藤黃酸白蛋白納米粒的制備及穩(wěn)定性研究

楊志杰，侯音璇，林 霞，滕 歡，唐 星，徐 暉

（沈陽(yáng)藥科大學(xué)，藥學(xué)院，遼寧，沈陽(yáng)110016）

藤黃酸白蛋白納米粒的制備及穩(wěn)定性研究

楊志杰，侯音璇，林 霞，滕 歡，唐 星，徐 暉*

（沈陽(yáng)藥科大學(xué)，藥學(xué)院，遼寧，沈陽(yáng)110016）

目的以人血清白蛋白為載體制備藤黃酸白蛋白納米粒，對(duì)處方和工藝進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行穩(wěn)定性考察。方法采用新型白蛋白納米制備技術(shù)（NabTM）制備藤黃酸白蛋白納米粒（GA-HSA NPs），用透射電鏡觀察納米粒的形態(tài)，用Nicomp TM PSS 380進(jìn)行粒度儀測(cè)定其粒度分布及電位，超速離心法測(cè)定其包封率、載藥率及過(guò)膜效率，并考察其稀釋穩(wěn)定性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性。結(jié)果GA-HSA NPs 電鏡下呈球狀粒子，粒徑為(103.2 ± 34.4) nm， zeta 電位為-25.10 mV，GA-HSA NPs具有較高的包封率、載藥率和過(guò)膜效率。GA-HSA NPs凍干粉針儲(chǔ)存12個(gè)月期間無(wú)塌陷或皺縮，GA-HSA NPs混懸液在儲(chǔ)存6周內(nèi)粒徑無(wú)顯著性變化。結(jié)論難溶性抗癌藥物藤黃酸可以采用NabTM制備成白蛋白納米粒, 其粒徑小, 穩(wěn)定性高，有望成為藤黃酸的新型給藥系統(tǒng)。

藥劑學(xué)；納米粒；新型白蛋白納米制備技術(shù)；藤黃酸；穩(wěn)定性；人血清白蛋白

藤黃酸（gambogic acid，GA）為藤黃科植物藤黃樹(shù)（Garcinia hanbaryi Hook. f.）分泌的干燥樹(shù)脂中提取純化獲得的有效成分[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，藤黃酸可顯著抑制人肝癌及胃腺癌細(xì)胞的增殖，用于腫瘤治療，具有活性成分性質(zhì)穩(wěn)定、療效顯著且不良反應(yīng)少的特點(diǎn)，有望開(kāi)發(fā)為一種高效低毒的抗腫瘤藥物[2]。但是，藤黃酸在水中溶解度極小（小于0.5 mg·L-1），體內(nèi)半衰期較短（狗體內(nèi)小于1 h，兔子體內(nèi)小于20 min），并且體內(nèi)分布廣泛，臨床應(yīng)用存在諸多困難[3]。DING Y等以聚氧乙烯蓖麻油和精氨酸用于嘗試解決這些問(wèn)題，但是這些溶劑可能會(huì)產(chǎn)生一系列的不良反應(yīng)，如過(guò)敏反應(yīng)、腎毒性、神經(jīng)毒性和心臟毒性等[4]。因此，有必要開(kāi)發(fā)一種新的劑型，以提高藤黃酸在水中的溶解度，減少溶劑帶來(lái)的毒性及不良反應(yīng)并提高其穩(wěn)定性。

新型白蛋白納米制備技術(shù)(nanoparticle-albumin bound technology，NabTM)是基于白蛋白帶有巰基或二硫鍵基團(tuán)，由高剪切力的氣穴空化作用，生成使聚合物交聯(lián)的超氧化物離子，氧化白蛋白中巰基殘基或斷裂白蛋白分子內(nèi)/間現(xiàn)存的二硫鍵，使白蛋白內(nèi)/間交聯(lián)形成新的二硫鍵，從而在非水性介質(zhì)微小液滴(如水不溶性藥物)的周?chē)纬梢粋€(gè)交聯(lián)的聚合物殼體。紫杉醇-白蛋白納米混懸劑(nab-paclitaxel，Abraxane)已經(jīng)獲FDA批準(zhǔn)上市，成為首個(gè)白蛋白納米粒給藥系統(tǒng)的成功案例。白蛋白可通過(guò)非共價(jià)鍵與物質(zhì)緊密但可逆地結(jié)合，實(shí)現(xiàn)所運(yùn)載物質(zhì)在體內(nèi)的運(yùn)輸和在細(xì)胞表面的釋放，是疏水物質(zhì)的體內(nèi)天然載體。又由于白蛋白具有安全無(wú)毒、無(wú)免疫原性、可生物降解及生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的靶向給藥系統(tǒng)載體材料。因此，作者采用人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)作為載體，利用溶劑蒸發(fā)技術(shù)，在沒(méi)有任何聚合物核心材料和常規(guī)表面活性劑存在下成功制備藤黃酸白蛋白納米混懸劑(GA-HSA NPs)，并對(duì)其理化性質(zhì)和穩(wěn)定性進(jìn)行考察。

1 儀器與材料

HITACHI 高效液相色譜儀(L-7420紫外檢測(cè)器、L-7110泵、L-7200自動(dòng)進(jìn)樣器)、HITACHI 紫外分光光度計(jì)、CS120GXL超高速離心機(jī)（日本日立公司），KQ-50B超聲清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司），高速分散勻質(zhì)機(jī)（ULTRA TURRAX?T18 basic，IKA?WORKS，德國(guó)），PB-10酸度計(jì)（塞的利斯科學(xué)儀器有限公司），超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（美國(guó)SONICS公司），N1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器器械獨(dú)資工廠），Nicomp TM PSS380 動(dòng)態(tài)光散射粒度測(cè)定儀（Santa Barbara，USA PSS）。

藤黃酸原料藥（江蘇康緣藥業(yè)有限公司），人血清白蛋白（蘭州生物制品研究所有限公司），氯仿、二氯甲烷（分析純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司），乙腈（色譜級(jí)，天津康科德科技有限公司），其他藥品和試劑（藥用規(guī)格和分析純，市售）。

2 方法

2.1 GA-HSA NPs的制備（小試）

采用NabTM制備GA-HSA NPs。精密稱取處方量的藤黃酸溶于有機(jī)相中（二氯甲烷與丙酮體積比4∶1），得含藥油相。將人血清白蛋白加入注射用水中，攪拌使其分散均勻，用pH值為2的檸檬酸水溶液調(diào)節(jié)pH值為5.6～6.4，攪拌均勻得水相。將含藥油相迅速加入水相中，然后轉(zhuǎn)移至超聲波細(xì)胞破碎機(jī)中，以300 W的功率超聲乳化6 min (超聲2 s，停1 s)，即得O/W乳劑。將O/W乳劑在40 ℃條件下減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，凍干，即得注射用藤黃酸白蛋白納米粒凍干品。

2.2 GA-HSA NPs的制備（放大至100 mL）

采用NabTM制備GA-HSA NPs。精密稱取藤黃酸150 mg溶于有機(jī)相中（二氯甲烷與丙酮體積比4∶1），得含藥有機(jī)相。將人血清白蛋白加至注射用水中，攪拌使其分散均勻，用pH值為2的檸檬酸水溶液調(diào)節(jié)pH值為5.6～6.4，攪拌均勻得水相。在高速分散機(jī)攪拌下，將含藥油相緩慢加至水相中，待完全加入后以1×104r·min-1剪切3 min，即得初乳。將初乳轉(zhuǎn)移至高壓均質(zhì)機(jī)中，以300 bar均質(zhì) 3 次，500 bar均質(zhì)3次，880 bar均質(zhì)8次，即得O/W乳劑。將O/W乳劑在40 ℃條件下減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，凍干，即得注射用藤黃酸白蛋白納米粒凍干品。

2.3 粒徑及電位測(cè)定

使用NicompTM PSS 380進(jìn)行粒度及電位測(cè)定。

2.4 樣品含量測(cè)定

精密稱取注射用藤黃酸白蛋白納米粒凍干品適量，用10 mL蒸餾水復(fù)溶，即得GA-HSA NPs 含藥溶液。精密量取上述含藥溶液0.5 mL，置于 50 mL 量瓶中，用適量乙腈沉淀蛋白，水浴超聲提取5 min，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。精密量取20 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖，記錄藤黃酸的峰面積。按外標(biāo)法計(jì)算藥物含量。

2.5 包封率、載藥率及過(guò)膜效率的測(cè)定

本試驗(yàn)采用超速離心法對(duì)藥物的包封率進(jìn)行了測(cè)定。具體操作步驟如下。

2.5.1 藥物總量的測(cè)定

精密稱取注射用藤黃酸白蛋白納米粒凍干品適量，用10 mL蒸餾水復(fù)溶，即得GA-HSA NPs 含藥溶液。精密量取上述含藥溶液0.5 mL，置于 50 mL 量瓶中，用適量乙腈沉淀蛋白，水浴超聲提取5 min，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。用HPLC法測(cè)定制劑中藤黃酸的總濃度。

2.5.2 水相中藥物含量的測(cè)定

取注射用藤黃酸白蛋白納米粒溶液約 2.0 mL，置于超速離心管中，置離心機(jī)內(nèi)以 4×104r·min-1轉(zhuǎn)速離心約2 h，取離心管中的上清液體，用HPLC法測(cè)定水相中藤黃酸的濃度。

包封率計(jì)算公式如下：wEE= (mtotal– mfree) / mtotal×100%；載藥率計(jì)算公式如下：wLC= min/mW×100%；過(guò)膜效率計(jì)算公式如下：wFE= mout/min×100%。

其中：mtotal為制劑中藤黃酸的總質(zhì)量，mfree為水相中游離藤黃酸的總質(zhì)量，載藥率計(jì)算公式中的min為包裹在制劑中藤黃酸的總質(zhì)量，mw為藤黃酸白蛋白納米粒的總質(zhì)量，mout為通過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后藤黃酸的總質(zhì)量，過(guò)膜效率計(jì)算公式中的min為未通過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾前藤黃酸的總質(zhì)量。

3 結(jié)果與討論

3.1 形態(tài)、粒徑與電位的測(cè)定結(jié)果

藤黃酸白蛋白納米粒的外觀均為黃色均勻混懸液。裸眼觀察無(wú)不溶性成分析出，顯微鏡下觀察無(wú)藤黃酸不溶物析出。凍干產(chǎn)品為外觀平整、色澤均勻、細(xì)膩疏松的塊狀物。使用 G220透射電鏡進(jìn)行納米粒的形態(tài)觀察（圖1）。由圖1可見(jiàn)，納米粒粒徑大小為100 nm左右，形態(tài)呈為圓整的球狀，分布均勻，無(wú)粘連現(xiàn)象。使用Nicomp TM PSS 380進(jìn)行粒度及電位測(cè)定（圖2）。由圖2可知，藤黃酸白蛋白納米粒的粒徑為(103.2 ± 34.4) nm，電位為-25.10 mV。

Fig. 1 Transmission electron microgram (TEM) image of GA-HSA NPs（× 35 000）圖1 GA-HSA NPs 透射電鏡照片（× 35 000）

Fig. 2 The particle size distribution (A) and the zeta potential (B) of GA-HSA NPs圖 2 GA-HSA NPs的粒徑分布（A）及zeta電位（B）

3.2 包封率、載藥率及過(guò)膜效率

結(jié)果顯示，藤黃酸白蛋白納米粒的包封率、載藥率和過(guò)膜效率分別為98.9%、10.9%和90.3%。

3.3 GA-HSA NPs的處方優(yōu)化

3.3.1 有機(jī)相的影響

在應(yīng)用NabTM制備白蛋白納米粒時(shí)，不同種類的有機(jī)相對(duì)白蛋白納米粒的形成以及穩(wěn)定有重要影響。Rampon等研究發(fā)現(xiàn)，蛋白在界面上吸附后，蛋白的構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，暴露出更多疏水集團(tuán)，這些行為除了與蛋白質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)外，還與非極性相的性質(zhì)有關(guān)[5]，因此，有機(jī)相的選擇對(duì)于白蛋白納米粒的制備至關(guān)重要。

本實(shí)驗(yàn)確定有機(jī)相與水相的體積比為1∶8，以細(xì)胞超聲破碎儀為制備儀器，采用單因素考察法，設(shè)計(jì)有機(jī)相分別為二氯甲烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷-丙酮體積比2∶1和二氯甲烷-四氫呋喃體積比2∶1，考察不同種類的有機(jī)相組成及比例對(duì)藤黃酸白蛋白納米的理化性質(zhì)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

Fig. 3 Effect of the organic phase on the nanoparticle size and filtration efficiency圖 3 有機(jī)相種類對(duì)GA-HSA NPs的粒度分布和過(guò)膜效率的影響

由圖3 可知，混合有機(jī)相較單一有機(jī)相制備的納米粒粒徑分布更窄，且過(guò)膜效率更高。使用丙酮及四氫呋喃與二氯甲烷作為混合溶劑時(shí)，白蛋白納米粒分布較窄、過(guò)膜效率高且有較好的穩(wěn)定性。這可能與丙酮及四氫呋喃是與水互溶的溶劑有關(guān)，在制備過(guò)程中，丙酮和四氫呋喃能夠適宜的破壞白蛋白水化膜，使白蛋白暴露更多的疏水基團(tuán)以有利于藥物包裹進(jìn)去。綜合考慮制劑穩(wěn)定性及有機(jī)溶劑毒性的因素，最終確定有機(jī)相為二氯甲烷-丙酮體積比為2∶1。

3.3.2 相比的影響

在應(yīng)用NabTM制備白蛋白納米粒的過(guò)程中，相比的影響較為復(fù)雜。當(dāng)有機(jī)相比下降時(shí)，有機(jī)相中的藥物濃度增大，白蛋白不足以穩(wěn)定所有新生界面，導(dǎo)致乳滴合并從而使粒徑變大；當(dāng)相比增大時(shí)，在除去有機(jī)溶劑過(guò)程中會(huì)有藥物析出及乳滴合并。因此，選擇合適的相比對(duì)于納米粒的粒徑有很大的影響。

本實(shí)驗(yàn)確定有機(jī)相為二氯甲烷-丙酮體積比 2∶1，人血清白蛋白的質(zhì)量濃度為20 g·L-1。采用單因素考察法，設(shè)計(jì)有機(jī)相與水相的體積相比依次為1∶8、1∶10和1∶12，考察不同相比對(duì)于藤黃酸白蛋白納米粒的理化性質(zhì)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

Fig. 4 Effect of the ratio of organic phase to water phase on the nanoparticle size and filtration efficiency (%)圖4 相比對(duì)GA-HSA NPs的粒度分布及過(guò)膜效率的影響

由圖4可知，當(dāng)有機(jī)相與水相的體積相比為1∶8和1∶12時(shí)，納米粒的粒徑均大于150 nm，過(guò)膜效率均低于70%；當(dāng)相比為1∶10時(shí)，納米粒的粒徑最小，過(guò)膜效率最高。

3.3.3 藥物質(zhì)量濃度的影響

考察不同藥物質(zhì)量濃度對(duì)藤黃酸白蛋白納米粒粒度分布及過(guò)膜效率的影響。設(shè)計(jì)藤黃酸在有機(jī)相中的質(zhì)量濃度分別為16、20、24、28和32 g·L-1，以確定最終藤黃酸白蛋白納米粒的藥物質(zhì)量濃度范圍，結(jié)果見(jiàn)表1。

Table 1 The influence of drug concentration on particle size distribution and filtration efficiency表1 不同藥物質(zhì)量濃度對(duì)GA-HSA NPs的粒度分布及過(guò)膜效率的影響

由表1中數(shù)據(jù)可知，藥物質(zhì)量濃度在16～28 g·L-1內(nèi)，制備的白蛋白納米粒粒度分布無(wú)明顯變化，但是過(guò)膜效率呈下降趨勢(shì)。當(dāng)藥物質(zhì)量濃度達(dá)到32 g·L-1時(shí)，納米粒子粒徑顯著增大、粒度分布變寬且過(guò)膜效率顯著降低，說(shuō)明有機(jī)相中藥物質(zhì)量濃度對(duì)納米粒的粒度分布和過(guò)膜效率有顯著影響。所以最佳藥物質(zhì)量濃度范圍為24 ～ 28 g·L-1。

3.3.4 pH的影響

采用單因素考察法，設(shè)計(jì)不同白蛋白水溶液的pH值（pH值4.8 ～ 8.0），以確定最終藤黃酸白蛋白納米粒的pH值范圍，結(jié)果見(jiàn)圖5。

Fig. 5 Influence of the pH of the HSA solution on the particle size and zeta potential圖5 pH值對(duì)GA-HSA NPs的粒度分布及電位的影響

由圖5可知，制備藤黃酸白蛋白納米粒的最適pH值范圍為5.6～6.4。在這個(gè)范圍內(nèi)所制備的藤黃酸白蛋白納米粒粒徑小、且電位穩(wěn)定。當(dāng)pH值小于5.6或者大于6.4時(shí)，藥物的過(guò)膜效率較低，藥物不能完全被包裹在納米粒中。這可能與白蛋白的構(gòu)象變化及藥物白蛋白的相互作用有關(guān)，當(dāng)pH值在5.6～6.4時(shí)，白蛋白呈現(xiàn)“N”構(gòu)象，藥物與白蛋白的親和力較好，更有利于藥物的包裹。而且在此范圍內(nèi)，藤黃酸（pKa = 7.8）主要以分子狀態(tài)存在，推測(cè)藤黃酸與白蛋白的主要作用為疏水作用。

3.4 GA-HSA NPs的工藝優(yōu)化（小試）

3.4.1 超聲時(shí)間的影響

在應(yīng)用NabTM制備白蛋白納米粒的過(guò)程中，超聲的主要作用是產(chǎn)生超氧化物離子交聯(lián)蛋白以及為新生界面提供能量使粒徑減小。作者采用單因素考察法，設(shè)計(jì)超聲時(shí)間為1、3、6和9 min，考察不同超聲時(shí)間對(duì)藤黃酸白蛋白納米粒理化性質(zhì)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

Fig. 6 Effect of ultrasonic time on particle size distribution and filtration efficiency of GA-HSA NPs圖6 超聲時(shí)間對(duì)GA-HSA NPs的粒度分布及過(guò)膜效率的影響

由圖6可知，隨著超聲時(shí)間的增加，納米粒粒徑逐漸減小，過(guò)膜效率逐漸增加。但是當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)6 min時(shí)，納米粒粒徑呈現(xiàn)增大趨勢(shì)，過(guò)膜效率也隨之降低。這可能是當(dāng)超聲時(shí)間小于6 min時(shí)產(chǎn)生的能量不足氧化白蛋白中巰基殘基或斷裂白蛋白分子內(nèi)/間現(xiàn)存的二硫鍵， 從而不能使人血清白蛋白產(chǎn)生合適的構(gòu)象以包裹藥物。當(dāng)超聲時(shí)間大于6 min時(shí)，過(guò)量的能量輸入會(huì)破壞已經(jīng)產(chǎn)生的穩(wěn)定體系，使納米粒系統(tǒng)出現(xiàn)超負(fù)荷(overprocessing)現(xiàn)象，造成納米粒粒徑增大，過(guò)膜效率降低。

3.4.2 超聲功率的影響

采用單因素考察法，設(shè)計(jì)超聲功率為200、300、400和500 W，考察不同超聲功率對(duì)藤黃酸白蛋白納米粒理化性質(zhì)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

Fig. 7 Effect of ultrasonic power on particle size distribution and filtration efficiency of GA-HSA NPs圖7 超聲功率對(duì)GA-HSA NPs的粒度分布及過(guò)膜效率的影響

由圖7可知，當(dāng)超聲功率由200 W增加到300 W時(shí)，納米粒粒徑顯著降低，而當(dāng)超聲功率逐漸增加到500 W時(shí)，粒徑卻有上升趨勢(shì)。由此推測(cè)，當(dāng)超聲功率由200 W增加到300 W時(shí)，白蛋白的交聯(lián)程度、疏水性及所帶電荷所形成的交聯(lián)聚合物殼體，正適合包裹藤黃酸類型藥物。

3.4.3 減壓除有機(jī)溶劑溫度的影響

分別在25、30、40、50和60 ℃條件下減壓除去有機(jī)溶劑。考察減壓除去有機(jī)溶劑的溫度對(duì)藤黃酸白蛋白納米粒理化性質(zhì)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8。

Fig. 8 Effect of evaporation temperature of organic solvent on particle size distribution and filtration efficiency of GA-HSA NPs圖8 減壓除有機(jī)溶劑溫度對(duì)GA-HSA NPs的粒度分布及過(guò)膜效率的影響

由圖8可知，減壓除去有機(jī)溶劑的溫度為40 ℃時(shí)，納米粒的粒徑為100 nm左右，過(guò)膜效率大于90%。溫度高于或低于40 ℃時(shí)，納米粒的粒徑增大，過(guò)膜效率降低。

3.5 GA-HSA NPs的工藝優(yōu)化（放大至100 mL）

3.5.1 高速剪切機(jī)剪切速度和剪切時(shí)間影響

作者對(duì)采用高速剪切制備初乳的制備條件進(jìn)行了考察，對(duì)剪切速度和剪切時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。

以初乳的外觀和顯微鏡下乳滴的均勻度來(lái)評(píng)價(jià)高速剪切的條件。分別以 6 000、8 000、1×104和1.2×104r·min-1的剪切轉(zhuǎn)速，剪切 3 min 制備初乳，在顯微鏡下觀察乳滴的均勻度。結(jié)果表明：當(dāng)高速剪切的轉(zhuǎn)速為 1×104r·min-1時(shí)，可得粒度分布均勻的乳滴；當(dāng)剪切速度超過(guò)最佳條件后，由于剪切力的作用，使乳滴的碰撞幾率增加，剪切均勻的乳滴進(jìn)一步合并增大。

固定剪切轉(zhuǎn)速為 1×104r·min-1，考察剪切時(shí)間分別為 1、3和5 min 時(shí)，剪切時(shí)間對(duì)初乳的影響。結(jié)果，乳化時(shí)間為 1 min 時(shí)，乳滴粒度分布不均勻；乳化時(shí)間為 3 min 和 5 min 時(shí)，對(duì)初乳的外觀影響較小，均為黃色混懸液，在顯微鏡下觀察可知粒徑也無(wú)顯著差別。由于高速剪切功率有限，只能將初乳粒徑減小到一定程度，之后即使再延長(zhǎng)剪切時(shí)間，粒徑也不會(huì)減少，反而會(huì)產(chǎn)生一定熱量。因此最終確定高速剪切的條件為1×104r·min-1高速剪切 3 min。

3.5.2 高壓均質(zhì)過(guò)程的影響

高壓均質(zhì)過(guò)程對(duì)納米粒的粒徑和粒徑分布有很大影響，因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)高壓均質(zhì)操作參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)先以300 bar和500 bar低壓勻化經(jīng)剪切所制得的初乳，然后經(jīng)800 bar高壓過(guò)程來(lái)減小乳滴粒徑。著重考察高壓（800 bar）次數(shù)對(duì)粒徑及粒徑分布的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

Table 2 The influence of homogenization cycles on the characteristics of GA-HSA NPs (n=3)表2 高壓均質(zhì)次數(shù)對(duì)GA-HAS NPs的粒度分布的影響 ( n=3)

由表2可知，當(dāng)高壓均質(zhì)次數(shù)由3次升到8次的時(shí)候，平均粒徑不斷減小，分布不斷變窄；當(dāng)高壓均質(zhì)次數(shù)在8以上時(shí)，隨均質(zhì)次數(shù)的增加，平均粒徑雖然變化不大，但是粒度分布逐漸變寬。這可能是由于過(guò)多的均質(zhì)次數(shù)導(dǎo)致乳滴兩級(jí)分化，乳滴分布不均，在一定程度上增加了乳滴的相互碰撞，引起乳滴的合并。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，最終確定制備藤黃酸白蛋白納米粒的高壓（800 bar）均質(zhì)次數(shù)為8次。

3.6 凍干保護(hù)劑的篩選

將“2.1”條下制備的GA-HAS NPs混懸液分別加入100 g·L-1甘露醇、100 g·L-1乳糖和100 g·L-1蔗糖，搖勻后按照如下工藝進(jìn)行冷凍干燥（圖9）。以GA-HSA NPs凍干后的外觀、水化難易程度及復(fù)溶后的粒徑、過(guò)膜效率等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表3。

Fig. 9 The lyophilization curve of GA-HSA NPs圖9 GA-HAS NPs的凍干曲線

Table 3 Characteristics of lyophilized GA-HSA NPs using different lyoprotectants表3 不同凍干保護(hù)劑制備得到的GA-HSA NPs混懸劑的凍干粉針

由表3可知，不添加任何凍干保護(hù)劑制得的GA-HAS NPs凍干粉針與添加各種凍干保護(hù)劑的形態(tài)、外觀、水化難易程度差異不大，并且不添加凍干保護(hù)劑復(fù)溶前后粒徑變化不大。故本實(shí)驗(yàn)GA-HAS NPs的凍干制備過(guò)程中可不添加凍干保護(hù)劑。這是由于體系中的HSA既作為載體又可作為凍干保護(hù)劑，使得到的凍干產(chǎn)品不僅具有良好的外觀而且具有長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

3.7 穩(wěn)定性考察

3.7.1 稀釋穩(wěn)定性考察

納米粒在不同條件下的穩(wěn)定性是影響藥物制劑應(yīng)用的重要因素。當(dāng)藥物進(jìn)入體內(nèi)以后，血液成分可能會(huì)對(duì)載藥納米粒的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，因此需要進(jìn)行納米粒的血清穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。一般來(lái)說(shuō)血液體積是人體體質(zhì)量的7%左右，而當(dāng)靜脈給藥時(shí)局部血液體積是未知的，所以將制劑稀釋不同倍數(shù)以考察其稀釋穩(wěn)定性。

稀釋介質(zhì)：生理鹽水作為等滲溶液的稀釋介質(zhì)；用人血清白蛋白模仿體內(nèi)蛋白環(huán)境，用磷酸鹽緩沖液（pH值7.4 PBS）維持細(xì)胞滲透壓，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液酸堿平衡，故選用含50 g·L-1人血清白蛋白的PBS作為血清穩(wěn)定性的稀釋介質(zhì)。

將制備好的GA-HSA NPs凍干粉分別用等滲溶液（生理鹽水）和50 g·L-1人血清白蛋白的PBS復(fù)溶并稀釋，稀釋倍數(shù)依次為2、8、32和100倍。通過(guò)比較稀釋前后粒徑及粒度分布（P.I.）來(lái)考察不同稀釋倍數(shù)的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖10。

Fig. 10 The effect of different x-fold dilutions on GA-HSA NPs圖10 不同稀釋倍數(shù)對(duì)GA-HAS NPs的影響

由圖10A可知，GA-HSA NPs凍干粉用等滲溶液（生理鹽水）復(fù)溶并稀釋不同倍數(shù)后，粒徑及粒度分布（P.I.）無(wú)顯著性增加或減小，且稀釋過(guò)程中無(wú)沉淀產(chǎn)生。這說(shuō)明GA-HSA NPs經(jīng)等滲溶液（生理鹽水）稀釋不同倍數(shù)后，具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性。

由圖10B可知，GA-HSA NPs經(jīng)50 g·L-1人血清白蛋白稀釋后，在稀釋倍數(shù)由2倍增加到8倍時(shí)，納米粒的粒徑無(wú)顯著性變化，而粒度分布（P.I.）卻逐漸增加。這可能是由于內(nèi)源性蛋白質(zhì)吸附到納米粒上，使其粒徑分布（P.I.）增加，但是這種增加在可接受的范圍內(nèi)。這說(shuō)明GA-HSA NPs在模擬體內(nèi)蛋白環(huán)境下具有很好的穩(wěn)定性。

3.7.2 儲(chǔ)存穩(wěn)定性考察

為考察GA-HSA NPs長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性。根據(jù)國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議的要求，將GA-HSA NPs的凍干粉和混懸液分別放置在4 ℃及25 ℃、相對(duì)濕度為60%的條件下。通過(guò)測(cè)定儲(chǔ)存期間納米粒的粒徑及粒度分布的變化，考察其在以上兩種條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖11。

Fig. 11 The stability of GA-HSA NPs圖11 GA-HAS NPs儲(chǔ)存穩(wěn)定性考察

由圖11A及11B可知，在儲(chǔ)存12個(gè)月期間，GA-HSA NPs的凍干粉在4 ℃及25 ℃、相對(duì)濕度60%條件下，納米粒的粒徑及粒度分布無(wú)顯著性增大或者減小，且凍干粉外觀上色澤均勻、無(wú)皺縮或塌陷，儲(chǔ)存穩(wěn)定性良好。由此說(shuō)明，凍干儲(chǔ)存方式可以作為藤黃酸白蛋白納米粒的一種有效的、長(zhǎng)期儲(chǔ)存方法。

由圖11C及11D可知，GA-HSA NPs的混懸液在4 ℃及25 ℃、相對(duì)濕度60%條件下，納米粒的粒徑及粒度分布無(wú)顯著性增大或者減小，但是在儲(chǔ)存6周之后，納米粒的分布顯著變大，且兩種條件下外觀上觀察到有藥物析出。引起這種現(xiàn)象的原因可能是在長(zhǎng)期的儲(chǔ)存過(guò)程中，小粒子不斷聚集成大粒子造成大粒子的藥物濃度增大，這樣在大粒子與小粒子之間形成濃度梯度。當(dāng)大粒子吸附的藥物飽和時(shí)即會(huì)有藥物沉淀出來(lái)。所以在臨床使用時(shí)，GA-HSA NPs的混懸液存放日期應(yīng)在6周以內(nèi)，但在實(shí)際使用時(shí)一般是現(xiàn)配現(xiàn)用，所以GA-HSA NPs的混懸液在6周內(nèi)穩(wěn)定為臨床使用提供了有利保障。

4 結(jié)論

難溶性抗癌藥物藤黃酸可以采用NabTM制備成白蛋白納米粒, 其粒徑小，分布均勻，穩(wěn)定性好，為臨床使用提供了有利保障。且操作簡(jiǎn)單，可放大，有望成為藤黃酸的新型給藥系統(tǒng)。

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Studies on preparation and stability of human serum albumin nanoparticles containing gambogic acid

YANG Zhijie, HOU Yinxuan, LIN Xia, TENG Huan, TANG Xing, XU Hui*
（School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China）

ObjectiveTo develop human serum albumin (HSA) nanoparticles (NPs) as polymeric vehicles for intravenous injection of gambogic acid (GA), to optimize the formulation thereof and evaluate its stability.MethodsGA-HSA NPs were prepared by the nanoparticle albumin-bound technology (Nab?). The morphology of the NPs was observed by TEM. The distribution of particle size and zeta potential of the NPs were determined by NicompTM PSS 380. The encapsulation efficiency (EE), drug-loading capacity (GA-LC) and filtration efficiency of the NPs were examined by ultracentrifugation method. Andthe stability upon dilution and storage stability were also investigated.ResultsGA-HSA NPs showed spherical in shape with a particle size of (103.2 ± 34.4) nm and a zeta potential of -25.10 mV. And high entrapment efficiency was achieved. Freeze–dried GA-HSA NPs showed no collapse or shrinkage after 12 months, and GA-HSA NP suspension demonstrated significant changes within 6 weeks.ConclusionsThis formulation could significantly increase the concentration of GA in water. GA-HSA NPs prepared by this method exhibited a small particle size, high stability. Therefore, this delivery system is a promising polymeric carrier for the transport of GA.

pharmaceutics; nanoparticle albumin-bound technology (NabTM); nanoparticles; gambogic acid; stability；human serum albumin

R 94

A

（2016）04–0107–13

10.14146/j.cnki.cjp.2016.04.001

(本篇責(zé)任編輯：趙桂芝)

2015–04–29

楊志杰(1989–)，女(漢族)，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生,E-mailyangzhijie26@126.com; *

：徐暉(1972–), 男(漢族), 遼寧法庫(kù)人, 副教授, 主要從事藥劑學(xué)研究,Tel.024–23986356，E-mailxuhui-spu@163.com。