γ-促分泌酶抑制劑對毛細(xì)支氣管炎模型大鼠體內(nèi)Th17細(xì)胞分化的影響①

王海英 劉良宵 吳福玲 高 萌

(濱州醫(yī)學(xué)院，煙臺264003)

γ-促分泌酶抑制劑對毛細(xì)支氣管炎模型大鼠體內(nèi)Th17細(xì)胞分化的影響①

王海英 劉良宵 吳福玲 高 萌

(濱州醫(yī)學(xué)院，煙臺264003)

目的：研究γ-促分泌酶抑制劑阻斷Notch信號對毛細(xì)支氣管炎(簡稱毛支)模型大鼠Th17細(xì)胞發(fā)育和分化的影響，為毛支治療尋找新的藥物提供理論基礎(chǔ)。方法：按隨機(jī)對照原則將SD大鼠分為正常組、毛支組和γ-促分泌酶抑制劑組，滴鼻法成功建立毛支模型，而后尾靜脈注射γ-促分泌酶抑制劑MW167，通過HE染色觀察肺組織病理改變，ELISA檢測血漿中白介素17(IL-17)的水平，實(shí)時熒光定量PCR檢測肺組織和外周血單個核細(xì)胞中RORγt mRNA的表達(dá)，Western blot檢測肺組織中Notch信號、RORγt的蛋白表達(dá)。結(jié)果：與毛支組相比，MW167組肺組織病理學(xué)改變減輕；血漿IL-17水平也較毛支組降低；肺組織及外周血單個核細(xì)胞RORγt mRNA在MW167注射組表達(dá)均減弱；MW167組肺組織Notch信號和RORγt蛋白的表達(dá)也顯著降低。結(jié)論：靜脈注射γ-促分泌酶抑制劑能夠通過阻斷Notch信號通路抑制Th17細(xì)胞的分化，緩解毛支模型大鼠的氣道炎癥，對毛支有潛在的治療價值。

毛細(xì)支氣管炎；Notch；γ-促分泌酶抑制劑；Th17細(xì)胞

毛細(xì)支氣管炎是一種常見于嬰幼兒的下呼吸道感染性疾病，多發(fā)于冬季，其最主要病原體為呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)，病毒侵入人體后會誘發(fā)T細(xì)胞性免疫應(yīng)答，大量實(shí)驗(yàn)證明在毛支炎癥過程中除了Th1/Th2細(xì)胞應(yīng)答失衡外，Th17細(xì)胞反應(yīng)在其發(fā)病過程中也占有重要地位[1,2]。Notch信號通路是普遍存在于從無脊椎動物到哺乳動物的高度保守的信號序列，能夠調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化及發(fā)育[3]。有研究證明Notch信號通路阻斷劑不僅可以調(diào)節(jié)Th1和Th2免疫應(yīng)答減輕肺部炎癥反應(yīng)，還可能通過調(diào)節(jié)Th17反應(yīng)影響炎癥過程[4]。本實(shí)驗(yàn)通過向毛支模型大鼠體內(nèi)注射γ-分泌酶抑制劑(γ-secretase inhibitor,GSI)阻斷Notch信號，研究Notch信號對Th17細(xì)胞分化及發(fā)育的影響，探討改善毛支癥狀的新方法，為毛支治療尋找新的藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠24只，7周齡，購自青島派特福德白鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社；RSV病毒，由山東省病毒研究所饋贈；γ-促分泌酶抑制劑Ⅱ(MW167)為德國默克密理博公司產(chǎn)品；白細(xì)胞介素17(Interleukin,IL-17)ELISA試劑盒購自朗頓公司；TRIzol、cDNA試劑盒及SYBR Green熒光試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品，引物購自上海生工公司；兔抗大鼠RORγt多克隆抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 制備RSV懸液 將RSV病毒滴入長滿單層Hela細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，吸附1 h，然后加入含2%胎牛血清的細(xì)胞維持液，放入培養(yǎng)箱。顯微鏡下觀察細(xì)胞的病變情況，待病變達(dá)100%時收獲病毒，用力震蕩培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞從瓶壁脫落，而后反復(fù)凍融3次，離心，收集含RSV的上清液。計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(50% tissue culture infective dose,TICD50)，并稀釋至5×104TICD50/0.1 ml。

1.2.2 動物分組和模型制備 將24只大鼠隨機(jī)分為3組，分別為正常對照組、毛支組、γ-分泌酶抑制劑組，每組8只。毛支動物模型制備，將病毒按照0.4 μl/g滴入毛支組和γ-分泌酶抑制劑組大鼠兩側(cè)鼻孔，正常組以相同的量滴入細(xì)胞培養(yǎng)液。毛支模型制備完成后，將MW167按1 mg/kg的體質(zhì)量尾靜脈注射到γ-分泌酶抑制劑組大鼠體內(nèi)，間隔48 h至1周，即分別于第1、3、5、7天注射，剩余兩組用PBS代替MW167進(jìn)行尾靜脈注射。

1.2.3 外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mono-nuclear cell,PBMC)的收集 于末次藥物注射2 d后，麻醉大鼠，暴露腹腔，輕輕分離出腹主動脈，抗凝取血。將收集的血液按照大鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒所提供方法提取PBMC。

1.2.4 肺組織病理觀察 暴露大鼠胸腔，用PBS灌洗肺組織，然后將一葉肺置于40 g/L多聚甲醛中固定，制成石蠟切片，行HE染色，觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.2.5 實(shí)時定量PCR檢測肺組織中RORγt mRNA的水平 用Trizol法提取肺組織中總RNA。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用SYB Green實(shí)時熒光定量PCR檢測基因表達(dá)，大鼠的GAPDH作為內(nèi)參基因，大鼠RORγt上游引物為5′-CCTCCTGCCACCTTGAGTAT-3′，下游引物為5′-TCTGAGCCCTGTTCT-3′，產(chǎn)物長度130 bp，按照TaKaRa的SYBR Green 熒光PCR試劑盒說明進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：2×SYBR Premix Ex Taq聚合酶10 μl、上游引物0.4 μl、下游引物0.4 μl、cDNA 2 μl、50×ROX Reference Dye 0.4 μl、無核酸酶水6.8 μl。反應(yīng)條件：95℃ 30 s,95℃ 5 s,60℃ 20 s,50個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束設(shè)定最佳閾值線，設(shè)正常對照組基因表達(dá)為1，獲得其他各組基因表達(dá)的相對值。

1.2.6 ELISA檢測血漿中IL-17的水平 大鼠腹主動脈取血，抗凝處理后離心，取上血漿層，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿中IL-17的水平。

1.2.7 Western blot法檢測肺組織中RORγt的表達(dá) 將肺組織用蛋白裂解液裂解，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，上樣量為60 μg。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；然后脫脂奶粉封閉2 h；兔抗大鼠RORγt多克隆抗體(1∶500)，4℃封閉過夜；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)，室溫孵育1 h；DAB法顯色。用電泳凝膠成像分析儀采集結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，多組間比較用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠癥狀、體征觀察 毛支組大鼠在接種病毒后出現(xiàn)輕微卡他性鼻炎，口唇發(fā)紺，活動度減弱等表現(xiàn)。MW167組大鼠的上述表現(xiàn)減輕。正常對照組大鼠無異常表現(xiàn)。

2.2 肺組織形態(tài)學(xué)分析 比較3組大鼠肺組織HE病理切片。與正常組相比，毛支組大鼠肺組織炎癥明顯，炎細(xì)胞在支氣管及血管周圍廣泛浸潤，支氣管黏膜增厚，管腔狹窄，說明毛支模型制備成功。與毛支組相比，MW167組的炎癥表現(xiàn)顯著減輕，炎細(xì)胞浸潤程度顯著減少，黏膜增厚不明顯，肺泡腔內(nèi)偶有炎細(xì)胞，說明MW167有緩解毛支病理變化的作用。見圖1。

2.3 大鼠肺組織和PBMC中RORγt mRNA的表達(dá) 與正常組相比，毛支組和 MW167 組大鼠的肺組織和PBMC中RORγt mRNA表達(dá)均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01；MW167組較毛支組表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01。見圖2。

圖1 肺組織病理改變(HE，×400)Fig.1 Observation of lung tissue(HE，×400)Note:A.Normal group;B.Bronchiolitis group;C.γ-secretase inhibitor group.

圖2 各組大鼠肺組織及外周血中RORγt mRNA的表達(dá)Fig.2 Expression of RORγt mRNA in lung tissue and PBMCNote:Compared with RSV group,**.P<0.01.

圖3 各組大鼠血漿IL-17的水平Fig.3 Expression of IL-17 in plasmaNote:Compared with RSV group;**.P<0.01.

圖4 Western blot檢測各組大鼠肺組織相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.4 Western blot detect associated protein expression in lung tissueNote:1.Normal group;2.Bronchiolitis group;3.MW167 group;compared with RSV group,**.P<0.01.

2.4 大鼠血漿IL-17的水平 毛支組大鼠血漿IL-17水平顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01；MW167組IL-17較毛支組表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01。見圖3。

2.5 大鼠肺組織中蛋白表達(dá)水平 毛支組大鼠肺組織中NICD和RORγt蛋白表達(dá)較正常組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；MW167組這兩種蛋白表達(dá)較毛支組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

3 討論

毛細(xì)支氣管炎是造成嬰幼兒住院的最常見原因，與哮喘的發(fā)生密切相關(guān)，嚴(yán)重影響著嬰幼兒的身體健康[5]。毛支患兒的主要病理特點(diǎn)除了Th1和Th2失衡外，Th17細(xì)胞的功能狀態(tài)也發(fā)生了相應(yīng)變化。

Th17細(xì)胞被認(rèn)為是區(qū)別于Th1和Th2細(xì)胞的第三類來自效應(yīng)CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞群，可特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子視黃酸受體相關(guān)孤核受體γt(Retinoid-related orphan nuclear receptor，RORγt)[6]。Th17細(xì)胞是一種重要的促炎細(xì)胞，過強(qiáng)的Th17應(yīng)答會造成炎癥和其他病理改變[7]。IL-17是Th17細(xì)胞分泌的最重要的炎癥因子，IL-17有招募和活化中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞到氣道的功能，刺激它們及其他類型細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)，IL-17還能夠阻斷CD8+淋巴細(xì)胞清除病毒顆粒的能力，協(xié)同體內(nèi)的固有免疫系統(tǒng)加劇炎癥反應(yīng)[8-10]。有研究發(fā)現(xiàn)在分化成熟的Th17細(xì)胞內(nèi)RORγt的表達(dá)呈現(xiàn)特異性的增高[11]。我們的前期研究也表明在毛支大鼠中Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-17、IL-23及其轉(zhuǎn)錄因子RORγt濃度較正常組大鼠顯著增高，這些細(xì)胞因子會造成炎細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致黏液分泌并降低肺功能[12]。

在哺乳動物中，有4種Notch受體和5種Notch配體。一個完整的Notch信號通路包括其受體、配體及細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子(CSL-DNA結(jié)合蛋白)三部分組成。Notch信號起始于其相鄰受體和配體的結(jié)合，然后通過一系列的酶促反應(yīng)引起Notch受體胞內(nèi)段(Notch receptor intracellular domain，NICD)的釋放并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄激活[13]。Amsen[14]研究證明Notch信號通路在T細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞功能調(diào)節(jié)方面都具有重要作用。

研究證明Notch信號能夠調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的分化，阻斷Notch信號將抑制Th17細(xì)胞應(yīng)答[3,15]。Notch信號通路還能夠直接促進(jìn)Th17相關(guān)的細(xì)胞因子及其轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，與對照組相比，經(jīng)GSI處理過的Th17細(xì)胞分泌的IL-17及RORγt的表達(dá)均明顯降低。體內(nèi)試驗(yàn)中，Keerthivasan等[16]用GSI阻斷多發(fā)性腦脊髓炎模型小鼠Notch信號通路后，Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-17及其轉(zhuǎn)錄因子RORγt亦顯著降低。本實(shí)驗(yàn)中，毛支大鼠注射GSI后，IL-17和RORγt表達(dá)減少，與上述結(jié)論相一致。另有研究證明用GSI阻斷哮喘大鼠模型的Notch信號通路后，肺組織NICD表達(dá)降低，血漿IL-17分泌減少，氣道炎癥緩解，臨床癥狀改善，說明GSI能夠抑制Th17細(xì)胞分化，減少IL-17的產(chǎn)生，緩解哮喘大鼠的氣道炎癥，是治療哮喘的有效措施[4]。本實(shí)驗(yàn)中，阻斷毛支模型大鼠Notch信號通路后，肺組織NICD、RORγt表達(dá)降低，另外肺組織及PBMC中RORγt mRNA表達(dá)亦降低，IL-17分泌減少，同時HE染色也可觀察到氣道炎癥的緩解，以上結(jié)果均說明阻斷Notch信號通路能夠緩解毛支大鼠癥狀。

綜上所述，Notch信號通路能夠通過調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的功能和狀態(tài)影響毛支病情及預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)通過注射GSI阻斷毛支大鼠Notch信號通路，抑制了Th17細(xì)胞應(yīng)答，減弱了其促炎作用，緩解了毛支炎癥，為毛支的治療提供了新的思路。

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[收稿2016-05-16 修回2016-06-12]

(編輯 倪 鵬)

Affection to differentiation of Th17 cell in bronchiolitis rat models after injecting γ-secretase inhibitor

WANG Hai-Ying,LIU Liang-Xiao,WU Fu-Ling,GAO Meng.

Binzhou Medical University,Yantai 264003,China

Objective:To investigate the affection to the differentiation of Th17 cell in rat models of bronchiolitis after blocking Notch signaling by γ-secretase inhibitor and provide rationale to seek new target for bronchiolitis drug treatment.Methods:The rats were randomly divided into normal group,bronchiolitis group and γ-secretase inhibitor group.The model of bronchiolitis was established successfully by nasal dripping,and γ-secretase inhibitor(MW167) was injected into the vena caudalis.The pathological changes of the airway were observed by HE staining;the plasma level of interleukin17(IL-17) was detected by ELISA;the level of RORγt mRNA in lung tissues and peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) was tested by real-time quantitative PCR;the levels of Notch signaling and RORγt protein in lung tissues were examined by Western blot.Results:Compared to the bronchiolitis group,the histopathologic change in MW167 intravenous injection group was significantly alleviated;the plasma level of IL-17 was decreased;the level of RORγt mRNA in lung tissues and PBMCs was lower in MW167-treated group than bronchiolitis group;the levels of Notch signaling and RORγt were decreased.Conclusion:γ-secretase inhibitor through intravenous injection suppresses the differentiation of Th17 cell and relieves the airway inflammation of bronchiolitis in rat models after blocking Notch signaling and has potential therapeutic value for treating bronchiolitis.

Bronchiolitis;Notch;γ-secretase inhibitor;Th17 cell

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.008

①本文受山東省自然科學(xué)基金(ZR2014HL001)和山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項(xiàng)目(2013WS0312)資助。

王海英(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事毛細(xì)支氣管炎與Notch信號通路方面的研究， E-mail：13276382516@163.com。

及指導(dǎo)教師：吳福玲(1966年-)，女，碩士，主任醫(yī)師，教授，主要從事小兒呼吸與免疫方面的研究，E-mail：wufuling000@163.com。

R392-33

A

1000-484X(2016)12-1765-04