陜西省生鮮乳中β-內酰胺酶的檢測與結果分析

(陜西省產品質量監(jiān)督檢驗研究院，西安710048）

陜西省生鮮乳中β-內酰胺酶的檢測與結果分析

秦婧，張莉，舒靜，樊成

(陜西省產品質量監(jiān)督檢驗研究院，西安710048）

本次檢測共有149份生鮮乳樣品，其中鮮牛乳96份，鮮羊乳53份。旨在了解陜西省生鮮乳中是否含有β-內酰胺酶及其殘留狀況。采用食品整治辦[2009]29號指定檢驗方法4《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內酰胺酶類物質檢驗方法-杯碟法》。結果 共檢出17份β-內酰胺酶陽性樣品，陽性樣品檢出率為11.4%。17份陽性樣品中，鮮牛乳9份，鮮牛乳陽性樣品檢出率為9.4%；鮮羊乳8份，鮮羊乳陽性樣品檢出率為15.1%。17個陽性樣品的dA與dB差值較大在6.08-13.3mm。本次檢測樣品陽性檢出率較高為11.4%，且陽性樣品中所殘留的β-內酰胺酶含量較高，可見生鮮乳中抗生素和β-內酰胺酶監(jiān)管形勢依然嚴峻。

β-內酰胺酶；杯碟法；生鮮乳；抗生素

0 引言

乳類及乳制品在我國國民膳食中占有重要地位，但是近年來乳類及乳制品中抗生素殘留問題十分嚴重。主要是奶農為治療奶畜的乳腺炎，向奶畜注射或在飼料中加入抗生素。一些奶農在利益驅使下，為掩蓋乳品中殘留的抗生素向乳品中添加β-內酰胺酶。β-內酰胺酶是一種解抗劑，將其加入到添加了抗生素的乳類及乳制品中，可將其中的抗生素分解，從而干擾檢測，使得在定性檢測抗生素時無法正常顯示陽性檢出結果。衛(wèi)生部于2009年2月將β-內酰胺酶列入禁止在乳品（包括生鮮乳）中添加的非食用物質名單[1]。本次檢測旨在了解陜西省生鮮乳中是否含有β-內酰胺酶及其殘留狀況，現(xiàn)將檢測結果進行報告和分析。檢驗方法采用食品整治辦[2009]29號指定檢驗方法4《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內酰胺酶類物質檢驗方法-杯碟法》[2]。

1 實驗

1.1樣品與菌種

本次檢測樣品共149份，其中鮮牛乳96份，鮮羊乳53份。由于生鮮乳不易保存，為保證檢測準確性，樣品采集后須立即放入0～4℃冷藏箱中保存，并于采樣當天送至實驗室進行檢測。

試 驗 菌 種 ：藤 黃 微 球 菌 (Micrococcus luteus) CMCC(B)28001，傳代次數不得超過14次。

1.2材料與設備

除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：抑菌圈測量儀；恒溫培養(yǎng)箱（36℃±1℃）；高壓滅菌器；無菌培養(yǎng)皿:內徑90 mm，底部平整光滑的玻璃皿，具陶瓦蓋；無菌牛津杯（外徑8.0 mm±0.1 mm，內徑6.0 mm±0.1 mm，高度10.0 mm±0.1mm）；麥氏比濁儀；無菌吸管1 mL（0.01 mL刻度值），10 mL（0.1 mL刻度值）；加樣器為5～20 μL，20～200 μL及配套吸頭。

1.3培養(yǎng)基和試劑

除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水為GB/ T6682中規(guī)定的三級水。

磷酸鹽緩沖溶液pH值為6.0，生理鹽水（8.5 g/L），青霉素標準品（純度99.0%），舒巴坦標準品，β-內酰胺酶標準溶液，活性170 000 U/mL，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，抗生素檢測用培養(yǎng)基Ⅱ。

2 方法

檢測方法采用食品整治辦[2009]29號指定檢驗方法4《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內酰胺酶類物質檢驗方法-杯碟法》。

2.1菌懸液的制備

1988年，昆明供電局所轄35千伏至220千伏變電站為24座，總容量僅166萬千伏安，年供電量僅有37.8億千瓦時。而到了2018年1月12日，昆明供電局單日全社會用電量突破1.1億千瓦時。

將藤黃微球菌接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，經（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，用生理鹽水洗下菌苔即為菌懸液，測定菌懸液濃度，終濃度應大于1×1010mL-1，4℃保存，貯存期限2周。

2.2樣品的制備

將待檢樣品充分混勻，取1 mL待檢樣品于1.5 mL離心管中共4管，分別標為A，B，C，D；每個樣品做三個平行，共12管，同時每次檢驗應取純水1 mL加入到1.5 mL離心管中作為對照。

2.3檢驗用平板的制備

取90 mm滅菌玻璃培養(yǎng)皿，底層加10 mL滅菌的抗生素檢測用培養(yǎng)基Ⅱ,凝固后上層加入5 mL含有濃度為1×108mL-1藤黃微球菌的抗生素檢測用培養(yǎng)基Ⅱ,凝固后備用。

2.4樣品的測定

按照下列順序分別將青霉素標準溶液、β-內酰胺酶標準溶液、舒巴坦標準溶液加入到樣品及純水中：A青霉素5 μL；B舒巴坦25 μL和青霉素5 μL；Cβ-內酰胺酶25 μL和青霉素G 5 μL；Dβ-內酰胺酶25 μL，舒巴坦25 μL，青霉素5 μL。

混勻后，將上述A～D試樣各200 μL加入放置于檢驗用平板上的4個無菌牛津杯中，36±1℃培養(yǎng)培養(yǎng)18～22 h，測量抑菌圈直徑。每個樣品，取三次平行試驗平均值。

2.5結果報告

純水樣品結果應為：A、B、D均應產生抑菌圈；A的抑菌圈與B的抑菌圈相比，差異在3 mm以內(含3 mm)，且重復性良好；C的抑菌圈小于D的抑菌圈，差異在3 mm以上(含3 mm)，且重復性良好。如為此結果，則系統(tǒng)成立，可對樣品結果進行如下判定：

（1）如果樣品結果中B和D均產生抑菌圈，且C與D抑菌圈差異在3 mm以上（含3 mm）時，可按下面I和II判定結果。

I．A的抑菌圈小于B的抑菌圈差異在3 mm以上(含3 mm),且重復性良好，應判定該試樣添加有β-內酰胺酶，報告β-內酰胺酶類藥物檢驗結果陽性。

II．A的抑菌圈同B的抑菌圈差異小于3 mm，且重復性良好，應判定該試樣未添加有β-內酰胺酶，報告β-內酰胺酶類藥物檢驗結果陰性。

（2）如果A和B均不產生抑菌圈，應將樣品稀釋后再進行檢測。

3 結果與分析

3.1 β-內酰胺酶陽性樣品檢出情況

本次檢測共149份生鮮乳樣品，其中鮮牛乳96份，鮮羊乳53份，檢測結果如表1所示。

表1 生鮮乳中β-內酰胺酶檢測結果

（1）共檢出17份β-內酰胺酶陽性樣品，陽性樣品檢出率為11.4%。17份陽性樣品中，鮮牛乳9份，鮮牛乳陽性樣品檢出率為9.4%；鮮羊乳8份，鮮羊乳陽性樣品檢出率為15.1%。

（2）本次針對生鮮乳中β-內酰胺酶的檢測，陽性檢出率較高為11.4%，結果并不理想，可見仍有部分奶農因利益驅使向含有抗生素的生乳中添加了β-內酰胺酶以降解其中的抗生素。

3.2 β-內酰胺酶陽性樣品數據分析

本次監(jiān)測共檢出17份陽性樣品，數據如表2所示。表2中dA、dB、dC、dD分別為A、B、C、D抑菌圈直徑。

（1）由表2知，無論鮮牛乳或鮮羊乳，均有樣品的dA=8.00 mm和dA＞8.00 mm。dA=8.00mm，即A并未產生抑菌圈（牛津杯的直徑為8.00mm），說明A中的青霉素完全被樣品中的β-內酰胺酶分解，樣品中β-內酰胺酶含量較高。dA＞8.00 mm的樣品，dA小于dB且dA與dB的差值在3 mm以上，說明樣品中含有一定量的β-內酰胺酶，分解A中一定量的青霉素；在B中由于有舒巴坦的存在，抑制了β-內酰胺酶活性，使得青霉素未被完全分解且青霉素剩余含量較高，B的抑菌圈也較大，dB大于dA且差值在3 mm以上。因此，dA= 8.00 mm的樣品比dA＞8.00 mm的樣品所殘留的β-內酰胺酶含量高。

（2）由表2知，每個樣品dC=8.00 mm，即C未產生抑菌圈。C中本身存在β-內酰胺酶和青霉素，無論樣品中是否存在β-內酰胺酶，青霉素都會被本身存在的β-內酰胺酶完全分解，C不產生抑菌圈，故dC=8.00 mm。

（3）17個陽性樣品的dA與dB差值較大，最低為鮮牛乳5的6.08 mm，最高為鮮牛乳2的13.30 mm，有3個樣品在7～9 mm之間，其他12個樣品均在9 mm以上。綜合（1）和（2）可知，檢出的17個陽性樣品中所殘留的β-內酰胺酶含量較高。

3.3討論

綜合3.1和3.2可知，本次檢測共檢出17份β-內酰胺酶陽性樣品，陽性樣品檢出率高達11.4%，且陽性樣品中所殘留的β-內酰胺酶含量較高。

近年來，雖然國家陸續(xù)出臺相關法律文件且政府相關部門加大對使用非法添加物行為的打擊力度，企業(yè)也提高對β-內酰胺酶的檢驗頻率，但生鮮乳中β-內酰胺酶的非法添加仍然屢禁不止，本次監(jiān)測樣品陽性檢出率高達11.4%。其中，鮮羊乳的陽性檢出率為15.1%高于鮮牛乳的9.4%。陜西作為奶牛和奶羊養(yǎng)殖大省，養(yǎng)殖模式單一仍以農戶散養(yǎng)為主，由于乳腺炎等疾病頻發(fā)和抗生素濫用問題突出，造成生鮮乳中抗生素殘留十分嚴重。所以，一些奶農向生鮮乳中添加β-內酰胺酶以掩蓋其中的抗生素。這種現(xiàn)狀亟需改變，因此建議：

表2 陽性樣品實驗數據mm

（續(xù)表2）

（1）盡快出臺乳及乳制品中β-內酰胺酶檢測國家標準和打擊使用非法添加物行為的法律法規(guī)；

（2）監(jiān)測部門完善抽檢方案，提高對生鮮乳的抽檢頻率和效率，使生鮮乳抽檢常態(tài)化、隨機化，尤其是在奶牛和奶羊疾病高發(fā)期；

（3）農業(yè)部系統(tǒng)應加強奶畜休藥期的管理，嚴厲打擊抗生素濫用行為。

（4）加強對奶牛和奶羊的綜合管理，鼓勵并扶持企業(yè)自建養(yǎng)殖場，逐步形成大而強的牛羊乳業(yè)態(tài)產業(yè)鏈；

（5）逐漸探索并建立源頭控制機制和溯源機制，從源頭上解決抗生素濫用問題，使每一頭牛羊，每一件乳產品都有完整的檔案可查。

以上建議核心是健全食品安全監(jiān)管機制，需要國家的組織和各相關部門相互配合相互協(xié)調，還需要社會各界的大力支持，乳品安全仍然任重而道遠。

[1]衛(wèi)生部.關于印發(fā)《全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治近期工作重點及要求》的通知（衛(wèi)監(jiān)督發(fā)[2009]21號）.

[2]食品整治辦[2009]29號指定檢驗方法4乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內酰胺酶類藥物檢驗方法（杯碟法）.

Monitoring and analysis ofβ-Lactamase in raw milk in Shanxi province

QIN Jing，ZHANG Li，SHU Jing，F(xiàn)AN Cheng
(Product Quality Supervision and Inspection Institute of Shanxi Province,Xi’an 710048,China)

There are 149 samples of raw milk,including 96 cow’s milk and 53 samples of goat milk.The objective is to supervisingβ-lac?tamase residues in raw milk.The method of testingβ-lactamase in raw milk is based on“cylinder plate method”published by Ministry of China Health.The result shows thatβ-lactamase is detected in 17 samples(relevance ratio:11.4%).Among 17 samples,there are 9 samples of cow’s milk(relevance ratio:9.4%)and 8 samples of goat milk(relevance ratio:15.1%).The differences between bacteriostatic ring of 17 positive samples were among 6.08～13.3mm.The relevance ratio is 11.4%and the remainingβ-lactamase content in positive samples is high?er.So antibiotic andβ-lactemase still exist in raw milk，relevant government departments should strengthen the supervision.

β-lactemase;cylinder plate method;raw mik;antibiotic

TS252.7

B

1001-2230（2016）09-0061-04

2016-01-21

秦婧（1989-），女，碩士研究生，從事食品檢測工作。