LPS刺激誘導(dǎo)大鼠原代枯否細(xì)胞基因表達(dá)譜變化分析①

談志麗 朱 彤 涂文娟 劉亮明

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬上海松江中心醫(yī)院感染科,上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院松江分院感染科,上海201600)

LPS刺激誘導(dǎo)大鼠原代枯否細(xì)胞基因表達(dá)譜變化分析①

談志麗 朱 彤 涂文娟 劉亮明

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬上海松江中心醫(yī)院感染科,上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院松江分院感染科,上海201600)

目的：研究脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激原代大鼠枯否細(xì)胞(Kupffer cell，KC)基因表達(dá)譜的變化情況。方法：膠原酶灌注消化和不連續(xù)密度梯度離心分離培養(yǎng)大鼠原代肝臟KC，采用LPS刺激細(xì)胞。OneArray基因表達(dá)譜芯片檢測LPS刺激后，細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)譜的變化。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對表達(dá)上調(diào)最顯著的基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：基因芯片結(jié)果顯示LPS刺激后，原代KC內(nèi)基因表達(dá)譜發(fā)生了明顯變化。與正常對照組相比，LPS刺激組基因表達(dá)上調(diào)27個(gè)(包括Ces1f、Slc17a3、Slc21a4、Hsd17b2、Sorbs2、Ccdc116、Mgam、Myo5b、Etl4、Fabp1、Kif4b、Fosl1、Cyp4a1、Penk、Tmem221、Rpl5、Nr2f1、Hoxb1、Gpr165、Fam90a13p、Kpna6、Irak1bp1、Kcnh1和4個(gè)尚未命名基因)，表達(dá)下調(diào)4個(gè)(包括Oc90、Tagln、Arxes2和Olr830)。其中Ces1f為上調(diào)最顯著的基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，LPS刺激誘導(dǎo)KC對Ces1f基因表達(dá)水平上調(diào)達(dá)23.88倍。結(jié)論：LPS刺激可誘導(dǎo)大鼠原代KC基因表達(dá)譜發(fā)生變化。其中，Ces1f基因的上調(diào)表達(dá)最為顯著。

原代枯否細(xì)胞；脂多糖；基因表達(dá)譜；芯片分析；大鼠

枯否細(xì)胞(Kupffer cell， KC)是位于肝內(nèi)的組織巨噬細(xì)胞，具有變形和吞噬的功能，是肝臟固有免疫系統(tǒng)的重要成分[1-3]。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的重要化學(xué)組分，又稱為細(xì)菌內(nèi)毒素，由O-側(cè)鏈、核心寡糖和脂質(zhì)A組成，能夠通過CD14分子和Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)激活機(jī)體固有免疫系統(tǒng)并引發(fā)強(qiáng)效的促炎癥反應(yīng)[4]。在LPS的刺激下，KC激活并表達(dá)CD14分子和TLR4，刺激信號進(jìn)一步通過激活接頭蛋白MyD88啟動下游p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)和核因子-кB(Nuclear factor-κB，NF-κB)，從而啟動炎性信號通路，促進(jìn)前炎細(xì)胞因子的釋放[5]。但是LPS刺激誘導(dǎo)KC活化的機(jī)制和活化后基因的表達(dá)情況尚不清楚。為此，在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用LPS刺激大鼠原代KC，利用OneArray芯片分析了其基因表達(dá)譜的變化，并對上調(diào)最明顯的基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR加以驗(yàn)證，以進(jìn)一步了解LPS刺激對KC基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性SD大鼠，清潔級，體重220～250 g，由上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供[SYXK(滬)2009-0086]。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，實(shí)驗(yàn)動物的使用符合國家動物保護(hù)法。

1.1.2 主要試劑和耗材 Ⅳ型膠原酶、1640培養(yǎng)液和胎牛血清(美國Gibco公司)；Percoll細(xì)胞分離液(瑞典GE Healthcare公司)；青鏈霉素混合液(德國Hyclone公司)；脂多糖(美國Sigma公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR相關(guān)試劑(美國Thermo公司)；RNA擴(kuò)增試劑盒、OneArray芯片、前雜交液、熒光標(biāo)記雜交試劑盒、清洗液(華聯(lián)生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠原代肝臟KC的分離培養(yǎng) 大鼠原代KC的分離采用Ⅳ型膠原酶灌注及Percoll密度梯度離心法，具體步驟參照文獻(xiàn)[6]。細(xì)胞獲得后加入1640培養(yǎng)液(10% 胎牛血清，鏈霉素1 000 U/L，青霉素1 000 U/L)、置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 h，用1×PBS洗去未貼壁細(xì)胞，即可得到純化的KC。細(xì)胞活力采用臺盼藍(lán)染色，細(xì)胞鑒定采用墨汁吞噬和CD163染色分析(細(xì)胞活力達(dá)95%、純度達(dá)90%時(shí)用于下一步實(shí)驗(yàn))。

1.2.2 細(xì)胞的分組與處理 細(xì)胞接種于6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)4×106個(gè)。培養(yǎng)24 h待其穩(wěn)定貼壁后，將細(xì)胞隨機(jī)分成兩組，即正常對照組和LPS刺激組。純1640培養(yǎng)液500 μl分別加入每孔細(xì)胞中，LPS刺激組予以終濃度20 μg/ml的LPS刺激[7,8]，正常對照組加入同等體積的1×PBS。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 總RNA的提取 采用Trizol試劑，具體操作按照說明書進(jìn)行。抽提得到的RNA采用OD260/280吸光度比值及瓊脂糖凝膠電泳鑒定其純度及完整性，并測定所得RNA的濃度。

1.2.4 RNA樣品熒光標(biāo)記反應(yīng) RNA質(zhì)量檢測合格后，將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA，接著再加入RNase和DNA Polymerase以合成第二鏈cDNA；隨后，以T7啟動子完成反義鏈RNA合成(antisense RNA， aRNA)，過程中加入Amino Allyl UTP [ 5-(3-aminoallyl)-UTP，aa-UTP]，形成 Amino Allyl-aRNA (aa-aRNA)，再加入NHS-CyeDye。NHS 與 Amino Allyl結(jié)合后，使aa-aRNA 變成 CyeDye-aRNA 完成熒光標(biāo)記。

1.2.5 Phalanx OneArray芯片預(yù)雜交 芯片預(yù)加熱至60℃，置入100 %乙醇中，孵育約15 s，震蕩20 s。用去離子水徹底沖洗，去除殘留的乙醇。將芯片完全浸入預(yù)雜交溶液并靜置2 h。純水清洗后，置于干燥黑暗處，完成預(yù)雜交處理。

1.2.6 OneArray芯片雜交 預(yù)雜交的芯片與空白芯片對夾，套上熱縮膜置于熱水中完成熱縮后，置于50℃烘箱中。將預(yù)熱溶解的NewOA Hyb Buffer緩慢加入已完成熒光標(biāo)記的RNA樣品中，配置成aRNA混合液。將混合液加入芯片切口處，套第二層熱縮膜并完成第二次熱縮，置于50℃雜交烘箱旋轉(zhuǎn)架上(2 r/min、16 h)。于42℃清洗液中小心拆開芯片，多次清洗后甩干，置于黑色芯片盒中，準(zhǔn)備掃描。

1.2.7 影像掃描和數(shù)據(jù)分析 Agilent Microarray Scanner (G2505C)掃描儀進(jìn)行掃描，藉由掃描儀XDR功能使用PMT 100% 與 10% 以 10 μm的分辨率進(jìn)行兩次掃描。再利用GenePixTM4進(jìn)行影像數(shù)據(jù)獲取，獲得兩份初級數(shù)據(jù)，最后利用華聯(lián)芯片內(nèi)置控制探針對兩份數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，整合完成的數(shù)據(jù)采用Rosetta Resolver?System (Rosetta Biosoftw-are)進(jìn)行分析處理，按照log2(對照組/刺激組)絕對值≥1且P值<0.05選取差異基因。并在R 3.03版本環(huán)境下，進(jìn)行差異基因分析。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物的設(shè)計(jì)與合成由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。目的基因和內(nèi)參引物序列見表 1。RNA作為模板用于第一鏈cDNA的合成，具體流程按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系(50 μl)的建立：Maxima SYBR Green qPCR Master mix(×2) 25 μl、PCR Sense Primer(10 μmol/L)1.0 μl、PCR Antisense Primer(10 μmol/L) 1.0 μl、cDNA模板4.0 μl、ROX solution 0.1 μl，加無核酸酶水至50 μl。兩步法進(jìn)行擴(kuò)增，第一步：50℃，2 min，1個(gè)循環(huán)；第二步：95℃，10 min，1個(gè)循環(huán)；95℃，15 s，40個(gè)循環(huán)；60℃，60 s，40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。反應(yīng)結(jié)束后，保存PCR擴(kuò)增曲線、熔解曲線和相對應(yīng)的CT值，采用2-ΔΔCT方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行相對定量分析。

表1 基因擴(kuò)增引物序列和產(chǎn)物長度

Tab.1 Primer sequences and product length of gene amplification

GenePrimersequences5′→3′Productlength(bp)Ces1fSenseprimerTTTGCACTGCCTACCAGAGTC128AntisenseprimerGGTGGTGAAGAGGGGTTTCCGAPDHSenseprimerGACATGCCGCCTGGAGAAAC244AntisenseprimerGTCCACCACCCTGTTGCTGTAG

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 基因芯片分析每組采用5個(gè)樣本，其余所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作6次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理和分析采用SPSS16.0，計(jì)算各組2-ΔΔCT均值和標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)分析采用成組t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠原代肝臟KC顯微鏡下表現(xiàn) KC初分離時(shí)鏡下呈折光性很強(qiáng)的圓球形(圖1A)；培養(yǎng)3 h后KC呈扁圓形，并已牢固貼壁；24 h后KC充分舒展，大小一致，但形態(tài)不規(guī)則，可呈對角形、星形等(圖1B)。

2.2 RNA質(zhì)檢結(jié)果 采用 Agilent 2100 Bioanalyzer分析儀分析，正常對照組與LPS刺激組 RNA OD260/280均大于1.8，RIN 值均大于6.0，凝膠電泳顯示 28S 和 18S 兩條主帶(圖 2)，符合基因表達(dá)譜芯片試驗(yàn)要求。

2.3 基因芯片分析結(jié)果 運(yùn)用OneArray基因芯片對KC基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，根據(jù)正常對照組與LPS刺激組兩組間基因表達(dá)水平t檢驗(yàn)的結(jié)果，按照log2(對照組/刺激組)絕對值≥1且P值<0.05的條件篩選差異表達(dá)的基因。結(jié)果顯示，LPS刺激組與正常對照組細(xì)胞相比，存在差異性表達(dá)的基因共31個(gè)。基因芯片差異性表達(dá)火山圖見圖3。其中，表達(dá)上調(diào)的基因數(shù)共27個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因有4個(gè)(見表2)。將以上差異表達(dá)基因運(yùn)用Cluster 3.0進(jìn)行聚類分析，數(shù)據(jù)導(dǎo)入Treeview 1.1.6.0得到分層聚類圖(圖4)。

圖1 大鼠原代KC顯微鏡下表現(xiàn)Fig.1 Performance of rat primary Kupffer cells und-er microscopeNote:A.Performance of primary Kupffer cells at the beginning of separation (×100)；B.Performance of primary Kupffer cells at 24 h after culture(×200).

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解和擴(kuò)增曲線 對表達(dá)上調(diào)最顯著的Ces1f基因采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR加以驗(yàn)證。Ces1f和GAPDH熔解曲線呈單一明顯的高峰(圖5A、B)，說明在熒光定量PCR過程中沒有產(chǎn)生引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，引物特異性良好。擴(kuò)增曲線示Ces1f擴(kuò)增時(shí)Tm值為81.4， GAPDH擴(kuò)增時(shí)Tm值為82.2(圖5C、D)。曲線平行性好，間距均一，說明目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率基本一致，可以采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行相對定量分析。

圖2 總RNA 凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of total RNANote:1.Control；2.LPS.

圖3 兩組KC基因差異性表達(dá)火山圖Fig.3 Volcano plot of differential expression profile of KC genes between two groupsNote:A.Control；B.LPS.The horizontal axis represents the fold difference of gene expression between the two groups, the vertical axis represents the P values between the two groups.The left and right upper quadrant were up-regulated and down-regulated genes respectively.

表2 兩組細(xì)胞間存在差異性表達(dá)的基因和其GO生物學(xué)功能分類

Tab.2 Differentially expression genes and GO functions

ProbeIDGenesymbolGenenamelog2(A/B)Up/downGeneannotationPH＿rn＿0024110Ces1fcarboxylesterase1F-162UpcarboxylicesterhydrolaseactivityPH＿rn＿0004789NANA-154UpunknowmPH＿rn＿0003617Hsd17b2hydroxysteroid(17?beta)dehydrogenase2-151Up17beta?HydroxysteroiddehydrogenasePH＿rn＿0008170Slc17a3solutecarrierfamily17(sodiumphosphate)，member3-143UpNa/PicotransporterPH＿rn＿0005271Sorbs2sorbinandSH3domaincontaining2-140UpmyosinPH＿rn＿0003658Ccdc116coiled?coildomaincontaining116-130UpglucosemetabolismPH＿rn＿0005666Mgammaltase?glucoamylase-126Upα?1，4?glucosidaseactivity；amylaseactivityPH＿rn＿0011466Myo5bmyosinVb-126UpcytoskeletonPH＿rn＿0002744Slc21a4kidneyspecificorganicaniontransporter-125UpNa/PicotransporterPH＿rn＿0019812Etl4enhancertraplocus4-124UpbindingproteinPH＿rn＿0004655Fabp1fattyacidbindingprotein1，liver-123Uplong?chainfattyacidtransportPH＿rn＿0023819Kif4bkinesinfamilymember4B-121UpkinesinfamilymemberPH＿rn＿0002892Fosl1fos?likeantigen1-118UptranscriptionfactorPH＿rn＿0020638Cyp4a1cytochromeP450，family4，subfamilya，polypeptide1-115UpdrugmetabolismPH＿rn＿0004856Penkproenkephalin-114UpProenkephalingenePH＿rn＿0020260NANA-113UpunknownPH＿rn＿0016056Tmem221transmembraneprotein221-112UptransmembraneproteinPH＿rn＿0003446Rpl5ribosomalproteinL5-108UpribosomalproteinPH＿rn＿0020890NANA-107UpunknownPH＿rn＿0022728Nr2f1nuclearreceptorsubfamily2，groupF，member1-107UptranscriptionfactorPH＿rn＿0021477Hoxb1homeoboxB1-107UphomeoboxgenePH＿rn＿0000353Gpr165Gprotein?coupledreceptor165-106UpGprotein?coupledreceptorPH＿rn＿0020238Fam90a13prCG43168?like，familywithsequencesimilarity90，memberA13，pseudogene?104UppseudogenePH＿rn＿0020940Kpna6karyopherinalpha6(importinalpha7)-103UpproteintransporteractivityPH＿rn＿0010316Irak1bp1interleukin?1receptor?associatedkinase1bindingprotein1-102UpIrak1bindingproteinPH＿rn＿0023466NANA-101UpunknownPH＿rn＿0011154Kcnh1potassiumvoltage?gatedchannel，subfamilyH(eag?related)，member1-100Uppotassiumvoltage?gatedchannelPH＿rn＿0009308Oc90otoconin90455DownotoconinPH＿rn＿0010980Taglntransgelin142DowntransgelinPH＿rn＿0016953Arxes2adipocyte?relatedX?chromosomeexpressedsequence2128DownlipidsynthesisPH＿rn＿0005712Olr830olfactoryreceptor830102Downolfactoryreceptor

圖4 基因差異性表達(dá)的分層聚類圖Fig.4 Hierarchical cluster diagram of differential expression profile of genesNote:A.Control；B.LPS.

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解和擴(kuò)增曲線Fig.5 Melting curve and amplification curve of genes Note:A.Melting curve of Ces1f;B.Melting curve of GAPDH; C.Amplification curve of Ces1f；D.Amplification curve of GAPDH.

圖6 原代KC Ces1f基因表達(dá)情況Fig.6 Expression of Ces1f at mRNA between normal and LPS-stimulated Kuffer cellsNote:*.P<0.01 vs control.

2.5 兩組細(xì)胞Ces1f基因表達(dá)情況 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，Ces1f基因的表達(dá)水平分別為正常對照組細(xì)胞1.00±0.00、LPS刺激組細(xì)胞23.88±6.04。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組間存在顯著性差異(P<0.01)，見圖6。

3 討論

KC是肝內(nèi)重要的固有免疫細(xì)胞，能夠有效清除外來病原體和其毒性產(chǎn)物，發(fā)揮免疫防御的功能。同時(shí)KC的激活，常伴隨著大量促(或前)炎因子的產(chǎn)生和釋放，造成肝組織的炎癥損傷[9]。KC激活和其前炎因子釋放所介導(dǎo)的肝臟損傷是酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝和急性肝衰竭發(fā)生發(fā)展過程中的重要事件，并且在這些過程中，LPS都是關(guān)鍵的始動因素[10,11]。LPS通過與KC表面的TLR4受體結(jié)合，啟動MyD88依賴和TRIF依賴的信號通路[12]，誘導(dǎo)促炎因子釋放，從而發(fā)揮免疫防御作用和炎性損傷效應(yīng)。

為進(jìn)一步了解LPS刺激對KC的影響，在本研究中，我們采用基因芯片分析了LPS刺激誘導(dǎo)大鼠原代KC內(nèi)基因表達(dá)譜的變化。我們的芯片分析結(jié)果顯示，LPS刺激誘導(dǎo)了KC內(nèi)基因表達(dá)譜的明顯變化。與正常細(xì)胞相比較，LPS刺激KC共有27個(gè)基因表達(dá)明顯上調(diào)，主要有Ces1f、Slc17a3、Slc21a4、Hsd17b2、Sorbs2和Ccdc116等，其中尚有4個(gè)未命名且功能不詳?shù)幕颍涣硗?，LPS刺激后，表達(dá)下調(diào)的基因有4個(gè)，包括Arxes2、Olr830、Oc90和Tagln。通過基因GO生物學(xué)功能分析，我們發(fā)現(xiàn)，LPS刺激誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的基因主要有以下幾類：

3.1 外來化學(xué)物處理基因(Xenobiotic-processing gene， XPG) Ces1f、Slc17a3、Slc21a4、Cyp4a1、Kcnh1、Nr2f1和Kpna6。外來化學(xué)物(Xenobiotic)是指藥物和來自環(huán)境中的化學(xué)物如殺蟲劑和致癌物等。在機(jī)體內(nèi)，這些物質(zhì)主要由肝臟XPG的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行解毒和清除。肝臟的XPG有吸收(uptake)和排出(efflux)轉(zhuǎn)運(yùn)體(transporters)、Ⅰ期酶和Ⅱ期酶等。吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體負(fù)責(zé)將外來化學(xué)物從門脈血流中轉(zhuǎn)運(yùn)至肝內(nèi)以備代謝清除。在肝內(nèi)，這些化學(xué)物可被Ⅰ期酶氧化、還原或水解，并進(jìn)一步在Ⅱ期酶的作用下發(fā)生接合反應(yīng)。排出轉(zhuǎn)運(yùn)體則可將這些代謝產(chǎn)物排泌入膽道或血液中。其中，Ces1f和Cyp4a1屬于Ⅰ期酶。Ces1f有羧酸酯酶活性，能分解多種含羧酸酯鍵的藥物，如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、奧司他韋等[13-16]。近年也發(fā)現(xiàn)其可能存在去乙?；富钚?，使藥物去乙?；x失活[17]；Cyp4a1則是細(xì)胞色素P450家族成員，屬于單加氧酶系，主要參與機(jī)體大多數(shù)藥物的氧化代謝[18]。Slc17a3和Slc21a4是有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，均為鈉依賴性的轉(zhuǎn)運(yùn)體，在尿酸、甲氨喋呤等代謝產(chǎn)物和藥物代謝轉(zhuǎn)運(yùn)過程中有重要的作用[19，20]。Kcnh1為鉀門控性離子通道，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外鉀離子的濃度差[21]，可能參與鈉依賴性陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子Nr2f1的功能主要在于調(diào)控XPG活性包括激活Ⅰ期酶和促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白質(zhì)的翻譯，而Nr2f1的表達(dá)水平又受到Kpna6的調(diào)控[22]。

3.2 脂肪分解代謝相關(guān)基因 Fabp1和Hsd17b2。Fabp1主要位于肝細(xì)胞胞漿內(nèi)，是肝細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的結(jié)合蛋白，其功能在于通過將脂質(zhì)配體(長鏈脂肪酸/脂酰輔酶A)或葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核內(nèi)，來激活核受體PPARα，誘導(dǎo)脂肪酸β氧化相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)脂肪氧化分解和產(chǎn)能[23]。Hsd17b2是17β-羥基類固醇脫氫酶的異構(gòu)體，主要參與類固醇激素的生物合成[24]。研究顯示，肥胖者體內(nèi)類固醇激素代謝多異常，且脂肪組織中Hsd17b2表達(dá)下調(diào)[25]。因此，Hsd17b2的上調(diào)表達(dá)可能有助于促進(jìn)脂肪的分解代謝。

3.3 糖類代謝相關(guān)基因 Mgam和Ccdc116。其中，Mgam基因編碼麥芽糖酶，具有α糖苷酶活性，參與半乳糖、淀粉和蔗糖的分解代謝，生成葡萄糖[26]。Ccdc116的功能目前還不清楚，但近年發(fā)現(xiàn)其在胰島內(nèi)分泌細(xì)胞和胰腺內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增高[27]，提示其可能與糖類代謝有一定的關(guān)系。

3.4 細(xì)胞骨架和運(yùn)動相關(guān)基因 Sorbs2、Fosl1、Myo5b和Kif4b。Sorbs2是接頭蛋白家族成員，其功能在于調(diào)控細(xì)胞骨架組織(Cytoskeletal organization)和協(xié)助信號傳導(dǎo)。研究顯示，該蛋白水平增高有助于抑制細(xì)胞遷移和促進(jìn)細(xì)胞黏附[28，29]；Fosl1 是一個(gè)亮氨酸拉鏈蛋白，可通過抑制整合素αV、β3的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移[30]；Myo5b屬于肌球蛋白家族成員，主要參與極化上皮細(xì)胞頂膜的囊泡運(yùn)輸，能選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)Na/H交換蛋白3(Sodium/hydrogen exchanger 3，NHE3)和囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)[31]；Kif4b是一驅(qū)動蛋白家族成員，主要位于胞漿和細(xì)胞核中，與囊泡的順向運(yùn)輸有關(guān)[32]，可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種功能蛋白的胞內(nèi)運(yùn)輸[33]。

3.5 免疫炎癥相關(guān)基因 Irak1bp1、Etl4和Penk。Irak1bp1是抑炎基因，可抑制機(jī)體的固有免疫炎癥反應(yīng)[34，35]。已證實(shí)，Irak1bp1可促進(jìn)NF-κB p50亞基核轉(zhuǎn)位。在核內(nèi)，p50相互結(jié)合形成抑制性同源二聚體p50/p50 。p50/p50一方面與NF-κB p65亞基競爭炎癥基因的DNA結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而抑制這些炎癥基因的轉(zhuǎn)錄激活，另一方面還可以結(jié)合IL-10基因的DNA結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)抑制性細(xì)胞因子IL-10的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；Etl4可能參與了巨噬細(xì)胞的固有免疫反應(yīng)[36]；Penk是一種神經(jīng)肽類激素，對多種免疫細(xì)胞的活性有影響。例如，Penk可影響單核細(xì)胞的趨化功能、增強(qiáng)NK細(xì)胞和CTL 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用等，在內(nèi)毒素性休克發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制中起重要作用[37]。

3.6 其他基因 轉(zhuǎn)錄因子Hoxb1可調(diào)控組織細(xì)胞增殖分化[38]，Rpl5是核糖核蛋白的組成成分[39]，F(xiàn)am90a13p為假基因，G蛋白偶聯(lián)受體家族蛋白Gpr165和跨膜蛋白Tmem221的功能尚未明確。本次芯片分析還發(fā)現(xiàn)了4個(gè)未命名的基因表達(dá)上調(diào)。

此外，LPS刺激KC內(nèi)表達(dá)下調(diào)的基因共有4個(gè)，包括Arxes2、Olr830、Oc90和Tagln。Arxes2主要位于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，為脂類合成必需的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因。已證實(shí)其在細(xì)胞脂肪生成過程中表達(dá)水平明顯升高[40]；Olr830為G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，與嗅覺感知相關(guān)[41]，但在巨噬細(xì)胞中的功能尚不清楚；Oc90與分泌型磷脂酶A2二級結(jié)構(gòu)有25%～34%的氨基酸相似，含有兩個(gè)PLA2L樣結(jié)構(gòu)域，存在鈣離子結(jié)合功能[42]；Tagln又稱為SM22， 其主要功能在于調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞骨架重構(gòu)[43]。

因此，肝內(nèi)KC受LPS刺激激活后，增強(qiáng)了對外來化學(xué)物包括藥物的代謝和清除，促進(jìn)了脂肪的分解和糖代謝，增加了細(xì)胞骨架蛋白水平和細(xì)胞黏附能力，并對細(xì)胞的遷移能力和免疫炎癥效應(yīng)有調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)研究的完成，有助于加深對KC生物學(xué)功能的理解，加深對KC作為肝內(nèi)固有免疫細(xì)胞針對外來刺激特別是傷害性刺激產(chǎn)生反應(yīng)的了解，這為將來更加深入地闡明肝組織炎癥損傷的病理生理學(xué)機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。

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[收稿2016-03-29 修回2016-05-20]

(編輯 張曉舟)

Microarray analysis of differentially gene expression profile in LPS-stimulated primary Kupffer cells

TAN Zhi-Li，ZHU Tong，TU Wen-Juan，LIU Liang-Ming.

Department of Infection，Shanghai Songjiang Central Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Department of Infection,Songjiang Hospital Affiliated to First People′s Hospital of Shanghai Jiaotong University，Shanghai 201600，China

Objective:To investigate the changes of gene expression profile in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated primary Kupffer cells (KCs).Methods:Rat KCs were isolated and purified by means of in situ perfusion and density gradient centrifugation.After being identified by ink phagocytosis and ED2 staining test，KCs were stimulated with LPS.Gene expression profile were studied using gene microarrays，and the most significant upregulated gene was verified using real-time PCR.Results:27 genes were upregulated including Ces1f，Slc17a3，Slc21a4，Hsd17b2，Sorbs2，Ccdc116，Mgam，Myo5b，Etl4，F(xiàn)abp1，Kif4b，F(xiàn)osl1，Cyp4a1，Penk，Tmem221，Rpl5，Nr2f1，Hoxb1，Gpr165，F(xiàn)am90a13p，Kpna6，Irak1bp1，Kcnh1 and 4 unnamed genes and 4 downregulated including Oc90,Tagln,Arxes2 and Olr830 in LPS-stimulated KCs.Among the upregulated genes，Ces1f was the most significant upregulatory gene.Real-time PCR confirmed that the levels of Ces1f were 23.88 times higher in LPS-stimulated than control cells.Conclusion:There is a significant difference between LPS-stimulated and normal control cells in gene expression profile by microarray analysis，and Ces1f is the most significantly upregulated gene.

Primary Kupffer cells；LPS；Gene expression profile；Microarray analysis；Rat

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.002

①本文為國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81070357)。

談志麗(1990年-)，女，主要從事重癥肝病免疫機(jī)制研究，E-mail:lwfdtzl895@live.com。

及指導(dǎo)教師：劉亮明(1968年-)，男，醫(yī)學(xué)博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事肝臟病基礎(chǔ)和臨床研究，E-mail:liuliangming@Hotmail.com。

R575.3

A

1000-484X(2016)12-1734-07