超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析人乳中的3種雌激素

曹宇彤，任皓威，劉寧

（1.國家乳業(yè)工程技術研究中心，哈爾濱150028；2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析人乳中的3種雌激素

曹宇彤1,2，任皓威1,2，劉寧1,2

（1.國家乳業(yè)工程技術研究中心，哈爾濱150028；2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)的方法對我國人乳中雌激素含量進行分析測定。樣品經(jīng)酶解，提取，固相萃取柱凈化和濃縮后，采用Waters UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)分離，以MRM多反應監(jiān)測掃描模式檢測，外標法定量分析。在0.5～20 ng/mL范圍內(nèi)，校準曲線呈現(xiàn)良好的線性，相關系數(shù)(R2)大于0.99。結(jié)果表明，該方法具有良好靈敏度、準確度。該方法已成功應用于人乳中3種雌激素的定性和定量分析。

人乳；雌激素；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；固相萃取

0 引言

人乳是嬰兒的安全、天然營養(yǎng)食品，在提供營養(yǎng)、促進生長發(fā)育、健全神經(jīng)系統(tǒng)、增強免疫力等方面起重要作用[1-5]。人乳中含有雌激素，主要包括雌二醇（estradiol，E2）、雌三醇（estriol，E3）和雌酮（Estrone，E1）等。這些激素對嬰兒的代謝平衡、生長發(fā)育、性別的開發(fā)和促進等起重要的調(diào)節(jié)作用[6-9]。由于它們在低濃度下對生物也有很強的生物活性[10]，低濃度的激素攝入是否會對嬰兒健康造成影響已備受人們關注。中國約有一半以上的嬰兒家庭采取嬰兒配方奶粉喂養(yǎng)的方式對嬰兒喂養(yǎng)。因此，使嬰兒配方奶粉更加接近母乳成分尤為重要。本研究建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測定中國人乳中雌激素的方法，通過對人乳中雌激素分析，為雌激素在嬰兒配方奶粉中的安全殘留量的檢測提供可靠的依據(jù)。

1 實驗

1.1材料與儀器

人乳樣品采自年齡在23～35歲（平均孕期為40周）的中國漢族乳母。乳母身體指標正常，無妊娠高血壓、糖尿病及其他影響脂質(zhì)代謝的疾病。初乳（1～ 5 d）樣品10個，過渡乳（6～21 d）樣品13個，成熟乳（21 d以后）樣品16個，每個階段分別采集50 mL供實驗用。標準品為雌酮、雌二醇、雌三醇，β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶。甲醇、乙腈均為色譜純，正己烷、乙酸乙酯和丙酮均為分析純。超高效液相色譜儀，QTRAP?6500質(zhì)譜儀。MTN-2800D氮吹儀，純水發(fā)生器，AL204精密電子天平，ZHWY-100B臺式振蕩器，PK-98-1型電子恒溫水浴鍋，超速離心機。

1.2方法

1.2.1 人乳的采集

對哈爾濱地區(qū)不同泌乳階段的健康女性隨機采集，使用自動采乳器采集不同泌乳期的中國人乳各50 mL左右，將獲得的人乳收集到無菌奶瓶中，蓋上瓶蓋，搖勻。把乳樣分裝到5個10 mL的無菌離心管中，粘貼上統(tǒng)一的標簽（包括乳母姓名、采集時間和樣品量），放到離心管泡沫架上，置于-20℃冰箱中，待采集完畢后，將乳樣統(tǒng)一存放至-80℃冰箱中，待分析。

1.2.2 標準曲線的繪制

取3種雌激素的標準品用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的儲備溶液，于-20℃貯存，用時稀釋。將標準儲備溶液中的每一種都用甲醇分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 ng/mL的混合標準系列溶液。在實驗色譜條件下，分別取2 μL進樣，測定保留時間和峰面積，以測得的標準品峰面積對質(zhì)量濃度（μg/L）繪制標準曲線。

1.2.3 人乳中雌激素的提取

向樣品中加入40 μL的β-葡萄糖醛酸甙酶渦旋混合于37℃振蕩酶解12 h。取出后冷卻至室溫，加入10 mL乙腈，渦旋2 min，室溫下超聲提取15 min，于4℃，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min下離心10 min，有機相轉(zhuǎn)入玻璃管中，殘渣用10 mL乙腈重復提取1次，合并有機相于玻璃管中。有機相于40℃氮氣吹至近干，加5 mL體積分數(shù)為30%甲醇水溶液溶解，將此溶液過HLB柱（柱子先用5 mL甲醇和5 mL水依次活化），用5 mL體積分數(shù)為30%甲醇水溶液淋洗，真空抽干，然后用5 mL甲醇洗脫柱子，洗脫液在40℃氮氣吹至近干，用甲醇溶液溶解濃縮物并定容至1.0 mL，過0.22 μm有機濾膜，待檢測。

1.2.4 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Acquity UPLC XDB C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；負離子模式下流動相為乙腈溶液，梯度洗脫，0 min，20%乙腈；0～1 min，20%～50%乙腈；1～5 min，50%乙腈；流速為0.5 mL/min；柱溫為35℃；進樣量為2 μL。

質(zhì)譜檢測在多反應監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）下完成。雌激素在負離子（ESI-）模式下檢測。ESI-界面操作條件為：碰撞氣壓（colli?sion gas，CAD）0.04 MPa；氣簾氣壓（curtain gas，CUR）0.24 MPa；霧化氣壓（ion source gas 1，GS 1）0.27 MPa；去溶劑氣壓（ion source gas 2，GS 2）0.48 MPa；離子噴霧電壓（ion spray voltage，IS）-4500 V；離子源溫度（ion source temperature，TEM）500℃。

1.2.5 統(tǒng)計學處理

分析結(jié)果采用AB質(zhì)譜analyst工作站軟件所采集提供的數(shù)據(jù)。采用Excel電子表格軟件進行數(shù)據(jù)錄入，計量資料數(shù)據(jù)采用平均值表示并用采用t檢驗對其進行比較。使用Sigma Plot 11.0軟件進行作圖。每個獨立實驗均做平行實驗，以求得準確性好、穩(wěn)定性高的實驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1人乳雌激素前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 雌激素的酶解

人乳中游離態(tài)的雌酮（E1）僅占雌酮總量的4.35%，其主要的雌激素代謝產(chǎn)物表現(xiàn)形式為葡萄糖醛酸結(jié)合物（estrone glucosiduronaes，E1G），占雌酮總量的33%～55%，其余以硫酸酯形式存在；人乳中游離態(tài)的雌二醇（E2）占總量的20%左右，以葡糖酸苷酯和硫酸酯形式存在的雌二醇各占總量的40%；人乳中游離態(tài)的雌三醇（E3）僅占總量的3.1%左右，以葡糖酸苷酯和硫酸酯形式存在的分別占近50%和47%?？傊?，在人乳中結(jié)合態(tài)雌激素占總量90%以上，而人初乳中非結(jié)合態(tài)雌激素僅占總量的4.8%左右[11]。人乳內(nèi)的結(jié)合態(tài)的雌激素可能直接來源于血液或者是乳腺細胞內(nèi)甾醇前體的代謝產(chǎn)物。人乳中的雌激素主要以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式存在，僅檢測游離部分不能得到3種雌激素的總體含量，因此需要對雌激素進行酶解，而檢測雌激素總量時則需要用β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶水解樣品后再進行測定。本研究在樣本預處理中，先用β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶水解釋放雌激素，再進行固相萃取。

2.1.2 提取溶劑的優(yōu)化

選擇合適的提取試劑和提取方法，對雌激素回收效率至關重要。本研究采取有機溶劑提取，結(jié)合振蕩和超聲方式以促進分析物進入有機溶劑中。人乳樣品中蛋白質(zhì)和脂肪是主要成分，同時也是干擾物的主要來源，因此樣品中蛋白質(zhì)和脂肪的去除以及待測組分的提取是樣品前處理過程的關鍵。雌激素在非極性溶劑中溶解度低，提取試劑的極性應與分析物的極性匹配。實驗中3種雌激素較易溶解于極性溶劑中，因此，考察了正己烷、甲醇、乙腈及乙酸乙酯4種不同提取溶劑對回收率的影響。4種提取溶劑的影響結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，甲醇和乙腈由于極性較強對樣品的穿透力強于乙酸乙酯和正己烷；但是，樣品中脂肪等基質(zhì)干擾物易溶于甲醇，增加了后續(xù)SPE柱凈化難度；并且乙酸乙酯萃取后溶液呈深土黃色，雜質(zhì)干擾較大，不易凈化，平均回收率僅為49.72%；正己烷和甲醇的提取效果較差，3種激素的平均回收率在57.16%和61.15%左右；而乙腈作為提取溶劑得到的平均回收率為82.53%，乙腈提取效率最高，并具有沉淀蛋白作用，乙腈提取溶液最干凈。故選取乙腈作為提取溶液，能夠獲得3種雌激素較好的提取效果。

圖1 提取溶劑對回收率的影響

2.1.3 固相萃取柱的優(yōu)化

由于人乳中的雌激素含量很低，并且甘油三酯等干擾雜質(zhì)較多，含量較大，因此本研究采用固相萃取柱進行樣品的凈化。雌激素含有甾族結(jié)構，極性大多為中等或者偏弱，用親水親脂平衡（Hydrophobic-li?pophilic balance，HLB）柱[12]、C18柱[13]和MCX柱[14]凈化。不同固相萃取柱對類固醇的凈化效果的影響見圖2。結(jié)果表明，C18對雌三醇、雌二醇回收率只有HLB柱的一半。HLB柱對于雌二醇、雌三醇的回收率很高，能夠達到82.60%和83.18%。而MCX柱對于雌激素的回收率處于C18柱和HLB柱兩者回收率之間。HLB柱、C18柱和MCX柱對雌激素的平均回收率分別為81.38%、57.57%和71.74%。并且三個柱子中HLB柱最能保持優(yōu)良的潤濕性，可以避免由于意外干涸所導致的穩(wěn)定性差和回收率低的問題，因此本研究中應用HLB柱進行雌激素的萃取和凈化。

圖2 固相萃取柱對回收率的影響

2.1.4 固相萃取洗脫溶液的優(yōu)化

常用的固相萃取洗脫溶液有丙酮、甲醇、乙腈等。本研究考查了丙酮、甲醇、乙腈、甲醇-乙腈（1/1，體積比）混合液對雌激素的洗脫能力。四種洗脫液的洗脫效果見表3。結(jié)果顯示，丙酮洗脫時，平均回收率為66.15%，甲醇洗脫時，其平均回收率為65.34%，乙腈洗脫時，其平均回收率為72.07%，甲醇-乙腈（1/1，體積比）洗脫時，平均回收率為85.53%。由此可看出，甲醇-乙腈（1/1，體積比）混合液的洗脫能力最強，故選取甲醇-乙腈（1/1，體積比）作為洗脫溶劑。

圖3 固相萃取洗脫溶劑對回收率的影響

2.1.5 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件優(yōu)化

本實驗首先選擇甲醇-水和乙腈-水作為流動相來同時分析3種雌激素的分離效果，發(fā)現(xiàn)甲醇-水不能將電離模式為負的3種雌激素全部出峰，而乙腈-水可以使電離模式為負的雌激素出峰分離。為了有利于雌激素化合物的離子化，在負離子模式下流動相水相中加入體積分數(shù)0.1%氨水，各激素的峰形和靈敏度沒有多大改善。因此采用乙腈-水作為流動相分析3種雌激素。對標準溶液和樣品分別進行全掃描，再調(diào)節(jié)碰撞能量，分別選取經(jīng)碰撞后所得豐度較高、碎片結(jié)構合理的兩個子離子作為定量和定性離子，并優(yōu)化其最佳去簇電壓和碰撞能量。最終確定的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 3種雌激素的質(zhì)譜參數(shù)

2.2超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法學驗證

2.2.1 線性關系

用甲醇配制3種雌激素的標準溶液，配制范圍為0.5～20 ng/mL，以激素定量離子色譜峰面積（Y）為縱坐標，相應濃度（X）為橫坐標繪制校準曲線。3種雌激素具有良好的線性關系，相關系數(shù)R2均大于0.99，結(jié)果如表2所示。

表2 3種雌激素的線性方程、相關系數(shù)、LOD和LOQ

儀器基線3倍信噪比（S/N）對應的樣品中雌激素濃度作為方法檢出限（LOD），因此3種雌激素檢出限在0.19～0.25 ng/mL范圍內(nèi)；儀器基線10倍信噪比（S/ N）對應的樣品中雌激素濃度為方法定量限（LOQ），因此定量限在0.69～0.85 ng/mL范圍內(nèi)。

2.2.2 回收率和精密度

按照1.0，5.0，10.0 ng/mL質(zhì)量濃度水平對人乳樣品進行添加回收實驗。分別在3段泌乳期的樣品中添加3種不同水平的混合標準溶液，按實驗方法進行預處理，每個水平重復測定5次，分別計算平均回收率和相對標準偏差，方法結(jié)果滿意，具體數(shù)值參如表3所示。

表3 3種雌激素加標的回收率和精密度（n=5） %

2.3人乳雌激素超高效液相色譜-質(zhì)譜法分析

應用本研究建立的方法對三個階段泌乳期的10個初乳樣品、13個過渡乳樣品和16個成熟乳樣品進行分析，在上述色譜條件下，保留時間分別為：雌酮3.34 min，雌二醇2.88 min和雌三醇1.27 min，如圖4所示。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測應在確定母離子的基礎上選擇兩個以上的子離子，表明方法專一性良好。具體各雌激素在三段泌乳期中的含量及變化情況參見表4。由表4可知，初乳中雌激素含量很高，雌酮平均質(zhì)量濃度3.78 ng/mL，雌二醇平均質(zhì)量濃度最高，達到7.4 ng/mL，雌三醇平均質(zhì)量濃度達到4.05 ng/mL。三種雌激素質(zhì)量濃度都隨著泌乳期的延長而降低。

圖4 3種雌激素色譜

圖4中，cps全稱為count per second，其物理意義是每秒檢測到的離子個數(shù)”。

表4 各泌乳期中國人乳3種雌激素質(zhì)量濃度 ng/mL

3 結(jié)論

建立了提取和檢測人乳中3種雌激素的超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）分析方法。優(yōu)化了樣品前處理技術和色譜質(zhì)譜條件。該法線性關系良好（R2=0.99）、準確度和精密度良好，RSD在2.07%～ 3.92%之間，方法的檢出限LOD在0.19～0.25 ng/mL之間，同其他方法相比一致或更低。所建方法已成功應用于實際人乳樣品的檢測。由于人乳被認為是嬰兒完美的食物，其雌激素的質(zhì)量濃度可以作為食品和營養(yǎng)專家為嬰兒的膳食調(diào)配的一個參考，同時采集的數(shù)據(jù)也可以作為嬰兒配方奶粉中雌激素安全的殘留質(zhì)量濃度的一個標準。

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Analysis of three estrogens in Chinese human milk using UPLC/MS/MS

CAO Yu-tong1,2，REN Hao-wei1,2，LIU Ning1,2
（1.National Dairy Engineering&Technical Research Center，Harbin 150028，China;2.Northeast Agricultural Univer?sity，College of Food Science，Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Harbin 150030，China）

An effective method was established with an ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC/MS/ MS）method for determination of steroid hormones in Chinese human milk.Samples were treated with enzymatic hydrolysis，extraction，pu?rification with solid phase extraction（SPE）column and concentration，separation by a Waters UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）chromatographic column，and reaction monitoring for MS/MS scan pattern detection，and the quantification was performed with standard method.Calibration curve showed a good linear correlation coefficient（R2）that was above 0.99.The results showed that this method has good sensitivity and accuracy.The method has been successfully applied to qualitative and quantitative analysis for 3 estrogens in human milk.

human milk；estrogen；UPLC/MS/MS；SPE

TS252.1

A

1001-2230（2016）09-0052-04

2016-03-28

“十二五”國家科技支撐計劃（2011BAD09B03）

曹宇彤（1990-），女，碩士研究生，研究方向為營養(yǎng)與乳制品加工技術。

劉寧