.5 菌落形態(tài)觀察 將鑒定為丁酸梭裝芽孢桿菌的菌株進行擴大培養(yǎng)，觀察其在TSN瓊脂平板上的菌落形態(tài)。

1.2.6 顯微鏡下形態(tài)觀察 挑取TSN平板上的菌落涂到載玻片上，加適量蒸餾水混合，待晾干后進行革蘭氏染色，觀察顯微鏡下的菌落形態(tài)。

1.2.7 統(tǒng)計處理 應用SPSS 17.0軟件單因素方差分析進行統(tǒng)計分析，結(jié)果均以均值±標準差形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1分離出的菌株的菌落形態(tài)結(jié)果見表1。

表1 分離菌株的菌落形態(tài)Table1 Strain morphology of isolated strains

2.2生理生化鑒定結(jié)果結(jié)果見表2。

表2 菌株的生理生化鑒定結(jié)果Table2 Physiological and biochemical identification results of strains

2.3菌株益生性研究試驗結(jié)果

2.3.1 菌株在人工胃液中的存活率 結(jié)果見表3。

表3 耐酸性存活率Table3 Survival rate of acid resistant

由表3結(jié)果可以看出，D-19在pH為4培養(yǎng)3 h后存活率顯著高于其他兩株菌株（P＜0.05）；當pH為2和3時，D-2和D-19顯著高于D-8（P＜0.05）。

2.3.2 菌株在人工腸液中的存活率 結(jié)果見表4。

由表4結(jié)果可知，D-19在膽鹽濃度為0.2%和0.3%時都顯著高于其他兩株（P＜0.05），在濃度為0.1%時三組之間沒有顯著差異（P＞0.05）。

表4 耐膽鹽存活率Table4 Survival rate of bile salt resistant

2.3.3 菌株的疏水率的測定 結(jié)果見表5。

表5 疏水率Table5 Hydrophobic rate

由表5可知，菌株D-19的疏水率顯著高于其他兩株（P＜0.05），而D-2和D-8之間沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.3.4 菌株對病原菌的抑菌性 結(jié)果見表6。

表6 抑菌圈直徑Table6 Antibacterial property

由表6可知，三株菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果差異不顯著（P＞0.05）。

綜合以上益生性相關試驗結(jié)果來看，菌株D-19的試驗結(jié)果在耐酸性方面顯著高于其他兩株菌，膽鹽濃度為0.2%和0.3%時顯著高于其他兩株，疏水率也顯著高于其他兩株，所以選取D-19進行16s rDNA分子鑒定。

2.416 s rDNA分子鑒定結(jié)果1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果，進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果見圖1。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 The picture of agarose gel electrophoresis

2.5菌落形態(tài)經(jīng)過16s rDNA分子測序后與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，篩選出的菌株與Clostridium butyricum同源性達到99%，確定其為丁酸梭狀芽孢桿菌，將篩選出的丁酸梭狀芽孢桿菌進行擴大培養(yǎng)，菌落形態(tài)：邊緣不整齊，表面稍突，乳白色，菌落較大，直徑5 mm左右。見圖2。

2.6染色及鏡檢革蘭氏染色呈藍紫色，梭狀，菌體中間膨大，孢子卵圓。見圖3。

圖2 丁酸梭菌在TSN平板上的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of Clostridium botulinum on TSN plate

圖3 丁酸梭狀芽孢桿菌染色鏡下圖（×1000）Fig.3 Clostridium butyrate staining microscope(×1000)

3 討論

自抗生素發(fā)現(xiàn)以來，給人類的生活、生產(chǎn)帶來了巨大的改變，但隨著抗生素作為飼料添加劑的廣泛應用，人們也逐漸發(fā)現(xiàn)了它的弊端，如導致動物胃腸道正常菌群失調(diào)，產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留等副作用[6]。而動物微生態(tài)制劑具有維持動物腸道健康、改善畜舍環(huán)境、緩解不良應激、調(diào)節(jié)機體脂肪代謝和改善畜產(chǎn)品品質(zhì)的功能，它能替代抗生素添加到飼料中從而很好地解決濫用抗生素而產(chǎn)生的問題[7]。

本研究分離出的菌株是從85日齡健康散養(yǎng)大骨雞的盲腸內(nèi)最終篩選出三株丁酸梭狀芽孢桿菌，并對三株菌進行益生性能的研究，經(jīng)過試驗得出D-19株菌株的益生性能最好，其菌落形態(tài)為乳白色的表面光滑而邊緣不規(guī)則的菌株。由于來源于健康雞腸道所以能很好的定植于腸道內(nèi)，抗逆性強，能耐酸堿和高溫高壓，在飼料加工和儲存過程中不易失活[8]，這是其能作為微生態(tài)制劑的一大優(yōu)點。

下一步對其安全性等進行研究，使其能安全有效地代替抗生素作為微生態(tài)制劑添加到飼料中應用于生產(chǎn)，充分發(fā)揮其功能。

[1]梁明振，李莉，劉浩.丁酸梭狀芽孢桿菌對斷奶仔豬腸道微生物區(qū)系的影響[J].中國畜牧雜志，2013，49（23）：64-67.

[2]陸儉，張雪平，孟筱琦．酪酸菌和嬰兒型雙歧桿菌對霍亂弧菌的拮抗試驗[J]．微生物學通報，2000，27（5）：338-341.

[3]趙建新，張灝，田豐偉.丁酸菌的分離、鑒定及篩選[J].無錫輕工大學學報，2002，21（6）：597-601.

[4]劉亭婷，滑靜，王曉霞，等.丁酸梭菌對蛋用仔公雞腸道菌群、形態(tài)結(jié)構(gòu)及黏膜免疫相關細胞的影響[J].動物營養(yǎng)學報，2012，24（11）：2210-2221.

[5]杜云平，周慶豐，余國蓮，等.豬糞中丁酸梭菌的分離[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學，2009，16（3）：21-23.

[6]石現(xiàn)瑞，高峰.抗生素添加劑的負面效應及其代替品的研究[J].飼料博覽，2000，（3）：24-26.

[7]徐鵬，董曉芳，佟建明.微生物飼料添加劑的主要功能及其研究進展[J].動物營養(yǎng)學報，2012，24（8）：1397-1403.

[8]郝永任.新型動物微生態(tài)制劑一復合酪酸菌制劑的研制[D].濟南：山東師范大學，2002.

The isolation,screening and identification of Clostridium butyricum from chicken and the research of probiotics

Xiao Haidi,Zhang Lili,Shi Donghui,Xu Yunhe*
(Jinzhou Medical University,Liaoning Jinzhou 121001)

In order to reduce the frequency of use of antibiotics,improve the utilization rate of micro ecological agents.From the bulk health raise big bone chicken cecal contents in separation and purification of bacterial and obtain many strains of Bacillus,the colonies were observed,microscopy,biochemical test initially identified three strains of Bacillus,the probiotic research found D-19 probiotic properties better,16S rDNA sequence analysis and identification of D-19 strains of Clostridium butyricum.In order to lay a foundation for further research on the intestinal microflora and the application of the bacteria.

Clostridium butyricum;Cage-free big bone chicken;Gut microbes;Identification

S831.5 < class="emphasis_bold"> 文獻標識碼：B

B

1672-9692(2016)06-0001-06

2016-04-12

肖海蒂（1990-），女，碩士研究生，主要研究方向為腸道微生物。

許云賀（1978-），男，博士，副教授，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料研究。

遼寧省自然科學基金項目（2014022046）。