外源一氧化氮(NO)對低溫脅迫下南瓜幼苗氧化損傷的保護效應(yīng)

吳旭紅，呂成敏，馮晶旻

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾市衛(wèi)生監(jiān)督所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

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外源一氧化氮(NO)對低溫脅迫下南瓜幼苗氧化損傷的保護效應(yīng)

吳旭紅1*，呂成敏1，馮晶旻2

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾市衛(wèi)生監(jiān)督所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

探討外源 NO 供體硝普鈉(SNP)對冷害脅迫下南瓜生長和氧化損傷的內(nèi)在機制。以南瓜銀輝2號和青栗為材料，通過室內(nèi)人工模擬低溫逆境的方法，研究 SNP(100 μmol/L)對冷害脅迫下南瓜幼苗生長、葉綠體色素含量、有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及活性氧代謝的影響。結(jié)果表明，冷害導(dǎo)致南瓜幼苗活性氧積累增加，膜質(zhì)過氧化加劇，光合色素含量下降，滲透調(diào)節(jié)能力降低，從而顯著抑制南瓜幼苗的生長；正常生長條件下， SNP顯著提高了超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性，顯著增加幼苗地上和地下部干重及谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫(H2O2)、類胡蘿卜素和氨基酸總量；8 ℃/5 ℃(晝/夜)的低溫脅迫下，葉面噴施外源100 μmol/L NO供體硝普鈉(SNP)，促進了植株生長和干物質(zhì)積累，顯著提高了葉片SOD、POD、APX 和GR的活性以及Pro和可溶性糖含量，減少了H2O2和膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的積累；外源NO明顯提高了南瓜葉片葉綠素、類胡蘿卜素含量、抗壞血酸(ASA)、GSH和可溶性蛋白及氨基酸總量。低溫脅迫下，外源NO通過促進抗氧化酶活性、抗氧化劑及有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的提高，降低H2O2和MDA的積累，保護了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，維持了冷害下南瓜幼苗碳氮代謝的正常進行，增強了南瓜的抗冷性。試驗條件下，NO對銀輝2號的促進作用大于青栗。

南瓜；冷害脅迫；一氧化氮；光合色素；活性氧代謝；有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

一氧化氮(nitric oxide，NO)作為植物內(nèi)源性兼具生理效應(yīng)和生物毒性的氧化還原信號分子，參與了從種子萌發(fā)、幼苗生長到成熟及細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)等整個生命過程中多種生理過程的調(diào)節(jié)[1]。南瓜(Cucurbitamoschata)起源于中南美洲的熱帶地區(qū)，屬典型的冷敏感植物，在東北、西北、華北的蔬菜生產(chǎn)過程中，由于早春的低溫冷害及氣溫回暖后的倒春寒都對南瓜苗期發(fā)育產(chǎn)生影響，進而嚴(yán)重影響南瓜產(chǎn)量和品質(zhì)。提高南瓜苗期耐冷性是三北地區(qū)針對氣候特點減害、避害的有效途徑。因此，研究低溫脅迫與南瓜幼苗耐冷性的關(guān)系，探索提高南瓜苗期抗御低溫冷害的能力具有重要意義。低溫冷害會造成膜系統(tǒng)損傷、細(xì)胞脫水、光合機構(gòu)破壞、酶活下降、代謝紊亂、生長受阻，嚴(yán)重時致植株死亡，是危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要自然災(zāi)害之一[2]。已有研究表明，由于NO可以激活鳥苷酸環(huán)化酶(cGC)，升高體內(nèi)cGMP水平，因此，在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，不僅對植物的形態(tài)建成、器官發(fā)育及成熟和衰老等過程起調(diào)控作用[3-4]，而且作為胞內(nèi)和胞間信號分子，介導(dǎo)了基因表達(dá)、抗病、對環(huán)境脅迫的逆境響應(yīng)等多種生理過程[5-6]。楊美森等[2]以冷敏感性不同的棉苗為材料，發(fā)現(xiàn)外源NO能顯著提高棉花葉片保護酶活性及抗氧化劑含量，維持較高的PSⅡ光化學(xué)活性，降低MDA和H2O2含量，增強棉苗對冷害脅迫的適應(yīng)性。吳錦程等[7]報道了外源NO通過上調(diào)保護酶活性，提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，提高了枇杷幼果的抗寒性。此外，通過促進擬南芥(Arabidopsisthaliana)NIA1基因的表達(dá)，誘導(dǎo)內(nèi)源性NO合成，增加Pro積累，增強植物抗凍性[8]及激活鹽脅迫下苜蓿種子的抗氧化系統(tǒng)，減輕鹽脅迫對蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)種子的傷害，促進種子萌發(fā)的效應(yīng)也已被證實[9]。NO對逆境下禾谷類、牧草及部分蔬菜如番茄、黃瓜、辣椒的生理生化響應(yīng)的研究較多，而目前NO對冷脅迫下冷敏感的作物——南瓜幼苗生長發(fā)育、生理代謝的研究較少。本試驗針對黑龍江省乃至東北地區(qū)南瓜生產(chǎn)中面臨的苗期低溫冷害，以兩種耐冷性不同的南瓜幼苗為試驗材料，以內(nèi)源性植物生長調(diào)節(jié)劑“NO”為調(diào)控手段，研究外源施加后對冷脅迫下南瓜幼苗生長、抗氧化系統(tǒng)及光合等生理特性的影響，探討外源NO對提高南瓜抗冷性的生理生化機制，為在高寒地區(qū)有效防御南瓜發(fā)育早期的低溫冷害提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

以南瓜品種“銀輝2號” (C.moschataYinhui 2)和“青栗” (C.maximaQingli)為試材，由齊齊哈爾市種子經(jīng)銷處提供。

試驗所用NO供體為硝普鈉[Na2Fe(CN)5](sodium nitroprusside，SNP)，購自Sigma公司，純度為98.5%。先配制成100 mmol/L 母液，4 ℃保存，用時按所需濃度稀釋。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 試材培育 試驗于2014年3-7月在齊齊哈爾大學(xué)生物化學(xué)實驗室進行。精選飽滿均勻一致的南瓜種子，先經(jīng)0.1%的KMnO4消毒，25 ℃下浸泡8 h后進行催芽。待露白后，將發(fā)芽一致的種子播于細(xì)砂經(jīng)清水浸泡1 h、高溫滅菌(130 ℃，3 h)、定量稱重的花盆中(8粒/盆)，維持人工氣候培養(yǎng)箱中環(huán)境為(25 ℃/20 ℃±2 ℃，光周期14 h/10 h循環(huán)，相對濕度50%～60%)，出苗后每隔2 d澆灌1/2 Hoagland營養(yǎng)液300 mL。待幼苗3片真葉全展時，從人工氣候箱中取出轉(zhuǎn)為自然培養(yǎng)，2周后，每盆保留生長整齊一致的兩品種幼苗5株，各20盆。

1.2.2 試驗處理 當(dāng)幼苗長至4～5片真葉時，將其隨機分為4組：其中2組噴施清水，2組噴施SNP(NO供體)。分別于每天8:30和14:30葉面噴施2次，每次噴施量為10 mL/盆。以葉片正反面都無溶液滴下為宜，噴后以保鮮膜覆蓋盆上部2 h，共處理7 d。每處理20株苗，每次取樣5株，3次重復(fù)。

試驗共設(shè)4個處理：分別為處理T1(對照)：正常生長條件(23 ℃/18 ℃)+葉噴清水；處理T2：正常生長條件(23 ℃/18 ℃)+葉噴100 μmol/L的SNP；處理T3：冷害(8 ℃/5 ℃)+葉噴清水；處理T4：冷害(8 ℃/5 ℃)+葉噴100 μmol/L的SNP。溫度是根據(jù)黑龍江省西北部南瓜苗期氣候特點以及前期試驗設(shè)定。SNP濃度是在預(yù)實驗效果的基礎(chǔ)上篩選出的最佳濃度。于處理7 d后取3片真葉進行ROS生成、保護酶活性、抗氧化物質(zhì)含量、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝及葉綠素含量等各項生理生化指標(biāo)的測定。最后5株苗做生長量和干物質(zhì)積累測定。

1.3 測定項目和方法

1.3.1 幼苗生長及鮮重、干重的測定 輕取幼苗，用卷尺量取莖基部到生長點的距離為株高(精確到1 mm)。之后將地上、地下部分分開，迅速用蒸餾水洗凈并吸干表面水分，稱取鮮重后，110 ℃烘箱殺青10 min，之后轉(zhuǎn)至75 ℃烘干至恒重，稱干重。地上部鮮重和干重以5株幼苗的平均值表示，單位為g/株。

1.3.2 膜脂過氧化及活性氧(ROS)的生成測定 超氧陰離子自由基(O2-·)產(chǎn)生速率參照王愛國等[10]的方法；用二甲酚橙法測定 H2O2(μmol/g FW)含量[11]；用硫代巴比妥酸(TBAD)比色法測定MDA(nmol/g)含量[12]。

1.3.3 抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量的測定 超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)及谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)活性按照Pinheiro等[13]的方法；過氧化物酶(POD)活性用愈創(chuàng)木酚法[11]；抗壞血酸(ascorbic acid，ASA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)參照朱為民等[14]的方法定量。

1.3.4 有機溶質(zhì)含量的測定 脯氨酸含量的測定采用酸性茚三酮比色法、可溶性糖含量用蒽酮比色法、可溶性蛋白用考馬斯亮藍(lán)法、氨基酸總量用茚三酮顯色法測定[12]。

1.3.5 光合色素含量的測定 采用丙酮乙醇混合液提取，比色法測定葉綠素a(chl a)、葉綠素b(chl b)和類胡蘿卜素(caro)含量[12]。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±SE表示，在Microsoft Excel 2003進行常規(guī)統(tǒng)計，用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析，檢驗其差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源NO對冷害脅迫下南瓜幼苗生物積累量的影響

生長受抑甚至停滯、生物積累量下降是低溫脅迫下植物最直觀的生理響應(yīng)，且抑制程度可反映出植物的受害程度。表1可見，T3處理，南瓜幼苗株高、地上部和根系鮮、干重均明顯下降。銀輝2號和青栗株高分別比T1降低了19.60%和26.47%。鮮重和干重則分別降低了18.76%和16.84%，33.71%和26.45%(P<0.05)，說明低溫冷害顯著抑制了南瓜幼苗的生長發(fā)育，且品種間比較，青栗受冷害的影響更加嚴(yán)重。T2處理，兩品種株高和地上部鮮重與T1無顯著變化，但根系干重及銀輝2號的根系鮮重均顯著高于對照(P<0.05)，顯示葉噴100 μmol/L的SNP具有促進南瓜幼苗根系發(fā)育的作用。T4處理，銀輝2號株高和地上、下部干重分別比T3提高了19.73%、18.67%和35.00%；青栗分別提高了11.13%、16.90%和27.78%，達(dá)差異顯著水平，表明T4處理可以減輕低溫冷害對南瓜幼苗生長的抑制作用。品種間比較，SNP對銀輝2號生物積累量的增加效果優(yōu)于青栗。

表1 外源NO對冷害脅迫下南瓜幼苗生長的影響

Table 1 Effects of NO on the growth of pumpkin seedlings under low temperature stress (mean±SE)

品種Cultivars處理Treatments株高Plantheight(cm)地上部鮮重Freshweightofshoot(g/plant)根系鮮重Freshweightofroot(g/plant)地上部干重Shootdryweight(g/plant)根系干重Rootdryweight(g/plant)青栗QingliT113.56±0.41a10.36±0.24a2.01±0.12a0.94±0.07b0.27±0.04bT213.74±0.30a10.67±0.15a2.08±0.05a1.10±0.10a0.31±0.02aT39.97±0.19c6.65±0.11c1.55±0.07c0.71±0.02d0.18±0.01dT411.08±0.22b8.07±0.20b1.70±0.14b0.83±0.09c0.23±0.03c銀輝2號Yinhui2T112.86±0.12a8.69±0.17a1.76±0.17b0.87±0.14b0.24±0.03cT212.97±0.09a8.73±0.08a1.82±0.11a0.92±0.13a0.30±0.04aT310.34±0.25c6.80±0.13c1.69±0.24c0.75±0.03c0.20±0.01dT412.38±0.17b8.25±0.06b1.74±0.19b0.89±0.12b0.27±0.04b

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。
Note: Values with different lowercases within the same column are significantly different (P<0.05). The same below.

2.2 外源NO對冷害脅迫下南瓜幼苗葉片O2-·生成速率和H2O2及MDA含量的影響

T2處理對南瓜葉片O2-·生成速率無明顯影響(表2)，但葉片H2O2含量均顯著升高，銀輝2號和青栗分別比T1增加了56.93%和43.55%，銀輝2號MDA含量下降(P<0.05)。冷脅迫下，兩品種葉片O2-·生成速率和H2O2含量均顯著增加，分別達(dá)正常生長條件的1.97、2.02倍和2.89、2.58倍。MDA含量達(dá)到峰值，且青栗MDA絕對增加量明顯大于銀輝2號，表明在逆境下組織自動氧化速率加大，過氧化過程加劇進行。T4處理，銀輝2號和青栗O2-·生成速率和MDA含量分別比T3降低了29.11%、40.59%和25.60%、28.49%(P<0.05)，銀輝2號H2O2含量降幅25.20%，青栗降幅達(dá)35.76%。說明SNP能緩解冷害導(dǎo)致的膜脂過氧化損傷，有效阻止由乙醛和甲酸乙酯在堿作用下的縮合作用而引起的蛋白質(zhì)、核酸等大分子的交聯(lián)聚合反應(yīng)，大幅度提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和完整性。品種間比較，NO對銀輝2號降低MDA積累導(dǎo)致細(xì)胞毒性的效應(yīng)較青栗顯著。

表2 外源NO對冷害脅迫下南瓜幼苗葉片MDA、H2O2含量和O2-·生成速率的影響

Table 2 Effects of NO on contents of MDA and H2O2, production rate of O2-·in leaves of pumpkin seedlings under low temperature stress

處理TreatmentProductionrateofO2-·[nmol/(gFW·min)]銀輝2號Yinhui2青栗QingliH2O2content(μmol/gFW)銀輝2號Yinhui2青栗QingliMDAcontent(nmol/g)銀輝2號Yinhui2青栗QingliT10.384±0.009c0.407±0.019c1.342±0.032d1.224±0.041d8.891±0.120c9.104±0.025cT20.351±0.012c0.436±0.048c2.106±0.008c1.757±0.022c6.686±0.087d10.975±0.141cT30.759±0.020a0.824±0.036a3.873±0.026a3.168±0.003a19.935±0.432a24.316±0.578aT40.538±0.043b0.613±0.005b2.897±0.057b2.035±0.110b11.844±0.034b17.389±0.623b

2.3 外源NO對冷害脅迫下南瓜幼苗葉片抗氧化酶活性及ASA和GSH含量的影響

幼苗遭受冷害7 d后，兩品種SOD活性均顯著高于對照(表3)，銀輝2號和青栗分別上調(diào)了29.28%和20.01%(P<0.05)。而T4處理，SOD活性分別達(dá)T1的2.17和1.82倍，較T3提高了68.23%、51.34%。POD活性品種間比較，無論是正常生長狀態(tài)還是逆境及外源因子處理，銀輝2號均低于青栗，但T3處理，兩品種POD活性都大幅增加。T4處理，進一步上調(diào)了葉片POD活性，銀輝2號和青栗的絕對增加值分別達(dá)到49.18%和36.86%，品種之間呈明顯差異。CAT活性與SOD、POD在兩品種上的表現(xiàn)不同，T3處理CAT活性分別較T1降低了29.54%、39.76%，T4處理僅較冷害下提高了13.44%、9.99%，仍顯著低于T1和T2處理。

表3 外源NO對冷害脅迫下南瓜幼苗葉片SOD、POD和CAT活性的影響

Table 3 Effects of exogenous NO on activities of SOD, POD and CAT in leaves of pumpkin seedlings under low temperature stress

處理TreatmentSODactivity(U/gFW)銀輝2號Yinhui2青栗QingliPODactivity(U/gFW)銀輝2號Yinhui2青栗QingliCATactivity(U/gFW)銀輝2號Yinhui2青栗QingliT195.88±2.38d82.42±1.67d35.86±0.24d43.92±0.87d35.27±1.16a38.58±2.46aT2142.65±4.56b118.11±3.87b46.76±1.58c59.60±1.24c34.68±2.15a37.84±0.87aT3123.95±7.23c98.91±1.78c65.33±2.35b77.22±1.16b24.85±1.66c23.24±1.78bT4208.52±6.61a149.69±4.25a97.46±3.21a105.68±2.34a28.19±2.31b25.33±1.12b

T3處理，銀輝2號和青栗APX活性僅為T1的66.89%、76.72%(P<0.01)，GR活性分別上調(diào)了52.88%、18.24%，品種之間及銀輝2號和T1之間達(dá)差異顯著水平(P<0.05)。T4處理，兩品種APX活性分別比T3提高了74.39%、67.09%；GR活性均顯著高于T1和T3處理。品種間比較，銀輝2號T4處理GR活性較T3上調(diào)了37.14%，增幅大于青栗(24.94%)，由于GR是胞內(nèi)將GSSG還原為GSH的關(guān)鍵酶，其活力的提高表明清除ROS能力的提升。外源SNP顯著提高了冷脅迫下南瓜葉片SOD、POD、APX和GR活性，但對CAT活性影響較小(表4)。

T2處理顯著提高了兩品種GSH含量，分別高于對照35.93%、21.94%，但對ASA含量無明顯影響。T3處理使ASA含量大幅降低，分別只為對照的76.95%、64.51%；GSH含量升高，銀輝2號增幅(18.14%)大于青栗(7.48%)。T4處理，ASA、GSH含量分別達(dá)T3的2.06、1.33和1.72、1.29倍，并且顯著高于T1(P<0.05)。從絕對增長量和增幅來看，對銀輝2號的效應(yīng)更加明顯(表4)。

表4 外源NO對冷害脅迫下南瓜幼苗葉片APX和GR活性及ASA、GSH 含量的影響

Table 4 Effects of exogenous NO on activities of APX and GR and contents of ASA， GSH in leaves of pumpkin seedlings under low temperature stress

處理TreatmentAPXactivity[nmol/(min·gFW)]銀輝2號Yinhui2青栗QingliGRactivity[nmol/(min·gFW)]銀輝2號Yinhui2青栗QingliASAcontent(μg/gFW)銀輝2號Yinhui2青栗QingliGSHcontent(nmol/gFW)銀輝2號Yinhui2青栗QingliT14.32b3.05b12.84d13.16c73.71b76.67b35.88d30.90cT24.85a3.76a22.37b17.67b75.88b73.68b48.77b37.68bT32.89c2.34c19.63c15.56c56.72c49.46c42.39c33.21cT45.04a3.91a26.92a19.44a117.09a84.89a56.56a42.87a

2.4 外源NO對冷害脅迫下南瓜幼苗葉片葉綠體色素含量的影響

葉綠素是光合作用中最有效和最重要的色素，其含量在一定水平上影響南瓜苗期同化外源物質(zhì)和進行光合積累的能力，并最終影響南瓜的產(chǎn)量。T3處理顯著降低了兩品種Chl a 、Chl b 及類胡蘿卜素(Caro)含量，并使Chl a/b顯著下降。T2處理對Chl a 、Chl b及總量無顯著影響，但提高了Caro含量。T4處理顯著提高了兩品種Chl a 、Chl b含量，并使Chl a/b顯著上升。青栗分別提高了73.14%、62.22%、6.73%；銀輝2號增幅則達(dá)到83.22%、70.21%、7.64%。從光合色素的種類比較，Caro在T3處理下的降幅小于Chl a+b的降幅，T4處理則均達(dá)峰值，由于Caro既是光合色素，又是內(nèi)源性的非酶系統(tǒng)ROS清除劑，此時發(fā)揮了淬滅活性氧的作用(表5)。

2.5 外源NO對冷害脅迫下南瓜幼苗葉片可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸和游離氨基酸含量的影響

脯氨酸既是滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，又是抗氧化物質(zhì)。正常生長條件下，植物體內(nèi)脯氨酸的含量較低，但在低溫、干旱、鹽堿等逆境時，脯氨酸大量積累，且積累指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)，所以，脯氨酸可作為植物抗逆性的一項重要生化指標(biāo)[15]。銀輝2號和青栗脯氨酸含量T3處理比T1分別上調(diào)了85.24%、60.03%。T4處理進一步促進了脯氨酸的積累，青栗和銀輝2號T4比T3分別提高了25.22%和42.34%。冷脅迫刺激促進了兩南瓜品種葉片可溶性糖的積累，T4處理，銀輝2號可溶性糖的升幅(47.09%)高于青栗(16.62%)，T3和T4之間達(dá)差異顯著水平(P<0.05)?？扇苄缘鞍资侵参矬w內(nèi)生化反應(yīng)的重要溶質(zhì)，與作物生長、發(fā)育、成熟、抗逆性密切相關(guān)[5]。從表6可以看出，T2處理葉片游離氨基酸含量顯著降低，可溶性蛋白含量變化不大；T3則明顯降低了兩指標(biāo)的含量水平。T4處理，銀輝2號可溶性蛋白和氨基酸總量分別較T3上調(diào)了37.12%、76.00%；而青栗僅提高了27.79%、68.18%，NO提高低溫脅迫下南瓜葉片可溶性蛋白和氨基酸的效應(yīng)銀輝2號強于青栗。

表5 外源NO對冷害脅迫下南瓜葉片葉綠體色素含量的影響

Table 5 Effects of NO on photosynthetic pigment in leaves of pumpkin seedlings under low temperature stress

品種Cultivars處理Treatments葉綠素a含量Chlorophylla(mg/gFW)葉綠素b含量Chlorophyllb(mg/gFW)葉綠素總量含量Chla+b(mg/gFW)葉綠素a/b類胡蘿卜素含量Carotenecontent(mg/gFW)青栗QingliT12.67±0.06a0.78±0.04a3.45±0.07a3.423b0.86±0.03cT22.70±0.02a0.80±0.02a3.50±0.10a3.375c0.94±0.05bT31.49±0.03c0.45±0.01c1.94±0.04c3.311d0.75±0.02dT42.58±0.01b0.73±0.05b3.31±0.09b3.534a1.05±0.04a銀輝2號Yinhui2T12.74±0.09b0.82±0.08a3.56±0.15b3.341b0.98±0.08bT22.83±0.07a0.85±0.03a3.68±0.08a3.329c1.03±0.04bT31.55±0.02c0.47±0.04b2.02±0.14c3.298d0.86±0.01cT42.84±0.05a0.80±0.01a3.64±0.05a3.550a1.22±0.03a

表6 外源NO對冷害脅迫下南瓜葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響(平均數(shù)±SE)

Table 6 Effects of exogenous NO on organic osmoregulation substance in leaves of pumpkin seedlings under chilling stress (mean±SE)

品種Cultivars處理Treatments可溶性蛋白Solubleprotein(mg/gFW)可溶性糖Solublesugar(mg/gFW)脯氨酸Proline(μg/gFW)游離氨基酸總量Freeaminoacid(mg/gFW)青栗QingliT127.45±1.26a2.15±0.08c7.93±0.26c0.33±0.01bT228.37±0.28a2.33±0.02c8.24±0.05c0.26±0.04cT315.69±1.55c3.97±0.03b12.69±0.38b0.22±0.02dT420.05±0.76b4.63±0.09a15.88±0.15a0.37±0.03a銀輝2號Yinhui2T125.87±0.89b2.38±0.01c7.32±0.11c0.39±0.02bT228.14±0.65a2.56±0.04c7.96±0.42c0.31±0.05cT316.38±1.34d3.95±0.09b13.58±0.17b0.25±0.03dT422.46±0.39c5.81±0.03a19.33±0.56a0.44±0.06a

3 討論

低溫作為一種影響植物生長和分布的較為普遍的逆境因子，是喜溫性蔬菜生長、產(chǎn)量和品質(zhì)的重要限制因素。吸脹冷害下紫花苜蓿種子H2O2及O2-·顯著積累，SOD、CAT活力降低，根系活力下降[16]。也有研究表明，外源NO能顯著緩解低溫對黃瓜幼苗生長的抑制作用，提高葉綠素含量，加強了對光能的吸收和利用[17]。本試驗結(jié)果表明，低溫導(dǎo)致南瓜幼苗生物積累量明顯下降，分析其可能原因為，ROS增加，過氧化傷害導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)受損，光合碳同化產(chǎn)物減少，氧化磷酸化解偶聯(lián)使維持生長能耗增加，游離氨基酸總量和可溶性蛋白減少。在形態(tài)建成過程中，C/N代謝受阻，尤其是碳架不足等原因而抑制了南瓜生長。外源NO顯著增加了冷害逆境下兩品種南瓜幼苗植株的生物積累量，不同程度緩解和減輕了冷害對兩品種幼苗生長的抑制作用。植物在低溫馴化過程中發(fā)生許多生理生化變化，最明顯的就是膜脂相的改變。研究發(fā)現(xiàn)，NO可通過質(zhì)外體直接作用于細(xì)胞壁組分，使細(xì)胞壁松弛，并且能作用于膜的脂質(zhì)雙層，增強膜的流動性，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的前提下，增強了與外界的物質(zhì)交換、養(yǎng)分吸收和信息傳遞，增強了南瓜苗期的抗冷性，從而促進細(xì)胞擴展和植株生長[18]。

冷害下，需氧植物體內(nèi)ROS代謝失衡，伴隨著NADPH和ATP的產(chǎn)生，質(zhì)膜上NADPH氧化酶與O2反應(yīng)生成過量的O2-·，誘發(fā)膜脂過氧化，使膜結(jié)構(gòu)受損、細(xì)胞脫水、離子外滲、酶活下降，進而引起代謝紊亂、生長受阻[19]。試驗發(fā)現(xiàn)，兩品種南瓜葉片在低溫逆境中O2-·和H2O2大量生成，H2O2可抑制質(zhì)膜上的內(nèi)向K+通道，引起膨壓降低，導(dǎo)致氣孔關(guān)閉，進而降低葉綠體內(nèi)的CO2含量，從而使光合磷酸化受阻，更多的電子激活分子氧，產(chǎn)生更多的氧自由基，加劇了膜脂過氧化，并積累過氧化產(chǎn)物MDA，進一步導(dǎo)致ROS代謝紊亂。由于NO能誘導(dǎo)單子葉植物紫露草(Tradescantiasp.)和雙子葉植物蠶豆的氣孔孔徑減小，H2O2介導(dǎo)激發(fā)子和ABA來誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，推測二者在調(diào)控氣孔運動、誘導(dǎo)防御基因表達(dá)等方面存在協(xié)同效應(yīng)和有互補作用[20]。前人對冷脅迫下不同植物酶促系統(tǒng)保護酶活性的變化及非酶體系A(chǔ)SA、GSH含量進行了相關(guān)研究。肖強等[21]證實，NO可通過提高水稻(Oryzasativa)葉片中SOD、CAT活性及根系中SOD、CAT、GPX活性來降低和緩和鹽脅迫導(dǎo)致的氧化損傷。Uchida等[22]研究表明，NO還可能作為信號分子上調(diào)GR活性，在胞內(nèi)的氧化還原體系中使GSSG不斷還原再生為GSH，為清除ROS提供持續(xù)的還原力。本試驗中，SNP無論是單獨處理還是復(fù)合冷脅迫，APX活性都大幅升高，而CAT活力水平兩品種均低于對照，可能與NO作為正效應(yīng)物與APX中的血紅素鐵結(jié)合，通過酶分子構(gòu)象的改變提高了其活力有關(guān)[23]，而H2O2可與CAT形成一種復(fù)合物而使其鈍化，這種CAT的鈍化形式可顯著抑制CAT活力[24]，這與趙萌等[16]的研究結(jié)果是一致的。復(fù)合SNP后ASA的大幅升高說明ASA-GSH循環(huán)也參與了逆境下ROS的調(diào)節(jié)。GSH是ASA合成的關(guān)鍵酶雙脫氫抗壞血酸還原酶的底物，NO使冷害下南瓜葉片GSH含量提高的同時也提高了ASA的含量。ASA也是APX的底物，且在APX作用下，以GSH為質(zhì)子供體，以NADPH為還原力，將H2O2還原為H2O，GR也通過NADPH將GSSG還原為GSH。故研究認(rèn)為，NO誘導(dǎo)的南瓜葉片GSH的高表達(dá)，引發(fā)了冷脅迫逆境下APX活力的上調(diào)和ASA的合成。

葉綠體是植物光合作用的重要場所，低溫冷害下，ROS大量產(chǎn)生，對植物光合機構(gòu)產(chǎn)生傷害。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下，由于ROS的代謝失衡，會直接影響葉綠體類囊體膜的透性和流動性，使葉綠體形態(tài)改變、葉綠體色素含量下降；并且Chl a的降解速率快于Chl b，這是因為類囊體膜是最易受到低溫傷害的生物膜，由于類囊體內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)的破壞，使在類囊體上進行的光化學(xué)反應(yīng)受阻，由Chl a構(gòu)成的PSⅡ反應(yīng)中心的光合電子傳遞、光合磷酸化解偶聯(lián)之故。外施NO后顯著提高了葉綠素、類胡蘿卜素的含量，這與楊美森等[2]、陳銀萍等[25]在人工模擬低溫逆境下，在棉苗和玉米上的研究結(jié)果一致。NO外施后，兩品種南瓜葉片Chl a 、Chl b降解速率基本一致，且處理葉片比對照具有更多的天線色素，光合機構(gòu)能更有效地通過光化學(xué)反應(yīng)吸收利用光能。推測NO抑制了葉綠酸酶的活性，降低了葉綠素的降解；同時通過降低ROS和MDA的生成減輕了對南瓜葉片葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞和光合器官的損傷。

逆境均會導(dǎo)致滲透脅迫，植物體通過代謝積累一些小分子的有機溶質(zhì)來進行滲透調(diào)節(jié)，緩解逆境造成的損傷。碳氮代謝是植物體內(nèi)重要的兩大代謝途徑，冷害下光合功能的衰退首先導(dǎo)致光合碳同化產(chǎn)物可溶性糖含量下降。同時植物體內(nèi)脯氨酸的積累也一定程度上反映了抗逆性的高低。冷害復(fù)合SNP處理，銀輝2號可溶性糖的迅速積累，顯示了比青栗更強的滲透保護能力。本研究結(jié)果顯示，冷害處理南瓜葉片可溶性蛋白的合成明顯受抑，含量降低。推測在低溫脅迫下，葉片內(nèi)蛋白水解酶活力下降，蛋白質(zhì)的降解受阻，導(dǎo)致氨基酸總量降低，同時由于光合碳同化能力下降，碳架缺乏蛋白質(zhì)合成的原料不足，進一步降低了可溶性蛋白的含量。外源SNP處理后，顯著提高了冷脅迫下南瓜葉片的可溶性蛋白和氨基酸含量，可能與NO提高了南瓜早期氮代謝關(guān)鍵酶——硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶及谷氨酸合酶的活性有關(guān)，其分子機制有待于進一步研究。

4 結(jié)論

低溫抑制了南瓜幼苗光合色素的合成，加劇了膜脂過氧化作用，使植株生長受阻，生物積累量下降。正常生長條件葉片噴施SNP，一定程度上提高了游離氨基酸和H2O2含量，促進了地下部干物質(zhì)的積累和類胡蘿卜素的合成，顯著提高了兩品種南瓜幼苗的SOD、POD、 APX、GR活性。低溫脅迫下，外源NO處理顯著降低了ROS和MDA的生成，SOD、POD、APX活性大幅升高，并通過增強光合色素合成促進了早期碳氮代謝產(chǎn)物——可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸及游離氨基酸的積累，促進了幼苗生長。抗氧化物質(zhì)ASA、GSH含量的大幅提高，也說明外源NO可通過與內(nèi)源H2O2發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)和互補作用激活逆境應(yīng)答，增強了南瓜幼苗的耐冷性。

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Protective effect of exogenous nitric oxide against oxidative damage in pumpkin seedlings under chilling stress

WU Xu-Hong1*， LV Cheng-Min1， FENG Jing-Min2

1.CollegeofLifeSciences,AgricultureandForestry,QiqihaerUniversity,Qiqihaer161006,China; 2.Qiqihaersanitarysupervisioninstitute,Qiqihaer161005,China

The effects of exogenous nitric oxide on growth and oxidative damage in pumpkin seedlings under low temperature stress were studied. Seedlings of two pumpkin cultivars, ‘Yinhui 2’ and ’Qingli’, were sprayed with the nitric oxide donor, sodium nitroprusside (SNP: 100 μmol/L) and their growth, chloroplast pigment content, organic osmoregulation substances content, and active oxygen metabolism under chilling stress were analyzed. Chilling stress significantly inhibited the growth of pumpkin seedlings as a result of increased active oxygen accumulation and lipid peroxidation, decreased photosynthetic pigment content, and reduced osmotic adjustment ability. Under normal growth conditions, the SNP treatment significantly increased the activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), ascorbate peroxidase (APX), and glutathione reductase (GR), and also significantly increased shoot dry weight, root dry weight, and the H2O2, free amino acid, glutathione, and carotene contents. Under chilling conditions (8 ℃ days/5 ℃ nights), seedlings sprayed with 100 μmol/L SNP showed significantly increased plant growth and dry matter accumulation and significantly increased SOD, POD, APX and GR activities in leaves, and reduced accumulation of H2O2and malondialdehyde (MDA). Exogenous SNP application increased the glutathione, chlorophyll, carotenoid, ascorbate, soluble protein, and total amino acid contents. Under chilling stress, exogenous SNP application reduced the accumulation of H2O2and MDA, and protected membrane stability by increasing antioxidant enzyme activities and the contents of organic osmoregulation and antioxidant substances. These physiological changes protected the stability of cell membrane structure, and maintained carbon and nitrogen metabolism in the seedlings under chilling conditions, thereby increasing the cold resistance of pumpkin. Under these conditions, Yinhui 2 was more responsive than Qingli to exogenous SNP.

pumpkin (Cucurbitamoschata); chilling injury; nitric oxide; photosynthetic pigments; active oxygen metabolism; organic osmotic adjustment substance

10.11686/cyxb2016052

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-02-01；改回日期：2016-04-01

吳旭紅(1962-)，女，黑龍江齊齊哈爾人,教授。E-mail：wvg25583681129@sina.com*通信作者Corresponding author.

吳旭紅, 呂成敏, 馮晶旻. 外源一氧化氮(NO)對低溫脅迫下南瓜幼苗氧化損傷的保護效應(yīng). 草業(yè)學(xué)報, 2016, 25(12): 161-169.

WU Xu-Hong, LV Cheng-Min, FENG Jing-Min. Protective effect of exogenous nitric oxide against oxidative damage in pumpkin seedlings under chilling stress. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(12): 161-169.