高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠血漿microRNA表達(dá)譜及其與TLR4的關(guān)系①

馬 科 朱曉波 徐志偉 常曉彤

(河北北方學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，張家口075000)

高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠血漿microRNA表達(dá)譜及其與TLR4的關(guān)系①

馬 科②朱曉波 徐志偉 常曉彤

(河北北方學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，張家口075000)

目的：篩選高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠，以及應(yīng)用Toll樣受體4(Toll-like receptor4,TLR4)抑制劑TAK-242干預(yù)的胰島素抵抗小鼠血漿差異表達(dá)的微小RNA(microRNA,miRNA)，探討胰島素抵抗、TLR4和差異表達(dá)miRNAs的關(guān)系。方法：血漿標(biāo)本來自前期實(shí)驗(yàn)的3組小鼠，即以普通基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)(Low fat diet,LFD)的正常對照組、給予TAK-242的高脂飲食組(Treated high fat diet,HFD-T)和單純高脂飲食組HFD-C，應(yīng)用小鼠miRNA芯片檢測血漿miRNA表達(dá)譜，篩選差異表達(dá)的miRNAs；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法驗(yàn)證芯片結(jié)果。應(yīng)用生物信息學(xué)方法，以TLR4及其信號傳導(dǎo)通路為中心，預(yù)測差異表達(dá)miRNAs的靶基因，并對靶基因分別進(jìn)行GO和KEGG富集分析，以判定差異miRNAs主要影響的生物學(xué)功能或者通路。結(jié)果：miRNA基因芯片篩查結(jié)果顯示，單純高脂飲食組與正常飲食組比對，篩選出差異顯著的miRNAs共計(jì) 185種，其中6種miRNAs表達(dá)上調(diào)，179種miRANs表達(dá)下調(diào)；給予TAK-242的高脂飲食組與正常飲食組比對，篩選出差異顯著的miRANs 共計(jì)171種，均表達(dá)下調(diào)；給予TAK-242的高脂飲食組與單純高脂飲食組比對，篩選出差異表達(dá)的miRNAs共計(jì)13種，均為下調(diào)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，以TLR4為中心挖掘與其互作的蛋白質(zhì)，共發(fā)現(xiàn)有10種蛋白；在TAK-242給予的高脂飲食組與單純高脂飲食組中差異表達(dá)倍數(shù)均在1 000以上的4種miRNAs (mmu-miR-3095-3p、mmu-miR-5113、mmu-miR-709和mmu-miR-335-3p)，可在TLR4的互作蛋白質(zhì)或Toll樣受體信號通路中找到其作用的靶基因，發(fā)現(xiàn)這些靶基因74%屬于生物過程基因，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子占82%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測mmu-miR-3095-3p、mmu-miR-5113、mmu-miR-709和mmu-miR-335-3p水平，變化趨勢與芯片結(jié)果一致。結(jié)論：胰島素抵抗發(fā)生時(shí)，血漿miRNAs表達(dá)譜存在改變，此變化與TLR4及其信號通路相關(guān)。該研究結(jié)果豐富了胰島素抵抗發(fā)生的機(jī)制，為尋找胰島素抵抗血漿miRNAs診斷標(biāo)志物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

高脂飲食；胰島素抵抗；Toll樣受體4；微小RNA表達(dá)譜

肥胖被認(rèn)為是21世紀(jì)公共健康的最大威脅，肥胖患者忍受生活質(zhì)量和期望值的降低，并提高了2型糖尿病、心血管疾病、肝的脂肪變性和癌癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[1,2]。

肥胖相關(guān)的胰島素抵抗是糖尿病等多種疾病起始進(jìn)程的早期事件，與血脂障礙、高血壓、葡萄糖耐受不良和內(nèi)皮組織功能紊亂相關(guān)。大量研究表明，肥胖、胰島素抵抗患者呈現(xiàn)低水平的炎癥反應(yīng)，慢性炎癥是導(dǎo)致胰島素抵抗的一個(gè)重要原因[3]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)是模式識別受體Toll樣受體家族的一個(gè)成員，在病原識別和固有免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[4]。最近研究發(fā)現(xiàn)，TLR4不僅參與應(yīng)答病原生物入侵的天然免疫，許多無菌的炎癥導(dǎo)致的疾病，包括肥胖的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后，同樣依賴于TLR4信號[5]。因此，TLR4在肥胖相關(guān)的胰島素抵抗中的作用值得深入研究。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類進(jìn)化上高度保守的單鏈非編碼RNA分子，通常由19～22個(gè)核苷酸構(gòu)成。其主要通過抑制靶基因的翻譯過程，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控基因表達(dá)。近幾年，國內(nèi)外學(xué)者相繼報(bào)道m(xù)iRNAs可以影響體內(nèi)的多種代謝過程，包括糖脂代謝、胰島素分泌、細(xì)胞分化和炎癥反應(yīng)[6-8]。一些miRNAs已被確定在胰島素作用的靶組織(肝臟、脂肪組織、骨骼肌)中具有重要的生理作用[9]。進(jìn)一步的研究證實(shí)miRNAs不僅存在于細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞外也可穩(wěn)定存在，且在不同病理狀態(tài)下，某些血漿miRNAs水平發(fā)生特異性改變，推測血漿miRNAs檢測可能成為疾病早期診斷的新一代生物學(xué)標(biāo)志物[10]。

那么，高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗時(shí)，血漿miRNAs表達(dá)譜是否發(fā)生改變、此改變是否與TLR4信號相關(guān)，尚不清楚。為此，我們通過已建立的高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠模型和TLR4抑制劑TAK-242干預(yù)的胰島素抵抗小鼠模型，篩選了胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下血漿差異表達(dá)的miRNAs和行TLR4抑制劑TAK-242干預(yù)的胰島素抵抗小鼠血漿miRNAs表達(dá)譜的變化，探討TLR4、miRNAs與高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血漿標(biāo)本 來自前期實(shí)驗(yàn)的3組小鼠，即以普通基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)(Low fat diet,LFD)的正常對照組、給予TAK-242的高脂飲食組(Treated high fat diet,HFD-T)和單純高脂飲食組HFD-C。前期實(shí)驗(yàn)簡要概述：選取出生21 d的雄性C57BL/6小鼠36只，隨機(jī)分為2組，正常對照組12只，以普通基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)(Low fat diet,LFD)，高脂飲食實(shí)驗(yàn)組24只，給予高脂飼料喂養(yǎng)(High fat diet,HFD)。待2組小鼠體重出現(xiàn)顯著差異時(shí)，進(jìn)行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(Glucose tolerance test,GTT)和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(Insulin tolerance test,ITT)，觀察小鼠胰島素抵抗的發(fā)生。小鼠胰島素抵抗模型建立后，觀察TLR4抑制劑TAK-242對小鼠胰島素抵抗的作用。LFD組小鼠繼續(xù)以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)(即LFD對照組)；HFD組小鼠隨機(jī)分為2組，每組12只小鼠，均繼續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)，其中一組HFD小鼠腹腔注射TLR4抑制劑TAK-242，以0.5 mg TAK-242/kg體重的劑量給予，每周2次(即給予TAK-242的高脂飲食實(shí)驗(yàn)組，HFD-T組)；另一組HFD小鼠作為單純高脂飲食的胰島素抵抗空白對照組(HFD-C組)，只給予等體積的溶媒——二甲基亞砜(DMSO)。給予小鼠TLR4抑制劑 5個(gè)月，進(jìn)行GTT和ITT后，處死小鼠。采用EDTA-K2抗凝管收集血液標(biāo)本，立即分離血漿。

1.1.2 主要儀器及試劑 TGL-16B型高速臺式離心機(jī)(上海飛鴿)；Fresco 21型低溫高速離心機(jī)、NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo公司)；Agilent 2100 生物分析儀、Agilent G2505C掃描儀、Agilent G2545A 雜交爐(安捷倫公司)；97型PCR儀(ABI公司)；Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為德國QIAGEN公司產(chǎn)品。

miRNA檢測試劑(美國安捷倫公司)：主要包括總RNA提取試劑mirVanaTMRNA Isolation Kit (Applied Biosystem p/n AM1556 )；Gene Expression Wash Pack；miRNA complete Labeling and Hyb Kit(24×)；miRNA Spike In Kit；Micro Bio-Spin 6--(Bio-RAD)；Package 20 backings，8 HD arrays per slide；Package 20 backings，4 arrays per slide；實(shí)驗(yàn)使用芯片為Agilent Mouse miRNA(8*60K，Design ID為046065)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑(北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品)：miRNA提取試劑盒；逆轉(zhuǎn)錄試劑FastQuant RT Kit(with gDNase)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒SuperReal PreMix Plus(SYBR Green I)。

1.2 方法

1.2.1 Agilent miRNA芯片檢測血漿miRNA表達(dá)譜 采集LFD正常對照組(C-1)、給予TAK-242的高脂飲食組HFD-T(T-1)和單純高脂飲食組HFD-C(F-1)小鼠血漿。將每組小鼠血漿標(biāo)本混合，每個(gè)標(biāo)本樣本量不小于1 ml，運(yùn)用Agilent miRNA芯片進(jìn)行檢測。

血漿標(biāo)本用mirVanaTMRNA Isolation Kit提取總RNA后，經(jīng)NanoDrop ND-2000分光光度儀定量，使用Agilent Bioanalyzer2100檢驗(yàn)RNA完整性。RNA檢驗(yàn)合格后參照芯片標(biāo)準(zhǔn)流程，進(jìn)行樣本的標(biāo)記、芯片的雜交以及洗脫處理。首先將總RNA去磷酸化、變性，用Cyanine-3-CTP(Cy3)標(biāo)記；然后標(biāo)記好的溶液經(jīng)純化后進(jìn)行芯片雜交；經(jīng)洗脫后利用Agilent Scanner G2505C掃描得到原始圖像。原始圖像使用Feature Extraction軟件處理提取原始數(shù)據(jù)，再利用Genespring軟件進(jìn)行quantile標(biāo)準(zhǔn)化處理。分析比較正常低脂飼料組(C-1)、單純高脂組(F-1)、應(yīng)用TAK-242處理組(T-1)數(shù)據(jù)。在篩選差異miRNA之前，先進(jìn)行探針過濾，比較的每組標(biāo)本中應(yīng)至少有一組100%標(biāo)記為Detected的探針才能進(jìn)行后續(xù)分析。利用t檢驗(yàn)的P值和倍數(shù)Flod change值進(jìn)行差異miRNA篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0并且P值≤0.05(此部分實(shí)驗(yàn)由北京康普森生物科技有限公司完成)。

1.2.2 莖環(huán)-逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果

1.2.2.1 莖環(huán)-逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 選取芯片中顯著差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。在miRbase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org)中獲得mmu-miR-3095-3p(MIM-AT0014912)、mmu-miR-5113(MIMAT0020621)、mmu-miR-709(MIMAT0003499)和mmu-miR-335-3p(MIMAT0004704)的基因序列，在Genbank中獲得內(nèi)參U6(ENSMUSG00000095132)的序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并在NCBI中分析引物的特異性。逆轉(zhuǎn)錄所使用的莖環(huán)引物、PCR上下游引物均由寶銳通生物科技(北京)有限公司合成。莖環(huán)引物序列mmu-miR-3095-3p:5′GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAA-AGC3′;mmu-miR-5113:5′GTCGTATCCAGTGCAG-GGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGGA3′;mmu-miR-709 :5′GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCG-AGGTATTCGCACTGGATACGACTCCTCC3′;mmu-mi-R-335-3p:5′GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGTCAG3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物U6上游引物：5′ATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGC3′;U6下游引物：5′TGGAA-CGCTTCACGAATTTG3′;mmu-miR-3095-3p上游引物：5′TGGAGAGAGAGCTTTTGCTTTTGT3′;mmu-miR-5113上游引物：5′AGGAGACAGAGGAGGAG-AGAGATC3′;mmu-miR-709上游引物：5′AGAGGAGGCAGAGGCAGGAG3′;mmu-miR-335-3p上游引物：5′TTGCTCCTGACCCTGACCG3′;通用下游引物：5′CGCAGGGTCCGAGGTATTC3′。

1.2.2.2 逆轉(zhuǎn)錄cDNA的合成 采用miRNA提取試劑盒進(jìn)行miRNAs的抽提；FastQuant RT Kit(with gDNase)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。去除基因組DNA的反應(yīng)體系：在預(yù)處理無核酸酶的EP管中，加入5×gDNA Buffer 2 μl、RNA樣本1 μl、RNase-Free-ddH2O 7 μl，混勻后簡短離心，置于42℃孵育3 min，然后置于冰上放置。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：10×Fast RT Buffer 2 μl、RT Enzyme 1 μl、Stem loop primers 2 μl，U6 Reverse primer 2 μl，RNase-Free ddH2O 3 μl，混勻后將此體系加入到基因組DNA去除的反應(yīng)液中，充分混勻，42℃孵育15 min；95℃孵育3 min后放于冰上，得到的cDNA產(chǎn)物稀釋15倍用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測差異表達(dá)的miRNAs 同一個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對照孔。20 μl PCR反應(yīng)體系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μl、Forward primer 0.6 μl、Reverse primer 0.6 μl、cDNA模板1 μl、RNase-free ddH2O 7.8 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min；95℃變性10 s，60℃ 退火20 s，72℃延伸27 s，共40個(gè)循環(huán)。通過溶解曲線檢測樣本的特異性，通過同一樣本3個(gè)復(fù)孔檢測的變異系數(shù)評估實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。

1.2.4 數(shù)據(jù)的處理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析，用來驗(yàn)證血漿miRNAs表達(dá)差異，其中ΔCt= Ct(目的基因)-Ct( U6內(nèi)參基因)，ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt(對照組)。

1.2.5 靶基因預(yù)測與功能顯著性分析 應(yīng)用miRNA生物信息學(xué)軟件TargetScan數(shù)據(jù)庫對篩選出的差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測?；贕O(Gene Ontology)數(shù)據(jù)庫，根據(jù)靶基因的基因功能富集程度，進(jìn)行GO顯著性分析；基于KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes)數(shù)據(jù)庫，根據(jù)靶基因在信號通路中的富集程度，進(jìn)行pathway顯著性分析，以判定差異miRNA主要影響的生物學(xué)功能和通路。

2 結(jié)果

2.1 血漿miRNA表達(dá)譜檢測及分析 采集LFD正常對照組(C-1)、給予TAK-242的高脂飲食組HFD-T(T-1)和單純高脂飲食組HFD-C(F-1)小鼠血液分離血漿。將每組小鼠血漿標(biāo)本混合，每個(gè)標(biāo)本樣本量不小于1 ml，運(yùn)用Agilent miRNA芯片進(jìn)行檢測。

2.1.1 血漿樣本總RNA質(zhì)檢結(jié)果 應(yīng)用NanoDro-pND-2000檢測樣本濃度，利用Agilent bioanalyel 2100電泳檢測RNA完整性。樣品總RNA的濃度、純度如表1所示，本實(shí)驗(yàn)成功提取3例血漿總RNA，濃度及純度均達(dá)到后續(xù)芯片實(shí)驗(yàn)要求。

2.1.2 芯片實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果 芯片檢測結(jié)果顯示，單純高脂飲食實(shí)驗(yàn)組F-1與基礎(chǔ)飼料對照組C-1比對，篩選出差異顯著的miRNA共計(jì)185個(gè)，其中mmu-miR-335-3p、mmu-miR-5113、mmu-miR-3095-3p、mmu-let-7b-5p、mmu-let-7c-5p和mmu-miR-223-3p為上調(diào)，其余179個(gè)均為下調(diào)(詳細(xì)結(jié)果略)，提示高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠血漿miRNA表達(dá)譜發(fā)生改變。以給予TAK-242的T-1作為實(shí)驗(yàn)組，以C-1作為對照比對，篩選出差異顯著的miRNA共計(jì)171個(gè)，均為下調(diào)(詳細(xì)結(jié)果略)，表明已產(chǎn)生胰島素抵抗的高脂飲食小鼠，在給予TLR4抑制劑TAK-242 干預(yù)5個(gè)月后，血漿miRNA表達(dá)譜與基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)的對照組同樣出現(xiàn)差異。當(dāng)以T-1作為實(shí)驗(yàn)組，F(xiàn)-1作為對照組，篩選出差異顯著的miRNA共計(jì)13個(gè)，均為下調(diào)(表2，根據(jù)差異倍數(shù)降序排列)，由此可見，給予TLR4抑制劑TAK-242的高脂飲食組T-1與單純高脂飲食組F-1對比，有13個(gè)miRNA存在明顯差異，這些miRNA表達(dá)譜的改變可能與TAK-242的干預(yù)有關(guān)。將上述數(shù)據(jù)導(dǎo)入Mev 4.6得到聚類圖，其中綠色代表下調(diào)，紅色代表上調(diào)，如圖1所示。

表1 標(biāo)本RNA質(zhì)量評估結(jié)果

Tab.1 Results of sample RNA quality assessment

SampleConcentration(μg/μl)A260/280A260/230Volume(μl)Purity(μg)C?100159214010701T?100508759008704F?100395365005703

Note：C-1.Low fat diet；T-1.High fat diet with TAK-242；F-1.High fat diet without TAK-242.

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果 T-1與F-1差異表達(dá)倍數(shù)顯著的mmu-miR-3095-3p、mmu-miR-5113、mmu-miR-709和mmu-miR-335-3p均可在以TLR4為中心挖掘的互作蛋白質(zhì)或Toll樣受體信號通路中找到其作用的靶基因。故針對此4種miRNAs進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，采用U6作為內(nèi)參進(jìn)行歸一化。結(jié)果顯示，該4種miRNAs表達(dá)均下調(diào)，與芯片檢測結(jié)果一致，見圖2。

表2 HFD-T和HFD-C組血漿標(biāo)本差異表達(dá)的miRNAs(T-1 vs F-1)

Tab.2 Summary of miRNAs differential expressed in plasma samples with HFD-T and HFD-C(T-1 vs F-1)

miRNAs＿nameFoldchange(abs)RegulatedtrendAccessionNommu?miR?39603918404downMIMAT0019336mmu?miR?3095?3p20071172downMIMAT0014912mmu?miR?223?3p1744065downMIMAT0000665mmu?miR?511315781564downMIMAT0020621mmu?miR?70914738173downMIMAT0003499mmu?miR?636613585627downMIMAT0025110mmu?let?7c?5p13025131downMIMAT0000523mmu?let?7b?5p12563236downMIMAT0000522mmu?miR?3107?5p12104552downMIMAT0014943mmu?miR?335?3p10606154downMIMAT0004704mmu?miR?624326571746downMIMAT0024863mmu?miR?1224?5p24811573downMIMAT0005460mmu?miR?510920247705downMIMAT0020617

Note：Selection criteria is Fold change≥2.0 andP≤0.05.

2.3 差異表達(dá)的miRNAs的生物信息學(xué)分析

2.3.1 差異表達(dá)的miRNA靶基因預(yù)測 TLR4抑制劑TAK-242的應(yīng)用，影響了小鼠血漿miRNA的表達(dá)譜。為此，我們針對給予TAK-242的高脂飲食組(T-1)與單純高脂飲食組(F-1)差異表達(dá)的miRNA，以TLR4為中心尋找以TLR4信號通路上下游基因及TLR4互作蛋白基因?yàn)榘谢虻膍iRNA。

利用在線分析工具STRING(http://string.embl.de)，以TLR4為中心挖掘與其互作的蛋白質(zhì)，共發(fā)現(xiàn)有10種蛋白，分別為：Birc2、Birc3、Traf3、Traf6、Ticam1、Ly96、Myd88、Ube2n、Map3k7和Ikbkg。其中，Birc3、Traf3、Traf6、Map3k7和Ikbkg是mmu-miR-5113和mmu-miR-335-3p的靶基因，此兩種miRNA在TAK-242給予的高脂飲食組與單純高脂飲食組中差異表達(dá)倍數(shù)均在1 000以上(圖3)。

圖1 三組血漿標(biāo)本差異表達(dá)miRNAs的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of expressed miRNAs in 3 plasma samplesNote:Columns represent samples and rows represent miRNAs(black,green and red correspond to unchanged,down-regulated and upregulated,respectively).A.Left panel stands for LFD sample;right panel stands for HFD-C sample；B.Left panel stands for LFD sample;right panel stands for HFD-T sample；C.Left panel stands for HFD-C sample;right panel stands for HFD-T sample.

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證miRNAs芯片結(jié)果(n=15)Fig.2 Validation of miRNAs microarray data via qRT-PCR(n=15)Note:The relative expression value of miR-3095-3p,miR-5113,miR-709 and miR-335-3p were normalized to U6 RNA level.*.P<0.01 vs HFD-C group.

利用KEGG在線分析工具，以TLR4(K0160)查找其所在的Toll樣受體信號通路，其中T-1與F-1差異表達(dá)的微小RNA，mmu-miR-3095-3p、mmu-miR-5113、mmu-miR-709和mmu-miR-335-3p作用的靶基因見表3。

由此可見，T-1與F-1差異倍數(shù)較為顯著的mmu-miR-3095-3p、mmu-miR-5113、mmu-miR-709和mmu-miR-335-3p可在以TLR4為中心挖掘的互作蛋白質(zhì)基因或Toll樣受體信號通路中找到其作用的靶基因。TAK-242作為TLR4的抑制劑，可以影響以TLR4信號通路上下游基因及TLR4互作蛋白基因?yàn)榘谢虻膍iRNA差異表達(dá)。

2.3.2 預(yù)測靶基因的功能及分析 對F-1與C-1、T-1與C-1、T-1與F-1差異miRNA預(yù)測的靶基因分別進(jìn)行GO和KEGG富集分析，判定差異miRNA主要影響的生物學(xué)功能或者通路。

基因本體(Gene ontology，GO)是一個(gè)在生物信息學(xué)領(lǐng)域中廣泛使用的本體，分為生物過程(Biological process)，細(xì)胞組分(Cellular component)和分子功能(Molecular function)三個(gè)組分。GO分析結(jié)果表明，F(xiàn)-1與C-1差異miRNA預(yù)測的靶基因?qū)儆谏镞^程中的共計(jì)11 325個(gè)，屬于細(xì)胞組分的共計(jì)12 865個(gè)，屬于分子功能的共計(jì)11 624個(gè)。T-1與C-1差異miRNA預(yù)測的靶基因?qū)儆谏镞^程中的共計(jì)11 234個(gè)，屬于細(xì)胞組分的共計(jì)12 758個(gè)，屬于分子功能的共計(jì)11 526個(gè)。T-1與F-1差異miRNA預(yù)測的靶基因?qū)儆谏镞^程中的共計(jì)53 515個(gè)，屬于細(xì)胞組分的共計(jì)6 066個(gè)，屬于分子功能的共計(jì)5 515個(gè)。

圖3 與TLR4相互作用的分子信號通路網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Molecular signal-pathway networks interacted with TLR4Note:The main framework of this pathway network include of Birc2,Birc3,Traf3,Traf6,Ticam1,Ly96,Myd88,Ube2n,Map3k7 and Ikbkg.Birc3,Traf3,Traf6,Map3k7 and Ikbkg were regulated by mmu-miR-5113 and/or mmu-miR-335-3p.

KEGG又稱京都基因與基因組百科全書，是用于基因組破譯方面的數(shù)據(jù)庫。應(yīng)用KEGG分析使細(xì)胞和有機(jī)體能夠在計(jì)算機(jī)上完整的表達(dá)和演繹，并讓計(jì)算機(jī)利用基因信息對更高層次和更復(fù)雜細(xì)胞活動(dòng)和生物體行為做出計(jì)算推測。KEGG富集分析顯示F-1與C-1差異miRNA預(yù)測的靶基因的信號通路共計(jì)4 858個(gè)，T-1與C-1差異miRNA預(yù)測的靶基因的信號通路共計(jì)4 827個(gè)，T-1與F-1差異miRNA預(yù)測的靶基因的信號通路共計(jì)2 282個(gè)。見表4，將T-1與F-1差異表達(dá)的miRNA：mmu-miR-5113和mmu-miR-335-3p的靶基因Birc3、Traf3、Traf6、Map3k7和Ikbkg，以及表3中T-1與F-1差異倍數(shù)較為顯著的mmu-miR-3095-3p、mmu-miR-5113、mmu-miR-709和mmu-miR-335-3p在Toll樣受體信號通路中找到的靶基因進(jìn)行GO和KEGG分類，發(fā)現(xiàn)74%屬于生物過程基因(其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子占82%)。

表3 在Toll樣受體信號通路中差異表達(dá)的miRNAs的靶基因(F-1 vs T-1)

Tab.3 Targeted genes of expressed miRNAs in Toll like receptor signaling pathways(F-1 vs T-1)

SystematicnameFoldchange(abs)Targetgenesmmu?miR?3095?3p20071172OPNAB2mmu?miR?511315781564TOLLIPTRAMIRAK4AKTTRAF3STAT1TAB2mmu?miR?70914738173Rac1TOLLIPCD14TLR5IRAK1FADDAKTIRF3STAT1mmu?miR?335?3p10606154CD14TIRAPTRAMTLR5IRAK1TBK1OPNCASP8

表4 靶基因的GO分析

Tab.4 Gene ontology analysis of targeted genes

TargetgenesInputsymbolBirc3BiologicalprocessApoptosisTraf3BiologicalprocessTransportTraf6CellularcomponentCytosolMap3k7BiologicalprocessRegulationoftranscription，DNA?dependentIkbkgBiologicalprocessRegulationoftranscription，DNA?dependentOPNBiologicalprocessRegulationoftranscription，DNA?dependentAB2BiologicalprocessRegulationoftranscription，DNA?dependentTOLLIPBiologicalprocessRegulationoftranscription，DNA?dependentTRAMCellularcomponentIntracellularIRAK4BiologicalprocessRegulationoftranscription，DNA?dependentAKTBiologicalprocessRegulationoftranscription，DNA?dependentTRAF3BiologicalprocessRegulationoftranscription，DNA?dependentSTAT1BiologicalprocessRegulationoftranscription，DNA?dependentTAB2MolecularfunctionMetalionbindingRac1CellularcomponentMembraneCD14CellularcomponentIntracellularTLR5BiologicalprocessRegulationoftranscription，DNA?dependentIRAK1BiologicalprocessRegulationoftranscription，DNA?dependentIRF3BiologicalprocessApoptosisCASP8BiologicalprocessRegulationoftranscription，DNA?dependentTIRAPBiologicalprocessRegulationoftranscription，DNA?dependentTBK1CellularcomponentDefenseresponsetovirusFADDBiologicalprocessRegulationoftranscription，DNA?dependent

3 討論

肥胖相關(guān)的2型糖尿病和心腦血管疾病的迅速攀升已成為最嚴(yán)重的世界健康問題之一，而毋庸置疑，肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗是導(dǎo)致許多有害代謝異常的重要環(huán)節(jié)，但其潛在的分子機(jī)制尚不清楚。一個(gè)可能的機(jī)制是肥胖與炎癥應(yīng)答提高有關(guān)，炎癥加劇了胰島素抵抗，此過程與天然免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化密切相關(guān)[3]。

近十余年，關(guān)于天然免疫系統(tǒng)的研究最主要的進(jìn)展之一，就是一組高度保守的受體——Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)的發(fā)現(xiàn)。TLR4是TLRs家族的一個(gè)成員，通過活化前炎癥事件的級聯(lián)信號，起始對病原生物的應(yīng)答。脂多糖(Lipopolysacch-aride,LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜成分，為TLR4的有效配體。當(dāng)配體結(jié)合了TLR4和其共同受體CD14和MD-2，通過接合分子TIRAP、MyD88、IRAK和TRAF6的級聯(lián)，活化MAPKs和NF-κB信號通路[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，TLR4信號通路與胰島素抵抗存在諸多聯(lián)系，TLR4與下游信號MAPKs和NF-κB在胰島素抵抗過程中發(fā)揮著重要作用。來源于營養(yǎng)和代謝的LPS(代謝性內(nèi)毒素血癥)以及飽和的非酯化脂肪酸(Non-esterified fatty acid,NEFA)均可活化TLR4[11-13]。

為了探討肥胖相關(guān)的胰島素抵抗作用機(jī)制，首先建立了高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠模型。接著給予胰島素抵抗小鼠TLR4特異性抑制劑TAK-242進(jìn)行干預(yù)。前期結(jié)果提示，出現(xiàn)胰島素抵抗的小鼠，在給予TLR4抑制劑5個(gè)月后，TLR4蛋白的表達(dá)部分受到抑制，使之對葡萄糖的調(diào)節(jié)能力和對胰島素的敏感性均有所改善，提示TAK-242部分改善了高脂導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，抑制TLR4有利于提高胰島素的敏感性，改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)(論文待發(fā)表)。

受體是信號通路的重要門戶，因此受體的調(diào)節(jié)對其信號通路至關(guān)重要。已知miRNAs是一類內(nèi)源性的、非編碼的短鏈RNA分子，其通過與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region,3′UTR)結(jié)合抑制靶基因的翻譯表達(dá)，在多種生理過程中執(zhí)行著重要的調(diào)控作用[14]。來自肥胖相關(guān)的2型糖尿病的激素敏感組織(肝臟、肌肉、脂肪組織)的研究，揭示有幾種miRNA表達(dá)的改變，推測miRNA在相關(guān)疾病中發(fā)揮著重要作用[15,16]。有研究發(fā)現(xiàn)miRlet-7家族可以負(fù)性調(diào)控TLR4，當(dāng)miRlet-7i過表達(dá)時(shí)，TLR4表達(dá)則減少[17,18]。此外，在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TLR4是let-7e的靶基因，let-7e高表達(dá)可以明顯降低TLR4水平；當(dāng)TLR4 mRNA的3′UTR區(qū)與let-7e結(jié)合部位的基因序列發(fā)生突變時(shí)，這種負(fù)性調(diào)控就會(huì)消除[19]。最近研究發(fā)現(xiàn)，外周血中也能檢測到miRNAs，而且發(fā)現(xiàn)許多疾病患者血漿中都有其特征性的miRNAs表達(dá)譜[20]。那么，高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗時(shí)，血漿miRNAs表達(dá)譜是否發(fā)生改變、此改變是否與TLR4信號相關(guān)呢？

microRNA基因芯片篩查結(jié)果顯示，單純高脂飲食組與正常飲食組比對，篩選出差異顯著的miRNAs共計(jì) 185種，其中6種miRNAs表達(dá)上調(diào)，179種miRANs表達(dá)下調(diào)，說明高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠血漿miRNA表達(dá)譜發(fā)生改變。給予TLR4抑制劑的高脂飲食組與正常飲食組比對，篩選出差異顯著的miRANs 共計(jì)171種，均表達(dá)下調(diào)，表明已產(chǎn)生胰島素抵抗的高脂飲食小鼠，在給予TLR4抑制劑TAK-242后，血漿miRNA表達(dá)譜與正常飲食組也存在差異。當(dāng)給予TAK-242的高脂飲食組與單純高脂飲食組比對，篩選出差異表達(dá)的miRNAs共計(jì)13種，均為下調(diào)，說明此13種miRNAs表達(dá)的改變可能與TLR4蛋白表達(dá)的部分抑制有關(guān)。

進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，以TLR4為中心挖掘與其互作的蛋白質(zhì)，共發(fā)現(xiàn)有10種蛋白；在TAK-242給予的高脂飲食組與單純高脂飲食組中差異表達(dá)倍數(shù)均在1 000以上的4種miRNAs (mmu-miR-3095-3p、mmu-miR-5113、mmu-miR-709、mmu-miR-335-3p)，可在TLR4的互作蛋白質(zhì)或Toll樣受體信號通路中找到其作用的靶基因。將這些靶基因進(jìn)行功能富集分析和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析(GO和KEGG分類)，發(fā)現(xiàn)74%屬于生物過程基因，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子占82%。提示TAK-242作為TLR4的抑制劑，可以影響以TLR4信號通路上下游基因及TLR4互作蛋白基因?yàn)榘谢虻膍iRNA差異表達(dá)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，hsa-miR-335在胃癌復(fù)發(fā)患者血漿中表達(dá)升高[21]；mmu-miR-709可能參與了人胚腎細(xì)胞的凋亡[22]和脂肪細(xì)胞的分化[23]；mmu-miR-5113在與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)的極化巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)[24]。目前關(guān)于mmu-miR-3095-3p、mmu-miR-5113、mmu-miR-709和mmu-miR-335-3p在胰島素抵抗中的作用，以及與TLR4信號通路的相關(guān)性未見報(bào)道。進(jìn)一步課題組將在不同標(biāo)本中驗(yàn)證這4種差異表達(dá)miRNAs，并對其進(jìn)行深入的功能分析，確定這些差異表達(dá)的miRNA在TLR4信號通路中的作用及在胰島素抵抗中扮演的角色。

綜上，胰島素抵抗發(fā)生時(shí)，血漿miRNAs表達(dá)譜存在改變，此變化與TLR4及其信號通路相關(guān)。該研究結(jié)果豐富了胰島素抵抗發(fā)生的機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究TLR4、miRNAs在胰島素抵抗中的作用、及為尋找胰島素抵抗血漿miRNAs診斷標(biāo)志物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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[收稿2016-05-23]

(編輯 張曉舟)

Plasma microRNA expression profile in mice with high fat diet-induced insulin resistance and its relationship with TLR4

MA Ke,ZHU Xiao-Bo,XU Zhi-Wei,CHANG Xiao-Tong.

Key Laboratory of Clinical Diagnostics,Hebei North University,Zhangjiakou 075000,China

Objective:To screen the plasma microRNAs(miRNAs)of differential expression in a high fat diet-induced insulin resistance in mouse models;further investigations on the mice with insulin resistance treated by TLR4 inhibitors TAK-242,and to study the changes of plasma miRNAs expression profile and the relationship among TLR4,miRNAs and high fat diet-induced insulin resistance.Methods:The plasma samples were from 3 mouse groups of previous study,namely,the control group with general basic diet(low fat diet,LFD),TLR4 inhibitors TAK-242 treatment group with a high fat diet (HFD-T) and the high fat diet control group(HFD-C).The differential expressed miRNAs was screened by expression profiling of plasma miRNAs,which was detected using mouse miRNA microarray.The quantitative Real-Time PCR(qRT-PCR) was used to verify the results of microarray.The target genes of differential expressed miRNAs were predicted in TLR4 signaling pathway using bioinformatics methods,and the GO and KEGG database molecular annotation system were used to investigate the main effects of the miRNAs targeted genes on the biological functions or signal pathway.Results:The screening results of miRNA microarray chip showed that,comparing miRNAs expression between HFD group and LFD control group,185 miRNAs were significant in the high fat diet group,including 6 up-regulated and 179 down-regulated miRANs.A significant difference of miRANs was also found between HFD-T group and LFD control group,the total number of differential expression miRNAs was 171,and all of them were down-regulated.Comparing miRNAs expression between HFD-C group and HFD-T group,13 miRNAs were significant in HFD-T group,all of them were down-regulated.Bioinformatics analysis results showed that a total of 10 interaction proteins with TLR4 were predicted;the difference of mmu-miR-3095-3p,mmu-miR-5113,mmu-miR-709 and mmu-miR-335-3p expression levels was more than 1 000 times between HFD-C group and HFD-T group,and their target genes can be found in TLR4-interaction protein or Toll like receptor signaling pathway;GO and KEGG analysis showed 74% of these target genes belonged to the biological processes genes,and the transcription factors accounted for 82%.The expression of mmu-miR-3095-3p,mmu-miR-5113,mmu-miR-709 and mmu-miR-335-3p detected by qRT-PCR exhibited the similar patterns of down regulation to those shown in microarray results.Conclusion:When insulin resistance occurs,there is a change in plasma miRNAs expression profile,this change is associated with TLR4 and its signaling pathways.The finding enrichs the possible mechanisms of insulin resistance and provides a basis for finding miRNAs diagnostic markers for early diagnosis of insulin resistance.

High fat diet;Insulin resistance;Toll like receptor 4;miRNAs expression profile

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.004

①本文為河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(C2011405015)和河北北方學(xué)院創(chuàng)新人才培育項(xiàng)目(CXRC1316)。

馬 科(1977年-)，男，碩士，主要從事脂代謝障礙相關(guān)疾病的分子機(jī)制與臨床應(yīng)用方面的研究。

及指導(dǎo)教師：常曉彤(1968年-)，女，碩士，教授，主要從事內(nèi)分泌的分子免疫學(xué)研究，E-mail:changxt1212@vip.sina.com。

R392.11

A

1000-484X(2016)12-1745-08

②河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，張家口075000。