能源橡膠草GGPPS基因啟動(dòng)子的克隆及瞬時(shí)表達(dá)研究

李永梅，馮玉杰，曹新文，趙李靖，祝建波，閆潔

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832000)

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能源橡膠草GGPPS基因啟動(dòng)子的克隆及瞬時(shí)表達(dá)研究

李永梅，馮玉杰，曹新文，趙李靖，祝建波，閆潔*

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832000)

以多年生宿根型草本植物橡膠草為材料，根據(jù)已獲得的橡膠草牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS)基因序列設(shè)計(jì)引物，采用TAIL-PCR擴(kuò)增到GGPPS基因5′上游大小為1131 bp的序列。采用PlantCare和PLACE軟件分析，表明該序列不僅具有啟動(dòng)子的基本元件，同時(shí)還有與多個(gè)器官特異表達(dá)元件以及與脅迫相關(guān)的順式作用元件，命名為pTkGGPPS(GenBank：KT901796)。將該序列代替pCAMBIA1304質(zhì)粒上的CaMV 35S啟動(dòng)子序列，以GFP基因作為報(bào)告基因，構(gòu)建pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，結(jié)果表明，該啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)GFP基因表達(dá)，具有一定的活性。TkGGPPS基因啟動(dòng)子克隆及瞬時(shí)表達(dá)為橡膠草中橡膠合成及組織特異性研究奠定了基礎(chǔ)。

橡膠草；GGPPS基因；TAIL-PCR；啟動(dòng)子；序列分析；瞬時(shí)表達(dá)

啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游的DNA序列，能夠活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始特異性。啟動(dòng)子(promoters)就像“開關(guān)”，決定轉(zhuǎn)錄的方向和效率，控制基因表達(dá)的起始時(shí)間、空間和表達(dá)程度。目前，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物所用的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子(如煙草花葉病毒35S啟動(dòng)子)。組成型啟動(dòng)子是基因工程中應(yīng)用最早，且應(yīng)用最為廣泛的一類啟動(dòng)子。它能夠在組織中非特異性和高效表達(dá)，外源基因的高效表達(dá)，能夠滿足人類的需求；但是，外源基因的非特異性表達(dá)和異源基因的高效表達(dá)，打破植物原有的代謝平衡，影響植物的正常生長[1]。為了減少外源基因在組織中非特異性和高效表達(dá)所帶來的不利影響，尋求組織特異性啟動(dòng)子就顯得尤為重要。

橡膠草(Taraxacumkok-saghyz)是一種多年生的產(chǎn)膠草本植物，作為產(chǎn)膠代謝機(jī)理研究的生物反應(yīng)器，對(duì)橡膠草產(chǎn)膠相關(guān)功能基因的研究尤為重要。牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶是產(chǎn)膠代謝途徑的一個(gè)上游基因，它能夠催化烯丙基焦磷酸合成GGPP。橡膠分子合成起始是一個(gè)十分緩慢的過程，是橡膠生物合成的關(guān)鍵限速步驟；增加橡膠產(chǎn)量的遺傳控制戰(zhàn)略應(yīng)集中在橡膠分子合成的起始上[2]。有研究者報(bào)道，在橡膠體外合成試驗(yàn)中，二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)、香葉基焦磷酸(geranyl diphosphate，GPP)、法呢基焦磷(farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP)和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP)都可作為橡膠分子合成的前體物質(zhì)且各起始物都以一個(gè)恒定的速度啟動(dòng)橡膠的合成。但是，隨著起始物碳鏈的增長，橡膠合成速度也增加(起始物鏈長效應(yīng))，即DMAPP(C5)

因此，本研究通過熱不對(duì)稱性PCR(thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR)技術(shù)，克隆橡膠草中GGPPS基因的特異性啟動(dòng)子，并對(duì)其進(jìn)行活性研究；根據(jù)啟動(dòng)子所含有的順式調(diào)控元件，預(yù)測該啟動(dòng)子的功能，為提高橡膠草橡膠合成奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年9月，橡膠草采自新疆石河子市北泉鎮(zhèn)附近。

1.2 方法

1.2.1 橡膠草TkGGPPS基因啟動(dòng)子的克隆 根據(jù)已克隆的橡膠草TkGGPPS基因序列設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物：sp1、sp2、sp3，5個(gè)短的簡并AD引物：AD1、AD2、AD3、AD4和AD5(表1)。用CTAB法提取橡膠草葉片基因組DNA，3個(gè)特異引物和5個(gè)短的AD引物組合進(jìn)行TAIL-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：模板(基因組DNA)1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，引物各0.5 μL，10×LA-Taq buffer 2.5 μL，LA-Taq DNA polymerase(TaKaRa公司)0.5 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。第2輪和第3輪PCR分別以上一輪PCR的產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，反應(yīng)體系同上。擴(kuò)增程序參考文獻(xiàn)[5-9]，具體擴(kuò)增程序見表1。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測3輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Tiangen公司)回收第3輪PCR中單一條帶，連接到pMD19-T載體(TaKaRa公司)上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化EscherichiacoliTop10感受態(tài)細(xì)胞，陽性單克隆交由北京華大基因股份有限公司進(jìn)行測序。

根據(jù)TAIL-PCR所得序列設(shè)計(jì)特異引物：pTkGGPPS-F和pTkGGPPS-R。以橡膠草基因組DNA為模板，以pTkGGPPS-F和pTkGGPPS-R為上下游引物，擴(kuò)增橡膠草TkGGPPS基因啟動(dòng)子序列，擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 5 min；(94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s)30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。將純化產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞，將陽性單克隆進(jìn)行測序(表2)。

1.2.2 pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP植物表達(dá)載體構(gòu)建 用EcoRⅠ與NcoⅠ(TaKaRa公司)雙酶切pMD19-Tector-pTkGGPPS重組質(zhì)粒與pCAMBIA1304質(zhì)粒，分別回收小片段和大片段。將pTkGGPPS小片段與pCAMBIA1304載體大片段用T4-DNA連接酶(TaKaRa公司)，16 ℃連接過夜，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那霉素(Kan)篩選，進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，經(jīng)鑒定正確的陽性重組子，用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，獲得陽性轉(zhuǎn)化子。命名為pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP/GV3101。

表1 TAIL-PCR的擴(kuò)增程序

Table 1 Amplification program of TAIL-PCR

預(yù)擴(kuò)增Pre-amplification次序Step溫度Temperature(℃)時(shí)間Time(s)第1輪TAIL-PCRPrimaryTAIL-PCR次序Step溫度Temperature(℃)時(shí)間Time(s)第2輪TAIL-PCRSecondaryTAIL-PCR次序Step溫度Temperature(℃)時(shí)間Time(s)19312019430194302956026560265603943037218037218046060494304943057218056860568606返回第3步Gotostep310個(gè)循環(huán)10cycles672180672180794307943079430825120868608686097218097218097218010943010943010943011606011506011506012721801272180127218013返回第11步Gotostep1124個(gè)循環(huán)24cycles13返回第4步Gotostep414個(gè)循環(huán)14cycles13返回第4步Gotostep414個(gè)循環(huán)14cycles147230014723001472300

1.2.3 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞的方法，參照文獻(xiàn)[10-12]。在超凈工作臺(tái)中，將洋蔥表皮用手術(shù)刀劃成1 cm×1 cm的方塊，用尖頭鑷子從一角輕輕撕下，于MS培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)24 h，農(nóng)桿菌28 ℃振蕩培養(yǎng)至OD260≈0.6，收集菌液，用等體積MS液體培養(yǎng)基重懸，將洋蔥表皮在重懸液中侵染30 min，用濾紙吸去多余的菌液后，重新接種到鋪有一層濾紙的培養(yǎng)皿中，共培養(yǎng)24 h后，激光共聚焦顯微鏡檢測熒光信號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TAIL-PCR結(jié)果

經(jīng)電泳檢測3輪PCR產(chǎn)物，AD2簡并引物和3條特異引物組合在第3輪PCR產(chǎn)物中有清晰的擴(kuò)增條帶(圖1)，經(jīng)測序，該片段長1185 bp。

表2 PCR擴(kuò)增使用的引物

Table 2 Primers used in PCR amplification

引物Primers引物序列Sequences(5'→3')sp15'-GATTTCCCCCAGAGTTTCCTGCTC-CTCCTTCGTA-3'sp25'-GGGTTTACTGCATTTCATGGGT-GTTTTGCAGATCA-3'sp35'-TCCGTTGAATATGGAGCATGTTT-GAACCCAAGAAT-3'AD15'-NTCGASTWTSGWGTT-3'AD25'-NGTCGASWGANAWGAA-3'AD35'-WGTGNAGWANCANAGA-3'AD45'-TGWGNAGWANCASAGA-3'AD55'-AGWGNAGWANCAWAGG-3'pTkGGPPS-F5'-TGGTCGAGTGAGATGAACC-3'pTkGGPPS-R5'-ATGTTTATCCAGGAAGATA-3'

S: CG; W: AT; B: GTC; D: GAT; V: ACG; N: ACGT.

2.2 橡膠草TkGGPPS基因啟動(dòng)子序列的克隆及分析以橡膠草基因組DNA為模板，以TAIL-PCR的測序結(jié)果設(shè)計(jì)特異引物pTkGGPPS-F和pTkGGPPS-R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測發(fā)現(xiàn)單一的特異條帶(圖2)，與推測的理論值相符。測序發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)物為橡膠草TkGGPPS基因的5′側(cè)翼序列，全長為1131 bp。命名為pTkGGPPS(GenBank登錄號(hào)：KT901796)。

圖1 TAIL-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析Fig.1 Analysis of TAIL-PCR products byagarose electrophoresisM: Trans5K DNA Marker(TaRaKa公司); 1: 第1輪PCR產(chǎn)物; 2: 第2輪PCR產(chǎn)物; 3: 第3輪PCR產(chǎn)物; AD1、AD2、AD3、AD4和AD5: 在TAIL-PCR中, 與特異引物組合的5個(gè)簡并引物。M: Trans5K DNA Marker; 1: Products of primary PCR; 2: Products of the secondary PCR; 3: Products of the tertiary PCR; AD1, AD2, AD3, AD4 and AD5: Five arbitrary degenerate primers in the TAIL-PCR.

圖2 橡膠草pTkGGPPS啟動(dòng)子序列的電泳分析Fig.2 Analysis of TkGGPPS promoter on agarose electrophoresis M: Trans5K DNA Marker; 1-4: TkGGPPS啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物PCR Product of TkGGPPS promoter; -: 陰性Negative.

2.3 橡膠草TkGGPPS基因啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析

經(jīng)啟動(dòng)子分析軟件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE(https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi?lang=en&pj=640&action=page&page=newplace)分析擴(kuò)增得到pTkGGPPS啟動(dòng)子序列(圖3)。分析表明，TkGGPPS基因啟動(dòng)子序列不僅具有植物啟動(dòng)子基本的順式作用元件(CAAT-box和TATA-box)，還有與光、植物激素、逆境脅迫等相關(guān)的順式作用元件，比如I-box(光調(diào)節(jié)響應(yīng)的順式作用元件(cis-acting elements involved in light-regulated responsiveness)、GARE(赤霉素應(yīng)答相關(guān)的元件GA-responsive element)、GT-1 box(病原菌和鹽脅迫響應(yīng)的順式作用元件cis-acting elements Plays a role in pathogen- and salt- induced responsiveness)、W-box(水楊酸誘導(dǎo)響應(yīng)的WRKY結(jié)合位點(diǎn)WRKY binding wite involved in salicylic acid-induced responsiveness)、ACGT-motif(黃化誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件cis-acting elements involved in etiolation-induced responsiveness)和LTRE(低溫應(yīng)答元件low temperature responsive element)等。各個(gè)元件所具有的生物學(xué)功能如表3所示。

2.4 pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP植物表達(dá)載體構(gòu)建

用EcoRⅠ與NcoⅠ雙酶切pMD19-Tector-pTkGGPPS重組質(zhì)粒和pCAMBIA1304質(zhì)粒，結(jié)果如圖4A所示。分別回收目的小片段和載體大片段，將pTkGGPPS小片段與pCAMBIA1304載體大片段用T4-DNA連接酶，16 ℃，連接2 d，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞，涂布到含Kan抗性的LB篩選平板上，過夜培養(yǎng)。經(jīng)PCR檢測和雙酶切雙重鑒定，結(jié)果如圖4B所示。用EcoRⅠ與NcoⅠ雙酶切，有一個(gè)約1131 bp的目的片段和一個(gè)大片段，說明 pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP載體構(gòu)建成功。將鑒定成功的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101，PCR檢測結(jié)果如圖4C所示。

2.5 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

將經(jīng)PCR鑒定成功的陽性單克隆，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，對(duì)洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化(圖5B)，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%蔗糖溶液浸泡30 min發(fā)生質(zhì)壁分離(圖5C)。結(jié)果表明，TkGGPPS基因的啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)GFP基因的表達(dá)，表明該啟動(dòng)子具有活性。

圖3 橡膠草GGPPS啟動(dòng)子序列Fig.3 The promoter sequence of GGPPS in T. kok-saghyz

表3TkGGPPS啟動(dòng)子順式作用元件的生物學(xué)功能分析

Table 3 Biological function analysis of cis-acting element ofTkGGPPSpromoter

調(diào)控元件Regulatoryelement序列Sequence生物學(xué)功能BiologicalfunctionLIPsGAGTGAG光誘導(dǎo)的根特異性順式作用元件。Cis-regulatoryelementinvolvedinlight-inducedroot-specificresponsiveness.TATA-boxTATA據(jù)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)30個(gè)堿基的啟動(dòng)子中心元件。Corepromoterelementaround-30oftranscriptionstart.CCA1-BSAAMAATCTMYB相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。Bindingsitewithmyb-relatedtranscriptionfactor.W-boxTTGAC水楊酸誘導(dǎo)響應(yīng)的WRKY結(jié)合位點(diǎn)。WRKYbindingwiteinvolvedinsalicylicacid(SA)-inducedresponsiveness.GATAboxGATAASF-2結(jié)合位點(diǎn)。ASF-2bindingsite.CACTmotifYACT羧化反應(yīng)響應(yīng)的順式調(diào)控元件。Cis-regulatoryelementinvolvedincarboxylaseresponsiveness.CArGmotifCWWWWWWWWGA/T豐富區(qū)。AlongerA/T-richcore.OSEmotifCTCTT組織特異性元件。Organ-specificelements.I-boxGATAA光調(diào)節(jié)響應(yīng)的順式作用元件。Cis-actingelementsinvolvedinlight-regulatedresponsiveness.MYB1ATWAACCA脫水響應(yīng)相關(guān)的MYB識(shí)別位點(diǎn)。MYBrecognitionsitefoundinthedehydration-responsive.CAAT-box1CAAT啟動(dòng)子和增強(qiáng)子普遍存在的順式作用元件。Commoncis-actingelementsinpromoterandenhancerregion.ARR1-BSNGATT細(xì)胞色素調(diào)節(jié)響應(yīng)的ARR1結(jié)合元件。ARR1-bindingelementinvolvedinthecytokinin-regulatedresponsiveness.GT-1motifGRWAAW光調(diào)節(jié)響應(yīng)的GT-1結(jié)合位點(diǎn)。GT-1bindingsiteinlight-regulatedresponsiveness.CAREsCAACTC赤霉素相應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。Cis-actingelementsnecessaryandsufficientforgibberellin-regulatedresponsiveness.GTGAmotifGTGA后期花粉形成相關(guān)的順式作用元件。Cis-regulatoryelementsinvolvedinlatepollen.GT-1boxGAAAAA病原菌和鹽脅迫響應(yīng)的順式作用元件。Cis-actingelementsPlaysaroleinpathogen-andsalt-inducedresponsiveness.CACT-motifYACTC4植物葉肉組織特異性的順式調(diào)控元件。Cis-Regulatoryelementsformesophyll-specificintheC4plant.Low-CO2GANTTNCCO2響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。Cis-actingelementsinvolvedinCO2-responsive.A-boxTACGTA蔗糖響應(yīng)的順式作用元件。Cis-actingelementsareresponsibleforsugarrepression.ACGT-motifACGT黃化誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件。Cis-actingelementsinvolvedinetiolation-inducedresponsiveness.O2-REGTAC氧氣脅迫響應(yīng)的順式作用元件。Cis-actingelementsinvolvedinoxygen-response.GARETAACAAR赤霉素應(yīng)答相關(guān)的元件。GA-responsiveelement.LTRECCGAAA低溫應(yīng)答元件。Low-temperature-responsiveelement.CircadianCAANNNNATC晝夜節(jié)律順式作用元件。Cis-actingregulatoryelementinvolvedincircadiancontrol.GTACGTAC銅和氧氣響應(yīng)的順式作用元件。Cis-actingregulatoryelementinvolvedcopper-andoxygen-responsive.

圖4 pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP/GV3101植物表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.4 Construction of prokaryotic expression vector of pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP/GV3101 A: pMD19-T-pTkGGPPS質(zhì)粒和pCAMBIA1304質(zhì)粒雙酶切電泳圖 (1～2: pMD19-T-pTkGGPPS質(zhì)粒雙酶切結(jié)果; 3: 陽性質(zhì)粒對(duì); 4～5: pCAMBIA1304質(zhì)粒雙酶切結(jié)果; 6: 陽性質(zhì)粒對(duì)照)；B: pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP質(zhì)粒雙酶切電泳圖 (1～2: pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP質(zhì)粒雙酶切結(jié)果; 3: 陽性質(zhì)粒對(duì)照)；C: pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP/GV3101菌液PCR鑒定電泳圖 (1～14: pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP/GV3101; 15: 陽性對(duì)照; 16: 陰性對(duì)照)。M: Trans5K DNA Marker;A: The electrophoregram of pMD19-T-pTkGGPPS plamid digested (1-2: pMD19-T-pTkGGPPS plasmid through double enzyme cut; 3: The positive plamid; 4-5: pCAMBIA1304 plasmid through double enzyme cut; 6: The positive plamid);B: The electrophoregram of pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP plamid digested (1-2: pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP plasmid through double enzyme cut; 3: The positive plamid);C: PCR electrophoregram of pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP/GV3101(1-14: pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP/GV3101; 15: Positive control; 16: Negative control).

圖5 pTkGGPPS-GFP融合蛋白的活性檢測 Fig.5 Activity detection of pTkGGPPS-GFP fusion protein A: 正常洋蔥表皮細(xì)胞; B: 轉(zhuǎn)染pTkGGPPS-GFP融合基因的洋蔥表皮細(xì)胞; C: 轉(zhuǎn)染pTkGGPPS-GFP融合基因, 經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%蔗糖溶液質(zhì)壁分離后的洋蔥表皮細(xì)胞。A: CK; B: Onion epidermal cells of transfectional pTkGGPPS-GFP fusion gene; C: transfectional pTkGGPPS-GFP fusion gene, after a 40% sucrose solution plasmolysis onion epidermal cells.

3 討論

在分子生物學(xué)的研究中，基因克隆和分子雜交探針的制備等操作常需分離與已知DNA序列相近的未知序列；而TAIL-PCR技術(shù)作為一種用來分離已知序列旁側(cè)的未知序列的一種方法，該技術(shù)簡單易行，反應(yīng)高效靈敏，產(chǎn)物的特異性高，重復(fù)性好，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)獲得目的片段，已經(jīng)成為分子生物學(xué)研究中一項(xiàng)有用的技術(shù)。TAIL-PCR是Liu等[8]1995年設(shè)計(jì)并對(duì)其進(jìn)行不斷發(fā)展完善。Liu等[6,8]用這種方法成功分離了YAC、P1和BAC載體的插入序列和擬南芥T-DNA插入的側(cè)翼序列。梁成真等[13]利用優(yōu)化TAIL-PCR方法，成功地克隆棉花抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子編碼基因。仇艷光等[14]對(duì)TAIL-PCR進(jìn)行改良，并成功地分離小麥基因啟動(dòng)子。啟動(dòng)子作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控中心一直是研究的熱點(diǎn)，獲得具有功能的啟動(dòng)子是研究的基礎(chǔ)。本研究隨機(jī)選取5對(duì)簡并引物，利用改良的TAIL-PCR方法，成功地?cái)U(kuò)增得到橡膠草GGPPS基因5′側(cè)翼序列，其中，引物AD2的特異性較高。

通過分析啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子除含有植物啟動(dòng)子所具有CAAT-box和TATA-box等基本的順式作用元件外，還包括I-box、GARE、W-box、GT-1 box和LTRE等多個(gè)與光、植物激素、逆境脅迫等相關(guān)的順式作用元件。最為重要的是，該啟動(dòng)子具有根、葉肉和胚乳特異性的順式作用元件，這與GGPPS基因主要在根、葉和種子的表達(dá)的結(jié)果相一致[15]。另外，Hefner等[16]研究表明，經(jīng)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后的紅豆杉細(xì)胞GGPPS的RNA水平要明顯高于非誘導(dǎo)的對(duì)照細(xì)胞；化文平等[17]研究表明，SmGGPPS3基因在丹參不同發(fā)育時(shí)期不同器官中表達(dá)差異顯著，同時(shí)受茉莉酸甲酯和病原菌的誘導(dǎo)。這說明該啟動(dòng)子區(qū)域應(yīng)該有茉莉酸甲酯響應(yīng)的順式作用元件或相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，但是該啟動(dòng)子的生物信息學(xué)的預(yù)測并沒有發(fā)現(xiàn)，原因需要做進(jìn)一步的研究。

以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法對(duì)該啟動(dòng)子進(jìn)行活性檢測，結(jié)果表明本研究克隆獲得的啟動(dòng)子具有轉(zhuǎn)錄活性。GGPPS基因在橡膠草中表達(dá)具有組織特異性，該啟動(dòng)子是否是組織特異性啟動(dòng)子，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究利用TALL-PCR成功克隆到橡膠草GGPPS基因5′側(cè)翼序列，大小為1131 bp。利用啟動(dòng)子分析軟件分析，表明該序列不僅含有植物啟動(dòng)子基本的順式作用元件，還包含相應(yīng)逆境、植物激素等順式作用元件。以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因，構(gòu)建融合表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)GFP基因的表達(dá)，說明該啟動(dòng)子具有生物活性。橡膠草中橡膠主要在根部合成，利用該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)橡膠合成相關(guān)功能基因在橡膠草根中過表達(dá)，以提高橡膠合成量，為橡膠草產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)橡膠提供有力的工具。

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Cloning and transient expression of theGGPPSgene promoter from the energy plantTaraxacumkok-saghyz

LI Yong-Mei, FENG Yu-Jie, CAO Xin-Wen, ZHAO Li-Jing, ZHU Jian-Bo, YAN Jie*

CollegeofLifeScience,ShiheziUniversity,Shihezi832000,China

Based on the known sequence ofGGPPS, which encodes geranylgeranyl pyrophosphate synthase, theGGPPSpromoter sequence was amplified from the root of the perennial herbTaraxacumkok-saghyzby thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR) using nested specific primers. Analyses of the full-length 1131-bp fragment by PlantCare and PLACE software showed that the promoter sequence contained basic cis-acting elements, multiple organ-specific expression elements, and a number of stress-relatedcis-acting elements. The promoter sequence was designated as pTkGGPPS (GenBank: KT901796). The plant expression vector pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP was constructed using this sequence to replace the CaMV 35S promoter sequence in the plasmid of pCAMBIA1304 withGFPas the reporter gene. The construct was transformed into onion epidermal cells using Agrobacterium tumefaciens, and the promoter successfully drove expression of the GFP gene. The cloning and transient expression of theGGPPSgene promoter fromT.kok-saghyzprovides a reference for further studies on the mechanisms and tissue-specificity of rubber synthesis.

Taraxacumkok-saghyz;GGPPSgene; TAIL-PCR; promoter; sequence analysis; transient expression

10.11686/cyxb2016034

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-01-21；改回日期：2016-04-28

國家自然科學(xué)基金(No.31360060)資助。

李永梅(1988-)，女，山西呂梁人，在讀碩士。E-mail: liyongmeishzu@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail:jiey@shzu.edu.cn

李永梅, 馮玉杰, 曹新文, 趙李靖, 祝建波, 閆潔. 能源橡膠草GGPPS基因啟動(dòng)子的克隆及瞬時(shí)表達(dá)研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(12): 180-187.

LI Yong-Mei, FENG Yu-Jie, CAO Xin-Wen, ZHAO Li-Jing, ZHU Jian-Bo, YAN Jie. Cloning and transient expression of theGGPPSgene promoter from the energy plantTaraxacumkok-saghyz. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(12): 180-187.