無(wú)脈苔草根際優(yōu)良促生菌鑒定及其作用研究

劉婷，姚拓，陳建綱，馬文彬，劉歡，馬驄毓，蔣永梅

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

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無(wú)脈苔草根際優(yōu)良促生菌鑒定及其作用研究

劉婷，姚拓*，陳建綱，馬文彬，劉歡，馬驄毓，蔣永梅

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

采用鉬藍(lán)比色法(molybdenum blue colorimetry, MBC)、乙炔還原法(acetylene reduction assay, ARA)及高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)測(cè)定了分離自無(wú)脈苔草根際的6株根際促生菌溶磷、固氮及分泌激素的特性，并利用16S rDNA序列分析技術(shù)對(duì)篩選出的2株優(yōu)良促生菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，6株促生菌的溶磷量在298.17～554.67 mg/L之間，其中菌株TPRS3的溶磷能力最強(qiáng)(554.67 mg/L)；6株促生菌中有4株具有固氮能力，固氮酶活性在170.19～456.87 nmol C2H4/(mL·h)之間，菌株TPRS19的固氮能力最強(qiáng)，固氮酶活性為456.87 nmol C2H4/(mL·h)，菌株TRPS3和TPRS12無(wú)固氮能力；6株促生菌均具有分泌植物激素的能力，其中3-吲哚乙酸(IAA)分泌量在8.20～86.36 mg/L范圍內(nèi)，赤霉素(GA3)在26.36～135.90 mg/L范圍內(nèi)，反-玉米素(t-Z)在9.55～141.68 mg/L范圍內(nèi)，菌株TPRS19分泌IAA的能力最強(qiáng)，為86.36 mg/L，菌株TPRS5分泌GA3的能力最強(qiáng)，為135.90 mg/L，菌株TPRS2分泌t-Z的能力最強(qiáng)，為141.68 mg/L，菌株TPRS3、TPRS5、TPRS12和TPRS19兼具分泌3種激素能力。經(jīng)鑒定，菌株TPRS5為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，菌株TPRS19為陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)，這2株菌有望作為研制微生物肥料的優(yōu)良菌株。

無(wú)脈苔草；植物根際促生菌；溶磷；固氮；分泌激素；菌株鑒定

無(wú)脈苔草(Carexenervis)屬于莎草科苔草屬(Carex)植物，其草質(zhì)較為柔軟，蛋白質(zhì)和無(wú)氮浸出物含量較高，馬、牦牛和綿羊均喜采食，為優(yōu)等牧草，同時(shí)由于其返青早、生長(zhǎng)季長(zhǎng)及耐干旱等特點(diǎn)在草坪草的開(kāi)發(fā)利用中具有較大價(jià)值。此外，苔草屬植物因其具有頑強(qiáng)的生命力、極強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)繁殖能力及特殊的生理整合作用而生長(zhǎng)在極其脆弱的生態(tài)環(huán)境中[1]，如高寒草原、高寒冰緣等地[2-3]，對(duì)維持脆弱的生態(tài)環(huán)境起著舉足輕重的作用。甘肅省天?？h地處河西走廊東端，位于青藏高原、黃土高原和內(nèi)蒙古高原的交匯地帶，苔草屬植物是此地典型的高寒草甸牧草。近年來(lái)，受自然氣候以及過(guò)度放牧的影響，使得高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)退化嚴(yán)重，為了緩解這種現(xiàn)象，大量使用化肥已成為提高草產(chǎn)量的必要手段，但是環(huán)境污染、肥效降低等問(wèn)題也隨之產(chǎn)生，使之陷入惡性循環(huán)當(dāng)中，這勢(shì)必危及高原的生態(tài)平衡[4]。因此，探索新的環(huán)保高效肥源，以期部分替代甚至完全替代工業(yè)化肥已經(jīng)迫在眉睫。

植物根系與土壤間進(jìn)行著復(fù)雜而頻繁的物質(zhì)交換，是植物吸收水分和養(yǎng)分的重要組織器官，受根系生長(zhǎng)及分泌物影響，根系范圍環(huán)境的土壤水分、養(yǎng)分、通氣性和pH值等不斷發(fā)生變化，明顯區(qū)別于非根系土壤，而植物根際微生物數(shù)量和種群結(jié)構(gòu)也顯著不同于非根際土壤[5]。自1904年德國(guó)生物學(xué)家Lorenz Hiltner提出了根際(rhizosphere)一詞(指植物根系周圍、受植物根系生長(zhǎng)影響的土壤)，帶動(dòng)了許多學(xué)科對(duì)植物根際微生態(tài)領(lǐng)域的研究，尤其對(duì)植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)的研究較為深入[6]。PGPR是指能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根際微生物的總稱，是指生長(zhǎng)在土壤中或定殖在植物體內(nèi)的一類有益微生物，這類微生物通過(guò)顯著改變土壤中一些不可利用元素的形態(tài)，使之成為更有利于植物吸收的形式，從而改善植物對(duì)某些礦質(zhì)元素的吸收狀況來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)(如固氮菌、溶磷菌、解鉀菌等)，或其自身可以分泌某種化學(xué)物質(zhì)(如激素、有機(jī)酸等)來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)[7]。利用PGPR研制的微生物菌肥更是由于其成本低、效果好、防止土壤污染、保證食品安全等方面有著巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

目前，對(duì)于微生物菌肥的研制以及應(yīng)用已得到廣泛的研究[8-9]，如優(yōu)良促生菌種的篩選、促生機(jī)理的研究及促生特性的測(cè)定等方面[10]，但是在促生菌分泌激素的研究中，大多只研究菌株分泌IAA能力，對(duì)于其他激素的報(bào)道較少，此外，對(duì)于無(wú)脈苔草根際微生物的研究鮮有報(bào)道。為此，本研究以無(wú)脈苔草為對(duì)象，從根際分離促生菌，對(duì)其進(jìn)行促生特性測(cè)定，并利用16S rDNA序列分析技術(shù)對(duì)篩選出的優(yōu)良促生菌種進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用微生物資源提供物質(zhì)和理論依據(jù)，對(duì)于微生物肥料的菌種選育和實(shí)踐生產(chǎn)以及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料和樣地

2015年7月在甘肅省武威市天祝藏族自治縣抓喜秀龍鄉(xiāng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)天祝高山草原試驗(yàn)站(37°40′ N，102°32′ E，海拔2960 m)內(nèi)的不同地點(diǎn)隨機(jī)挑選3株長(zhǎng)勢(shì)良好的無(wú)脈苔草植株。保持植株地上部分的完整，掘出面積為10 cm×10 cm、深度為20 cm的地下部分，裝入無(wú)菌的自封袋中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室并保存在4 ℃冰箱中[11]。在24 h之內(nèi)進(jìn)行菌株的分離和篩選工作。

1.2 優(yōu)良PGPR菌株的分離

抖掉植株根系上附著的虛土，將根系周圍1 cm范圍內(nèi)(根際)的土壤抖落在滅菌的培養(yǎng)皿中。稱取1 g根際土壤加入到裝有9 mL 0.85%生理鹽水(121 ℃、30 min滅菌)的試管中，即為10-1梯度稀釋液。將試管在1000 r/min的漩渦振蕩器上振蕩5 min，靜置20 min后取上清液1 mL重復(fù)上述步驟繼續(xù)稀釋，一直到10-5。將10-3、10-4和10-5的樣品稀釋液用刮刀均勻涂布于PKO(Pikovaskaia’s)[12]固體培養(yǎng)基上，1個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)10 d。挑取在PKO固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)明顯透明圈的菌落進(jìn)行純化并保存。

1.3 菌株溶磷特性測(cè)定

挑取菌落生長(zhǎng)飽滿、溶磷圈明顯的單菌落點(diǎn)接種于PKO固體培養(yǎng)基上，每菌株3個(gè)重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)10 d，期間記錄菌株的生長(zhǎng)情況。10 d后測(cè)量溶磷圈直徑(D)與菌落直徑(d)，通過(guò)對(duì)比D/d的值，篩選出能穩(wěn)定產(chǎn)生透明圈的菌株。將上述篩選出的菌株接種在PKO液體培養(yǎng)基中，每菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以未接種菌株的PKO液體培養(yǎng)基為對(duì)照，在28 ℃、180 r/min的搖床上培養(yǎng)10 d。10 d后將菌株發(fā)酵液在4 ℃、10000 r/min的條件下離心10 min，棄去菌體保留上清液，采用鉬藍(lán)比色法測(cè)定上清液中的有效磷增量[13]。通過(guò)比較溶磷量篩選出溶磷特性較好的菌株，并用LB(Luria-Bertani)[12]斜面培養(yǎng)基保存在4 ℃冰箱中，每個(gè)菌株至少保存5株。

1.4 菌株固氮酶活性測(cè)定

將保存的菌株活化并接種于盛有5 mL半固體NFM(nitrogen free medium)[12]培養(yǎng)基的15 mL血清瓶中，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)，以不接菌的等量培養(yǎng)基為對(duì)照。28 ℃培養(yǎng)2 d后利用乙炔還原法，在無(wú)菌條件下將血清瓶上的棉花塞換成橡膠塞，同時(shí)用無(wú)菌注射器吸出瓶?jī)?nèi)的1 mL混合氣體并快速注入等量的C2H2氣體并密封。繼續(xù)培養(yǎng)2 d后用50 μL的微量進(jìn)樣器從血清瓶中抽取混合氣體并注入氣相色譜儀(Thermo GC7890F)的進(jìn)樣柱中，記錄結(jié)果并計(jì)算菌株的固氮酶活性[14]。

1.5 菌株分泌激素能力測(cè)定

1.5.1 試劑 標(biāo)準(zhǔn)品3-吲哚乙酸(3-indoleacetic acid, IAA)、赤霉素(gibberellin acid, GA3)和反-玉米素(trans-zeatin, t-Z)(均為分析標(biāo)準(zhǔn)品，純度大于98%)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，甲醇為色譜純，購(gòu)自山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司，冰乙酸為色譜純，購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。所有試劑在使用前均用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.5.2 儀器與設(shè)備 Agilent 1260高效液相色譜儀(G2171BA)，752PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)，QF-3800氮?dú)獯蹈蓛x，Agilent Bond Elut C18固相萃取柱(500 mg，6 mL)，0.45 μm親水PTFE針式濾器。

1.5.3 樣品前處理 將活化好的菌株接種于50 mL的LB液體培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在避光條件下置于28 ℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)。3 d后將培養(yǎng)好的菌株發(fā)酵液在4 ℃、10000 r/min的條件下離心10 min，棄去菌體收集上清液。結(jié)合參考文獻(xiàn)[15]的方法并改進(jìn)，將收集的上清液用C18固相萃取柱富集純化，小柱分別用6 mL甲醇溶液和6 mL 10%甲醇溶液進(jìn)行活化，然后將上清液緩慢注入小柱內(nèi)，上樣速度控制在1 mL/min。待上樣完成，用5 mL 10%甲醇溶液淋洗兩次，最后用5 mL 80%甲醇溶液洗脫2次并收集洗脫液。將洗脫液在室溫下氮?dú)獯蹈?，再用甲醇溶解定容? mL離心管中，保存于4 ℃培養(yǎng)箱。

1.5.4 色譜條件 固定相采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5-Micron)，流動(dòng)相采用體積比為2∶3的甲醇-水(含0.2%冰乙酸)二元混合溶劑，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。

1.5.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 結(jié)合參考文獻(xiàn)[15]的方法并改進(jìn)，準(zhǔn)確稱取IAA、GA3和t-Z標(biāo)準(zhǔn)品各10.00 mg左右，分別用流動(dòng)相溶解并定容至10.00 mL，配成1.00 g/L的儲(chǔ)備液。將3種儲(chǔ)備液按1∶1∶1混合后，再用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃下存放(保質(zhì)期1個(gè)月)。

1.6 菌株鑒定

從常規(guī)鑒定和分子生物學(xué)鑒定2個(gè)方面來(lái)篩選優(yōu)良PGPR菌株。

常規(guī)鑒定包括形態(tài)特征和生理生化特性2個(gè)方面，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第八版)》[16]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[17]進(jìn)行鑒定。

分子生物學(xué)鑒定是指利用細(xì)菌16S rDNA序列測(cè)序的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定?？侱NA的提取采用離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司)。擴(kuò)增引物選取16S rDNA擴(kuò)增的通用引物27F-1492R，其序列為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(由華大基因合成)。DNA擴(kuò)增及測(cè)序工作均由華大基因組完成。將測(cè)得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中用megablast進(jìn)行相似性搜索，并與已報(bào)道細(xì)菌菌株的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，并利用MEGA 5.0生物學(xué)軟件構(gòu)建進(jìn)化距離樹(shù)圖，用Neighbor-Joining法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)良PGPR菌株篩選

通過(guò)PKO培養(yǎng)基篩選，從3株苔草根際分離出21株溶磷菌株。對(duì)比D/d的值，進(jìn)而篩選出能穩(wěn)定產(chǎn)生透明圈的菌株13株，最后通過(guò)鉬藍(lán)比色法篩選出溶磷特性較好的菌株6株并編號(hào)。菌株編號(hào)依次為：TPRS2、TPRS3、TPRS5、TPRS10、TPRS12、TPRS19(表1)。

2.2 優(yōu)良PGPR菌株溶磷及固氮特性測(cè)定

對(duì)篩選出的PGPR菌株進(jìn)行溶磷及固氮特性的測(cè)定(表1)。6株P(guān)GPR菌株的溶磷量范圍在298.17～554.67 mg/L之間，各菌株溶磷量差異顯著(P<0.05)，其中菌株TPRS3的溶磷能力最強(qiáng)，溶磷量達(dá)554.67 mg/L；菌株TPRS5和TPRS19的溶磷量次之，但均在500 mg/L以上。菌株TPRS19的固氮酶活性最高，達(dá)456.87 nmol C2H4/(mL·h)；TPRS5次之， 為395.26 nmol C2H4/(mL·h)；菌株TPRS3和TPRS12未檢測(cè)到固氮酶活性。綜合分析，菌株TPRS5和TPRS19溶磷和固氮特性都較好，TPRS10次之，TPRS2最低。菌株TPRS3和TPRS12雖然溶磷量較高，但是它們不具備固氮特性。

2.3 優(yōu)良PGPR菌株分泌激素特性測(cè)定

表1 優(yōu)良促生菌株溶磷及固氮特性

Table 1 Phosphate solubilization and nitrogenase activity of tested plant growth promoting rhizobacteria

菌株編號(hào)StrainscodeD/d值ValueofD/d溶磷量Phosphatesolubilizationcapacity(mg/L)固氮酶活性Nitrogenaseactivity[nmolC2H4/(mL·h)]TPRS21.62±0.47bc380.53±4.11c170.19±4.31dTPRS32.12±1.09a554.67±2.96a-TPRS52.17±0.45a549.94±3.44a395.26±4.98bTPRS101.33±0.98c298.17±8.43d294.04±16.90cTPRS121.70±0.57b452.69±7.88b-TPRS192.11±1.22a547.28±2.58a456.87±15.95a

注：同列不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。
Note: Different miniscules letters in the same column mean significant differences among different stains at the 0.05 level, the same below.

圖1 混合激素標(biāo)準(zhǔn)品的紫外光譜圖Fig.1 The ultraviolet spectrogram of the mixture of hormones standards

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 在190～400 nm的范圍內(nèi)，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。3種植物激素的最大吸收波長(zhǎng)分別為IAA：220、280 nm；GA3：210 nm；t-Z：215、260 nm。以吸光度為縱坐標(biāo)，波長(zhǎng)λ(nm)為橫坐標(biāo)，繪制紫外光譜圖(圖1)?？梢?jiàn)3種組分在波長(zhǎng)為210 nm處都具有比較大的吸收，因此，為了簡(jiǎn)化測(cè)定方法，并得到較為理想的檢測(cè)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)選擇了210 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3.2 流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)采用甲醇—水為流動(dòng)相。有研究表明，以甲醇—水為流動(dòng)相，在水相中不添加任何添加劑時(shí)，無(wú)論怎樣改變甲醇和水的比例，其色譜圖峰形不好且拖尾嚴(yán)重，如果在此基礎(chǔ)上加入一定量的乙酸，就可以抑制溶質(zhì)的離子化，使分離得到改善[18]。實(shí)驗(yàn)選擇了體積比為2∶3的甲醇-水(含0.2%冰乙酸)二元混合溶劑作為流動(dòng)相。

2.3.3 色譜柱柱溫的選擇 將柱溫分別設(shè)定為20、25、30、35、40 ℃，分析3種標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的色譜圖。結(jié)果表明，柱溫對(duì)色譜圖峰型的影響不大，主要影響分離度和保留時(shí)間。溫度升高，色譜峰前移，保留時(shí)間縮短。綜合考慮激素的適宜保存溫度并避免分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)選擇30 ℃作為檢測(cè)柱溫。

圖2 混合激素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.2 Chromatogram of the mixture of hormones standard

在上述選定的色譜條件下，對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢測(cè)(圖2)。從圖2可以看出，3種植物激素可以較好地分離和檢出。

2.3.4 線性關(guān)系考察及檢出限、定量限的測(cè)定 配制不同濃度梯度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液在已建立好的色譜條件下進(jìn)樣分析。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并逐步稀釋，以信噪比(RS/N)為3時(shí)所對(duì)應(yīng)的化合物濃度為檢出限(LOD)，以信噪比(RS/N)為10時(shí)所對(duì)應(yīng)的化合物濃度為定量限(LOQ)。以上結(jié)果均見(jiàn)表2。由表2可知，3種植物激素在各自的線性范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系；3種激素的檢出限為0.08～0.12 mg/L，定量限為0.13～0.21 mg/L，說(shuō)明該方法有較高的靈敏度。

表2 植物激素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

Table 2 Regression equations, correlation coefficients, linear range, limit of detection (LOD) and limits of quantification (LOQ) of the plant hormones

植物激素Planthormones回歸方程Regressionequations相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficient(R2)線性范圍Linearrange(mg/L)檢出限LOD(mg/L)定量限LOQ(mg/L)IAAy=1.0008x+20.2040.99951～1000.100.17GA3y=0.2558x+10.0570.99951～1000.120.21t-Zy=1.002x+33.8850.99921～3000.080.13

2.3.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 通過(guò)向菌株發(fā)酵產(chǎn)物中添加激素標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)計(jì)算回收率。精確量取已知3種激素含量的發(fā)酵液各6份，向其中定量添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按1.5.4的色譜條件進(jìn)行分析，根據(jù)測(cè)定結(jié)果中3種激素的測(cè)得量計(jì)算相應(yīng)的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表3。菌株發(fā)酵產(chǎn)物中的植物激素回收率比較穩(wěn)定，為96.65%～105.77%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.00～2.19。結(jié)果表明上述試驗(yàn)方法準(zhǔn)確度較高，能應(yīng)用于細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物中激素的同時(shí)檢測(cè)分析。

2.3.6 優(yōu)良PGPR菌株3種激素含量測(cè)定 對(duì)6株P(guān)GPR菌株進(jìn)行3種植物激素含量測(cè)定，結(jié)果如表4所示。由表4可知，3種激素含量差異顯著。菌株TPRS2的t-Z含量最高，達(dá)141.68 mg/L，但未能檢測(cè)出GA3。菌株TPRS10只檢測(cè)出GA3，t-Z和IAA均未檢測(cè)出。其余4株菌均能檢測(cè)出3種激素，其中菌株TPRS3的GA3含量最低，且t-Z和IAA的含量都比TPRS5和TPRS19低；菌株TPRS12的t-Z和IAA含量均是最低；菌株TPRS5分泌GA3能力最強(qiáng)；菌株TPRS19分泌t-Z能力僅次于TPRS2，分泌IAA能力最強(qiáng)。綜合分析，菌株TPRS5和TPRS19分泌3種激素的能力均較強(qiáng)，TPRS3和TPRS12次之，TPRS2分泌t-Z和IAA能力較強(qiáng)，但沒(méi)有分泌GA3能力，TPRS10分泌激素能力最差。菌株TPRS5和TPRS19的色譜圖如圖3所示。

2.4 優(yōu)良PGPR菌株的鑒定

通過(guò)對(duì)篩選出的6株優(yōu)良PGPR菌株溶磷、固氮及分泌激素特性的測(cè)定和分析，選取促生特性相對(duì)較好的菌株TPRS5和TPRS19進(jìn)行菌種鑒定。

菌株TPRS5和TPRS19的形態(tài)特征和生理生化特性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5和6。將測(cè)得的2株P(guān)GPR菌株的16S rDNA序列與相近種屬的16S rDNA序列進(jìn)行對(duì)比，用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖4所示。經(jīng)Blast相似性分析，菌株TPRS5序列與Bacillussubtilisstrain BCRC 10058(DQ993674)的同源性達(dá)100%，菌株TPRS19序列與EnterobactercloacaestrainRN2(KC990822)的同源性達(dá)100%。

表3 3種植物激素回收率測(cè)定

Table 3 Recovery tests for 3 plant hormones (n=6)

菌株編號(hào)Strainscode植物激素Planthormones原有量Background(mg/L)添加量Added(mg/L)測(cè)得量Founded(mg/L)回收率Recovery(%)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)TPRS2t-Z148.3310.23155.5998.131.21GA3-10.3710.2598.841.33IAA43.2610.7754.54100.941.55TPRS3t-Z16.3110.2327.33102.982.01GA324.9810.3735.3399.941.98IAA12.5710.7722.5696.661.36TPRS5t-Z76.0510.2388.12102.132.11GA3134.8410.37142.0697.831.52IAA51.6810.7760.3696.651.05TPRS10t-Z-10.2310.35101.171.45GA355.7310.3765.5599.171.47IAA-10.7710.5397.771.00TPRS12t-Z10.0510.2321.45105.772.19GA3112.8910.37123.0599.831.66IAA6.9410.7717.94101.301.75TPRS19t-Z124.9910.23135.2099.991.13GA363.5810.3772.2597.701.00IAA88.4510.77100.3098.922.04

將形態(tài)特征、生理生化特性及分子生物學(xué)鑒定三者結(jié)合起來(lái)，就可以彌補(bǔ)任何一種單一方法的不足，最終可以準(zhǔn)確確定菌株的種屬。綜合分析，確定菌株TPRS5為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，菌株TPRS19為陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)。

3 討論

土壤中磷素水平是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素，我國(guó)土壤耕層的全磷含量很高，但由于存在磷固定現(xiàn)象，土壤中95%以上的磷為無(wú)效磷，植物很難利用[19-20]。如何有效利用土壤中被固定的無(wú)效態(tài)磷，并提高磷肥的使用效率，對(duì)減少農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中磷肥的使用和磷礦資源的消耗有著重要意義。在植物根際存在一類特殊的微生物類群，能將土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的可溶性磷[21]。研究表明,在植物根際存在不同種類的溶磷菌，且溶磷菌溶磷能力差異較大。辛楨凱等[22]研究了溶磷菌的溶磷能力，菌株XH1和XH2溶解磷酸鈣的能力很強(qiáng)，液培7 d后溶磷量為267.08和415.69 mg/L。馮瑞章等[23]測(cè)定苜蓿(Medicagosativa)根際溶磷細(xì)菌菌株Lx191，培養(yǎng)8 d后，溶磷量為154.3 mg/L。劉小玉等[24]從油茶(Camelliaoleifera)根際分泌的溶磷菌株6-Y-09溶磷能力最強(qiáng)，溶磷量為201.38 mg/L。造成溶磷菌溶磷能力差異的主要原因是菌株本身的特性，此外，溶磷機(jī)理的多樣性以及培養(yǎng)條件等也是影響溶磷菌溶磷能力的因素。本研究從苔草根際分離出21株溶磷菌株，利用定性和定量的方法最終篩選出6株溶磷量較高的菌株，溶磷量為298.17～554.67 mg/L，并且利用乙炔還原法測(cè)定溶磷菌株的固氮能力，有4株菌株兼具溶磷和固氮特性，其中菌株TPRS5和TPRS19的溶磷和固氮能力均較強(qiáng)，在后期研制微生物肥料中具有巨大潛力，這與姚拓[25]和李顯剛等[26]的研究結(jié)果相似。

表4 優(yōu)良PGPR菌株3種植物激素含量

Table 4 The contents of 3 plant hormones in tested plant growth promoting rhizobacteria mg/L

菌株編號(hào)Strainscodet-ZGA3IAATPRS2141.68±3.97a-46.67±3.72bTPRS318.28±1.74d26.23±1.48d12.91±1.26cTPRS575.00±5.76c135.90±3.33a52.76±1.45bTPRS10-56.15±5.98c-TPRS129.55±0.46d115.85±6.60b8.20±0.81cTPRS19119.80±8.24b64.13±1.92c86.36±3.26a

注：標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。
Note: Data presented are in means±standard deviation (n=3).

圖3 優(yōu)良根際促生菌的色譜圖Fig.3 Chromatograms of tested plant growth promoting rhizobacterias

表5 菌株的表型特征及革蘭氏染色情況

Table 5 The phenotypic characteristic and gram stain of strains

菌株編號(hào)Strainscode生長(zhǎng)速度Growthrate形狀Shape顏色Colour邊緣Edge濕潤(rùn)度Wettability隆起度Fullnessfactor革蘭氏染色GramstainTPRS5快Fast近圓形Subcircular乳白色Milkiness完整Full濕潤(rùn)Moist凸起HeaveG+TPRS19快Fast圓形Circular淡黃色Lightyellow完整Full濕潤(rùn)Moist平坦SmoothG-

表6 菌株的生理生化特性

Table 6 The physiological-biochemical characteristic of strains

菌株編號(hào)Strainscode接觸酶Catalase氧化酶Oxidase葡萄糖產(chǎn)酸Glucoseproductingacid木糖產(chǎn)酸Xyloseproductingacid木聚糖產(chǎn)酸Xylanproductingacid葡萄糖產(chǎn)氣Glucoseproductinggas明膠水解Gelatinhydrolysis酪朊水解Caseinatehydrolysis淀粉水解Starchhydrolysis檸檬酸鹽利用CitrateutilizationV-P測(cè)定V-Ptest吲哚產(chǎn)生IndoleproducingTPRS5+++++-+++++-TPRS19--+++--++++-

“+”陽(yáng)性Positive；“-”陰性Negative.

圖4 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strains

PGPR中的多數(shù)細(xì)菌具有分泌激素的能力，但分泌量差異較大。李顯剛等[27]利用Salkowski比色法測(cè)定了PGPR菌株分泌IAA的能力，11株溶磷菌株中只有1株沒(méi)有分泌激素能力，菌株LC20分泌IAA含量為42.39 mg/L。雷學(xué)軍等[28]同樣利用比色法測(cè)定了甜高粱根際溶磷菌的分泌IAA能力，結(jié)果表明供試的5株溶磷菌都具有分泌IAA的能力，菌株WD20分泌能力最強(qiáng)，分泌量為27.79 mg/L。目前植物激素的測(cè)定方法主要可以分為生物鑒定法、免疫分析法和色譜分析法三大類[29]。生物鑒定法是一種非常經(jīng)典的檢測(cè)分析法，但它只是一種半定量檢測(cè)法，而且耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)檢測(cè)條件要求嚴(yán)格，一般化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)現(xiàn)。免疫分析法雖然顯示出較低的檢測(cè)限，但是其制備抗體的交叉反應(yīng)問(wèn)題仍未得到解決。目前，色譜法應(yīng)用最廣，可同時(shí)檢測(cè)多種植物激素，且定量準(zhǔn)確[30]。本研究利用HPLC同時(shí)測(cè)定IAA、GA3和t-Z 3種植物激素含量，菌株TPRS19分泌IAA能力最強(qiáng)，菌株TPRS5分泌GA3能力最強(qiáng)，分泌t-Z能力最強(qiáng)的為菌株TPRS2，但是其不具備分泌GA3的能力。造成菌株分泌激素能力差異的原因較多，如菌株種類、生理特性以及培養(yǎng)條件等都會(huì)影響其分泌激素的能力。

16S rDNA序列分析技術(shù)是分類鑒別微生物菌種的有效方法之一，被應(yīng)用于各類菌株遺傳特性和分子差異的分析研究中。應(yīng)用16S rDNA序列分析鑒定技術(shù)可以簡(jiǎn)便、快速、標(biāo)準(zhǔn)地完成菌株鑒定。目前報(bào)道的PGPR的種類達(dá)15個(gè)屬，主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、固氮螺菌屬(Azospirillum)、固氮菌屬(Azotobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligens)、節(jié)桿菌屬(Arthobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、拜葉林克氏菌屬(Beijerinckia)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、埃文氏菌屬(Eriwinia)、黃桿菌屬(Flavobacterium)和巴斯德氏芽菌屬(Pasteuria)[31-33]。本研究中鑒定的兼具溶磷、固氮和分泌激素能力的2個(gè)PGPR菌株分別是枯草芽孢桿菌和陰溝腸桿菌，這2個(gè)種屬于常見(jiàn)的PGPR菌株種類，在PGPR研究中具有重要地位。Paul等[34]在1989年就發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌具有良好的溶磷能力。Anyakwo等[35]通過(guò)研究枯草芽孢桿菌對(duì)鐵礦石的溶磷作用發(fā)現(xiàn)其還具備很強(qiáng)的固氮能力。Selvaraj等[36]通過(guò)對(duì)PGPR菌株的促生特性的研究，證實(shí)了枯草芽孢桿菌除了有溶磷固氮的能力外，還兼具分泌IAA和生防的功能。1991年，Koga等[37]研究了從苜蓿根際分離得到陰溝腸桿菌，并證明其具有溶磷和固氮的能力。顧金剛[38]在2000年從煙草(Nicotianatabacum)根際篩選出一株P(guān)GPR菌株RB-59,經(jīng)過(guò)鑒定為陰溝腸桿菌。覃姚紅[39]通過(guò)對(duì)玉米(Zeamays)種子內(nèi)生固氮菌的研究發(fā)現(xiàn)，菌株5和2-7均為陰溝腸桿菌，將菌株接種小麥(Triticumaestivum)盆栽發(fā)現(xiàn)菌株2-7對(duì)小麥的促生作用最顯著。本研究?jī)H測(cè)定了PGPR菌株的溶磷、固氮和分泌激素能力，對(duì)其生防功能有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

篩選出2株無(wú)脈苔草根際優(yōu)良促生菌株TPRS5和TPRS19，兼具溶磷、固氮和分泌激素特性，經(jīng)16S rDNA序列分析，確定菌株TPRS5為枯草芽孢桿菌，菌株TPRS19為陰溝腸桿菌，為微生物菌肥的研制提供了菌種資源。

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Identification and study on the effects of plant growth promoting rhizobacteria ofCarexenervis

LIU Ting, YAO Tuo*, CHEN Jian-Gang, MA Wen-Bin, LIU Huan, MA Cong-Yu, JIANG Yong-Mei

CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity,KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China

Six plant growth-promoting rhizobacteria were isolated fromCarexenervis. We analyzed the six strains to evaluate their phosphate solubilization (by molybdenum blue colorimetry), nitrogen fixation (by the acetylene reduction assay), and hormone secretion (by high performance liquid chromatography). The two strains with the strongest P solubilization and N fixation abilities were identified by analyses of their 16S rDNA sequences. The results showed that the phosphate solubilization capacity of the six strains ranged from 298.17 to 554.67 mg/L (in strain TPRS3). Four strains were able to fix nitrogen, with nitrogenase activity ranging from 170.19 to 456.87 nmol C2H4/(mL·h) (in strain TPRS19), while strains TPRS3 and TPRS12 lacked nitrogenase activity. All six strains secreted hormones (indole acetic acid (IAA), ranging from 8.20 to 86.36 mg/L; gibberellin (GA3) ranging from 26.36 to 135.90 mg/L; and trans-zeatin (t-Z), ranging from 9.55 to 141.68 mg/L). Strain TPRS19 secreted the largest amount of IAA (86.36 mg/L), strain TPRS5 secreted the largest amount of GA3(135.90 mg/L), and TPRS2 secreted the largest amount of t-Z (141.68 mg/L). Strains TPRS3, TPRS5, TPRS12, and TPRS19 could secrete all three hormones simultaneously. Strain TPRS5 was identified asBacillussubtilisand TPRS19 was identified asEnterobactercloacae. These strains have the potential for use as microbial fertilizers.

Carexenervis; plant growth promoting rhizobacteria; phosphate solubilization; nitrogen fixation; hormone secretion; strain identification

10.11686/cyxb2016026

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-01-20；改回日期：2016-03-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360584)資助。

劉婷(1989-)，女，甘肅武威人，在讀碩士。E-mail: 651885541@qq.com*通信作者Corresponding author. E-mail: yaotuo@gsau.edu.cn

劉婷, 姚拓, 陳建綱, 馬文彬, 劉歡, 馬驄毓, 蔣永梅. 無(wú)脈苔草根際優(yōu)良促生菌鑒定及其作用研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(12): 130-139.

LIU Ting, YAO Tuo, CHEN Jian-Gang, MA Wen-Bin, LIU Huan, MA Cong-Yu, JIANG Yong-Mei. Identification and study on the effects of plant growth promoting rhizobacteria ofCarexenervis. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(12): 130-139.