天蠶素A-馬蓋寧雜合肽對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生理代謝影響的研究

劉二強(qiáng), 陳香君, 回麗媛, 朱明星, 王秀青*

(1．兵器工業(yè)北京北方醫(yī)院,北京 100089;2.寧夏醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué) 科技中心，寧夏 銀川 750004)

天蠶素A-馬蓋寧雜合肽對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生理代謝影響的研究

劉二強(qiáng)1, 陳香君2, 回麗媛2, 朱明星3, 王秀青2*

(1．兵器工業(yè)北京北方醫(yī)院,北京 100089;2.寧夏醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué) 科技中心，寧夏 銀川 750004)

研究天蠶素A-馬蓋寧雜合肽作用耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)后對(duì)細(xì)胞生理代謝的影響。利用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定雜合肽作用MRSA后對(duì)DNA、RNA、總蛋白、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶的影響，利用溶氧電極測(cè)定雜合肽對(duì)細(xì)胞呼吸作用的影響，通過(guò)生物發(fā)光分析儀檢測(cè)雜合肽作用細(xì)胞后ATP生產(chǎn)的變化。結(jié)果顯示，雜合肽作用MRSA后對(duì)細(xì)胞DNA、RNA、總蛋白的合成能力均出現(xiàn)抑制作用。β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶的表達(dá)活性同樣受到了明顯的抑制。雜合肽作用細(xì)胞后呼吸作用明顯下降，ATP生產(chǎn)能力受到抑制。雜合肽作用細(xì)胞后抑制了胞內(nèi)部分生物大分子的合成能力、胞內(nèi)酶的表達(dá)活性及細(xì)胞的能量代謝功能，通過(guò)胞內(nèi)機(jī)制發(fā)揮了抑菌作用。

天蠶素A-馬蓋寧；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；生理代謝；生物大分子；抗菌肽

抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是廣泛存在于自然界生物體內(nèi)的一類小分子多肽，由特定基因編碼產(chǎn)生，作為生物機(jī)體天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，能夠抵御病原體的侵害[1-2]?？咕膶?duì)細(xì)菌、真菌、病毒以及癌細(xì)胞等具有良好的生物活性。因其不易產(chǎn)生耐藥性，具有熱穩(wěn)定性和較好的水溶性，對(duì)高等動(dòng)物正常細(xì)胞幾乎無(wú)毒害作用而顯示出強(qiáng)大的抗菌應(yīng)用前景，有望作為新一代抗菌藥物替代傳統(tǒng)抗生素。自20世紀(jì)70年代瑞典科學(xué)家Boman等[3]首次在天蠶血淋巴中發(fā)現(xiàn)抗菌肽以來(lái)，抗菌肽一直成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[4]，并在各種生物中發(fā)現(xiàn)了大量的抗菌肽。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)在金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)感染中所占的比例越來(lái)越高，據(jù)相關(guān)報(bào)道，部分地區(qū)高達(dá)70%以上[5]，目前已經(jīng)成為醫(yī)院感染的重要致病菌之一。由于MRSA對(duì)于常用抗菌藥物存在較高的耐藥率，臨床治療MRSA感染成為目前感染治療的難點(diǎn)之一。因此越來(lái)越多的科研工作者尋求更為有效的抗菌肽，研究抗菌肽對(duì)MRSA的作用機(jī)制，以期能夠盡早應(yīng)用于臨床感染治療領(lǐng)域。天蠶素A-馬蓋寧(CecA-Mag)是由抗菌作用較強(qiáng)的兩種陽(yáng)離子小肽天蠶素A(CecropinA)和馬蓋寧(Magainin)雜合而成。研究者前期選用了天蠶素A成熟肽段1～7以及馬蓋寧2～12的氨基酸序列(GenBank上序列號(hào)分別為X06672和J03193)，選用酵母偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)CecA-Mag雜合肽基因。雜合肽體外試驗(yàn)顯示，其對(duì)G+及G-菌均具有良好的抑菌效果[6]，對(duì)臨床分離出的MRSA菌株亦有良好的抑殺活性。課題組前期在雜合肽殺傷MRSA機(jī)制研究中，發(fā)現(xiàn)雜合肽可以改變細(xì)胞膜的通透性[7]，并且能夠進(jìn)入胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)累積，同時(shí)可以與核酸分子結(jié)合。大量研究結(jié)果表明，多數(shù)抗菌肽存在胞內(nèi)殺傷機(jī)制，抗菌肽在細(xì)胞內(nèi)累積，并干擾細(xì)胞正常代謝，通過(guò)抑制DNA、RNA、蛋白質(zhì)合成，或抑制胞內(nèi)酶活性，達(dá)到抑制、殺滅細(xì)菌的目的。本研究在雜合肽處理MRSA后，通過(guò)對(duì)DNA、RNA、總蛋白合成能力的測(cè)定，胞內(nèi)酶表達(dá)活性的變化，以及細(xì)胞呼吸作用、ATP生產(chǎn)能力的變化測(cè)定，研究了雜合肽存在的情況下對(duì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝的影響情況，探討了雜合肽對(duì)MRSA胞內(nèi)物質(zhì)的影響作用機(jī)制，進(jìn)一步明確了雜合肽通過(guò)引起MRSA胞內(nèi)生物大分子的表達(dá)變化，發(fā)揮胞內(nèi)抑菌機(jī)制，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 天蠶素A-馬蓋寧雜合肽 雜合肽由上海楚肽生物科技有限公司采用固相化學(xué)合成法合成，Purity(HPLC)純度≥95%。ddH2O作為溶解雜合肽的溶劑，0.22 μm濾器過(guò)濾[8]。

1.1.2 菌種來(lái)源 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株為臨床菌株，由寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 ①M(fèi)H培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司);②M9乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基：Na2HPO4·7H2O 1.28 g，KH2PO40.3 g，NaCl 0.05 g，NH4Cl 0.1 g，MgSO40.05 g，CaCl20.001 g，乳糖 0.5 g，溶于100 mL超純水。

1.1.4 主要試劑和儀器 細(xì)菌DNA提取試劑盒，美國(guó)Omega公司；細(xì)菌RNA提取試劑盒，北京天根公司；BCA蛋白定量試劑盒，北京康為世紀(jì)公司；鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、對(duì)硝基苯磷酸二鈉(PNPP)，美國(guó)Amersco公司；溶葡萄球菌素、蟲熒光素(luciferin)與蟲熒光素酶(luciferase)、5′-三磷酸腺苷(ATP)二鈉鹽水合物，美國(guó)sigma公司；Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher公司；O2微電極(OX50)，丹麥Unisense公司；濱松生物發(fā)光分析儀，北京濱松光子公司。

1.2 方法

1.2.1 雜合肽作用MRSA后對(duì)細(xì)胞DNA合成能力的影響 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MRSA菌液4 000×g離心5 min，PBS洗滌離心后，用新鮮的 MH培養(yǎng)基重懸至 1×108cfu/mL，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)5個(gè)平行。35 ℃、220 r/min培養(yǎng)8 h后，分別加入 100 μL經(jīng)ddH2O稀釋的雜合肽溶液，混勻后，使雜合肽的終濃度分別為1×MIC和3×MIC。以加入100 μL純水作為陰性對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)30、60、90、120、150、180、210 min后，4 000×g離心5 min，去上清[9]。利用Omega 細(xì)菌DNA提取試劑盒提取MRSA基因組DNA，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)量提取DNA樣本的OD260及OD280[10]，OD260值為1相當(dāng)于大約50 μg/mL雙鏈 DNA，OD260/OD280比值為1.7～1.9時(shí)，表示DNA純度較高。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取其平均值。

1.2.2 雜合肽作用MRSA后對(duì)細(xì)胞RNA合成能力的影響 取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MRSA菌液4 000 g離心5 min，用PBS洗滌離心后，用新鮮的MH培養(yǎng)基重懸菌體至1×108cfu/mL,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)5個(gè)平行。35 ℃、220 r/min培養(yǎng)8 h后，分別加入100 μL雜合肽溶液，混勻后，使雜合肽的終濃度分別為1×MIC和3×MIC。以加入100 μL純水作為陰性對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)0、30、60、90、120、150、180、210 min后，4 000×g離心5 min，去上清。利用Omega 細(xì)菌RNA提取試劑盒提取MRSA 總RNA。提取出的RNA溶液用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)OD260及OD280，OD260/OD280比值在 1.8～2.0 視為抽提的 RNA 純度較高。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取其平均值[11]。

1.2.3 雜合肽作用MRSA后對(duì)細(xì)胞總蛋白合成能力的影響 取25 μL蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋至100 μL，使終濃度為0.5 mg/mL。將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)孔中，加PBS補(bǔ)足到20 μL，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定A562，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照試劑盒說(shuō)明書，配制適量BCA工作液。雜合肽處理0、30、60、90、120、150、180、210 min后的菌液離心，棄上清，PBS洗滌。分別加入100 μL TE緩沖液和5 μL溶葡萄球菌素(1 mg/mL)，37 ℃溫育10 min。取出置冰浴中，分別加入400 μL冰純水和500 μL冰冷的20%三氯乙酸(TCA)，混勻冰浴5 min。離心，去上清，加入200 μL冰冷的PBS重懸。分別取20 μL重懸液各3管到96孔板的樣品孔中，各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min，冷卻至室溫，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定A562。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度[12]。

1.2.4 雜合肽作用MRSA后對(duì)β-半乳糖苷酶表達(dá)活性的影響 取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的MRSA菌液，用PBS洗滌4 000 g離心5 min，M9乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至加入25 mL M9 乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中，35 ℃振蕩誘導(dǎo)5 h后離心。用M9 乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸至1×108cfu/mL，加入100 μL雜合肽溶液，使肽終濃度分別為1×MIC和3×MIC。以加入100 μL ddH2O作為陰性對(duì)照。35 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)0、30、60、90、120、150、180、210 min后，離心收集，用500 μL TE緩沖液重懸后加入2 μL溶葡萄球菌素(1 mg/mL)，37 ℃溫浴10 min，再置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中，冰浴，15 kHz超聲波處理3 min，4 ℃離心，取上清液400 μL，加入800 μL β-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液(NaCl 0.8 g，KCl 0.02 g，Na2HPO4·12H2O 0.29 g，KH2PO40.024 g，MgSO4·7H2O 0.025 g，β-硫基乙醇 0.39 g，超純水溶解至100 mL)，再加入400 μL 10 mg/mL 鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)充分混勻后，37 ℃溫浴30 min，加入400 μL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm 處的OD值[13]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取其平均值。

1.2.5 雜合肽作用MRSA后對(duì)堿性磷酸酶表達(dá)活性的影響 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MRSA菌懸液4 000 g離心5 min，PBS洗滌，新鮮MH培養(yǎng)基重懸菌沉淀至1×108cfu/mL。取菌懸液，加入雜合肽溶液50、180、210 min后，離心收集，用500 μL TE緩沖液重懸后加入2 μL溶葡萄球菌素(1 mg/mL)，37 ℃溫浴10 min，再置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中，冰浴，15 kHz超聲波處理3 min，4 ℃離心，取上清液400 μL，加入800 μL 2 mol/L乙二醇胺緩沖液(乙二醇胺10 mL，MgCl2·6H2O 102 mg，50 mL超純水溶解，濃鹽酸調(diào)pH至10.0)，再加入400 μL 10 mg/mL對(duì)硝基苯磷酸二鈉(pNPP)，充分混勻后，37℃溫浴30 min，加入400 μL 1 mol/L NaOH終止反應(yīng)，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm 處的OD值[14]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取其平均值。

1.2.6 雜合肽作用MRSA后對(duì)細(xì)胞呼吸作用的影響 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MRSA菌懸液4 000 g離心5 min，用PBS洗滌后，新鮮的MH培養(yǎng)基重懸菌沉淀至1×108cfu/mL。在菌懸液中加入100 μL雜合肽溶液，使肽終濃度分別為1×MIC和3×MIC，37 ℃振蕩培養(yǎng)。以加入100 μL ddH2O作為陰性對(duì)照。本研究采用O2微電極(OX50)測(cè)量菌液中0、10、20、30、40、50、60 min時(shí)溶氧率的變化[15]。將初始時(shí)刻菌懸液中的溶氧率作為100%，空氣測(cè)定值為0%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取其平均值。

1.2.7 雜合肽作用MRSA后對(duì)細(xì)胞ATP生產(chǎn)的影響 ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：ddH2O稀釋ATP標(biāo)準(zhǔn)品，在96孔板中加入10 μL終濃度為0、20、40、60、80、100 pmol/L的ATP標(biāo)準(zhǔn)品，再加入50 μL 蟲熒光素-蟲熒光素酶混合物(50 mmol/L甘氨酸，0.15 mmol/L蟲熒光素，0.2 mg/mL蟲熒光素酶，1 mmol/L tris，0.55 mmol/L EDTA, 0.1% BSA，0.1%疊氮化鈉，pH 7.6)，濱松生物發(fā)光分析儀檢測(cè)發(fā)光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MRSA菌液，PBS洗滌，新鮮MH培養(yǎng)基重懸菌沉淀至1×108cfu/mL。在菌懸液中加入100 μL的雜合肽溶液，使肽終濃度分別為1×MIC和3×MIC。以加入100 μL ddH2O作為陰性對(duì)照。37 ℃處理0、10、20、30、40、50、60 min后，離心收集菌體，ddH2O重懸后加入0.05%苯扎溴銨和1 mmol/L MgCl2，室溫作用3 min后置冰上備用。取熒光素-熒光素酶混合液150 μL于96孔板中，加入50 μL 苯扎溴銨處理的樣本，濱松生物發(fā)光分析儀檢測(cè)發(fā)光值，計(jì)算ATP量[16]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取其平均值。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 所得數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜合肽作用MRSA后對(duì)細(xì)胞DNA合成能力的影響

雜合肽對(duì)MRSA DNA合成的影響如圖1所示。以純水作為陰性對(duì)照組的結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)DNA的合成量總體呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明胞內(nèi)DNA正常合成，細(xì)菌正常繁殖。在菌液中加入雜合肽后，基因組DNA合成量在30 min內(nèi)繼續(xù)升高，30 min后總體呈下降趨勢(shì)，90 min后DNA的合成被明顯抑制。與1×MIC濃度相比，3×MIC濃度的雜合肽對(duì)DNA合成的抑制作用更強(qiáng)。

圖1 雜合肽對(duì)MRSA DNA合成能力的影響Fig.1 The influence of peptides on the synthesis of bacterial DNA *與對(duì)照組比較P<0.05～0.01；**與對(duì)照組比較P<0.01；下圖同 *compared with control group, P<0.05～0.01;**compared with control group, P<0.01；Same figure

2.2 雜合肽作用MRSA后對(duì)細(xì)胞RNA合成能力的影響

雜合肽作用MRSA后對(duì)RNA合成能力的影響如圖2所示。以純水作為陰性的對(duì)照組中，RNA的合成量隨時(shí)間呈穩(wěn)定上升趨勢(shì)，說(shuō)明細(xì)菌正常繁殖代謝，RNA的量也在不斷增多。加入雜合肽后，細(xì)菌RNA合成量明顯降低。3×MIC濃度的雜合肽組，30 min后明顯受到抑制 ，1×MIC濃度的雜合肽處理組60 min后同樣能夠明顯抑制RNA的合成。3×MIC濃度的雜合肽組對(duì)RNA合成能力的抑制作用比1×MIC濃度的抑制效果更強(qiáng)。

圖2 雜合肽對(duì)MRSA RNA合成能力的影響Fig.2 The influence of peptides on the synthesis of bacterial RNA

2.3 雜合肽作用MRSA后對(duì)細(xì)胞總蛋白合成能力的影響

雜合肽作用MRSA后對(duì)細(xì)菌總蛋白合成能力的影響如圖3所示。在純水作為陰性對(duì)照的對(duì)照組中，蛋白的合成量呈現(xiàn)穩(wěn)步上升趨勢(shì)，細(xì)菌胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程是正常的進(jìn)行。加入雜合肽后，不同濃度組的蛋白合成量均出現(xiàn)明顯下降，并沒(méi)有像DNA組出現(xiàn)滯后期，并且下降速度更快，尤其是3×MIC濃度組在30 min后即明顯抑制了蛋白質(zhì)的合成(P<0.01)。1×MIC濃度組同樣能夠明顯抑制總蛋白的合成能力。

圖3 雜合肽對(duì)MRSA總蛋白 合成能力的影響Fig.3 The influence of peptides on the synthesis of bacterial total protein

2.4 雜合肽作用MRSA細(xì)菌后對(duì)β-半乳糖苷酶表達(dá)活性的影響

乳糖存在的條件下誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，該酶可水解鄰-硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)，生成黃色的鄰-硝基苯酚(ONP)，ONP在波長(zhǎng)405 nm處有最大吸收峰，可以根據(jù)OD405值的變化反映堿性磷酸酶的表達(dá)活性。由圖4所示OD405的變化可以看出，以純水作為陰性對(duì)照的對(duì)照組中，β-半乳糖苷酶的表達(dá)活性隨時(shí)間呈穩(wěn)步上升趨勢(shì)。雜合肽處理組，無(wú)論是1×MIC還是3×MIC組，均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)β-半乳糖苷酶表達(dá)活性逐步下降，3×MIC濃度組在60 min時(shí)出現(xiàn)明顯的抑制酶活現(xiàn)象并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用更加強(qiáng)烈，1×MIC濃度組在120 min內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)明顯的抑制效果，但120 min后同樣出現(xiàn)了對(duì)β-半乳糖苷酶表達(dá)活性明顯的抑制作用。

圖4 雜合肽對(duì)MRSA β-半乳糖苷酶表達(dá)活性的影響Fig.4 nhibition of β-galactosidase activities of MRSA cells by antibacterial peptides

2.5 雜合肽作用細(xì)菌后對(duì)堿性磷酸酶表達(dá)活性的影響

堿性磷酸酶可以催化對(duì)硝基苯磷酸二鈉(pNPP)水解產(chǎn)生黃色的對(duì)硝基苯酚(pNP)，pNP在波長(zhǎng)405 nm處有最大吸收峰，可以根據(jù)OD405的值反映堿性磷酸酶的表達(dá)活性。雜合肽處理MRSA后對(duì)堿性磷酸酶的表達(dá)活性影響如圖5所示，以純水作為陰性對(duì)照的對(duì)照組，堿性磷酸酶的表達(dá)持續(xù)增加。與β-半乳糖苷酶的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，雜合肽抑制了堿性磷酸酶的表達(dá)，3×MIC組較1×MIC組抑制程度更強(qiáng)。雜合肽抑制了胞內(nèi)兩個(gè)重要酶β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶的表達(dá)活性，同時(shí)這與雜合肽抑制蛋白合成能力的結(jié)果是一致的。

圖5 雜合肽對(duì)MRSA堿性磷酸酶表達(dá)活性的影響Fig.5 Inhibition of alkaline phosphatase activities of MRSA cells by antibacterial peptides

2.6 雜合肽作用細(xì)菌后對(duì)細(xì)胞呼吸作用的影響

雜合肽作用細(xì)菌后對(duì)細(xì)胞呼吸作用的影響如圖6所示，與以純水作為對(duì)照的對(duì)照組相比，3×MIC濃度組處理的菌懸液中溶氧率明顯高于對(duì)照組，而且從20 min開(kāi)始即出現(xiàn)了明顯的差異，說(shuō)明3×MIC濃度組的雜合肽顯著的抑制了細(xì)胞的呼吸作用，使菌懸液中溶解的氧消耗減慢。1×MIC濃度組處理的菌懸液中溶氧率與對(duì)照組相比，前50 min內(nèi)未出現(xiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，60 min時(shí)則出現(xiàn)明顯差異。雜合肽在更高的濃度范圍對(duì)細(xì)胞呼吸作用的抑制作用更為強(qiáng)烈。

圖6 雜合肽對(duì)MRSA呼吸作用的影響Fig.6 The effect of antimicrobial peptides on oxygen consumption of MRSA

2.7 雜合肽作用細(xì)菌后對(duì)細(xì)胞ATP生產(chǎn)的影響

ATP生物發(fā)光法的原理就是在熒光素酶和Mg2+的作用下，熒光素與ATP發(fā)生腺苷?；换罨?，活化后的熒光素與熒光素酶相結(jié)合，化學(xué)能轉(zhuǎn)化成光能，檢測(cè)的熒光值強(qiáng)度與ATP濃度成一定比例關(guān)系。雜合肽處理MRSA后對(duì)堿性磷酸酶的表達(dá)活性影響如圖7所示，與對(duì)照組相比，3×MIC濃度組在處理細(xì)菌20 min后ATP的生產(chǎn)量即出現(xiàn)明顯的抑制，40 min后抑制作用更為明顯。1×MIC濃度組則在30 min時(shí)出現(xiàn)對(duì)ATP的生產(chǎn)明顯抑制。不同濃度組對(duì)ATP的生產(chǎn)均出現(xiàn)不同程度的抑制，且高濃度組受到的抑制更明顯。

圖7 雜合肽對(duì)MRSA ATP生產(chǎn)的影響Fig.7 The effect of antimicrobial peptides on the ATP content of MRSA

3 討 論

目前研究證明大部分抗菌肽通過(guò)破壞靶細(xì)胞膜的完整性而導(dǎo)致微生物死亡[17]，但在某些情況下，微生物在抗菌肽造成細(xì)胞膜膜滲漏的同時(shí)，仍能長(zhǎng)期生存，說(shuō)明膜的破壞并不是靶細(xì)胞死亡的全部機(jī)制[18-19]。越來(lái)越多的研究結(jié)果證明抗菌肽還存在胞內(nèi)作用機(jī)制[20]，抗菌肽能夠穿透細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，通過(guò)抑制胞內(nèi)正常的生理代謝功能，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。Hao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽buforinⅡ并不引起大腸埃希菌細(xì)胞質(zhì)膜破裂，而是穿透細(xì)胞膜后進(jìn)入胞內(nèi)，與DNA和RNA結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。抗菌肽indolicidin及其衍生物能夠完全抑制大腸埃希菌DNA和RNA的合成，對(duì)總蛋白合成能力則沒(méi)有造成影響[22-23]，而在更高的抗菌肽濃度下則顯著抑制蛋白質(zhì)的合成，而且觀察到細(xì)菌細(xì)胞膜的變化和胞內(nèi)容物的泄漏[24]?？咕腜R-39能夠抑制大腸埃希菌DNA、RNA和總蛋白的合成。本研究表明，天蠶素A-馬蓋寧雜合肽能夠抑制MRSA的DNA、RNA和總蛋白的合成能力。雜合肽沒(méi)有首先抑制DNA的合成功能可能是因?yàn)殡s合肽與DNA的特殊結(jié)合方式，也可能是雜合肽首先影響到DNA復(fù)制相關(guān)的酶類或者其他與復(fù)制相關(guān)的分子，導(dǎo)致DNA可以繼續(xù)完成部分的復(fù)制功能[20]；另外雜合肽與DNA的結(jié)合有可能類似于抗原抗體反應(yīng)，存在最佳計(jì)量結(jié)合狀態(tài)。雜合肽迅速抑制了RNA的合成，一方面是雜合肽與RNA結(jié)合，另一方面可能是雜合肽結(jié)合到了影響轉(zhuǎn)錄的功能區(qū)域上。雜合肽對(duì)蛋白的合成表現(xiàn)出明顯的抑制作用，高濃度的肽抑制蛋白合成的能力比低濃度的肽強(qiáng)。雜合肽結(jié)合核糖體RNA后會(huì)首先影響到總蛋白的合成，這能夠解釋雜合肽處理細(xì)菌后總蛋白合成的下降。

抗菌肽可與細(xì)菌的胞內(nèi)酶結(jié)合，通過(guò)抑制胞內(nèi)酶的活性，達(dá)到抑菌的效果。Vincent等[25]研究表明，細(xì)菌素Microcin J25能夠與胞內(nèi)的RNA聚合酶結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致底物不能與酶的活性中心結(jié)合，抑制RNA聚合酶的活性。又有研究表明，富含脯氨酸的抗菌肽L-pyrrhocoricin、Drosocin可以降低大腸埃希菌中β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶的表達(dá)活性，通過(guò)胞內(nèi)機(jī)制發(fā)揮抑菌作用[26]。天蠶素A-馬蓋寧雜合肽作用MRSA后，胞內(nèi)酶β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶的表達(dá)活性均下降，這可能是雜合肽抑制了酶的表達(dá)量或抑制了酶的活性中心，以發(fā)揮抑菌效果。

抗菌肽死亡素thanath可以通過(guò)抑制細(xì)菌的呼吸作用導(dǎo)致細(xì)菌死亡[18]。也有研究表明，Microcin J25可以改變氧的消耗速率[25]。人唾液抗菌蛋白富組蛋白histatin能夠?qū)е掳咨钪榫侨芫缘腁TP損失，進(jìn)而抑制呼吸作用，產(chǎn)生活性氧自由基，最終導(dǎo)致其死亡[27]。MRSA細(xì)胞呼吸鏈在細(xì)胞質(zhì)膜上，前期研究證明天蠶素A-馬蓋寧雜合肽可以引起細(xì)胞膜通透性的改變[7]，但雜合肽可以在細(xì)胞膜發(fā)生破壞之前或同時(shí)，通過(guò)作用于細(xì)胞質(zhì)膜，破壞質(zhì)膜上呼吸鏈電子傳遞的完整性，阻斷內(nèi)膜上的氧化酶系統(tǒng)氧化磷酸化過(guò)程，而抑制細(xì)菌的呼吸作用。細(xì)菌的呼吸作用可能是細(xì)菌代謝過(guò)程中抗菌肽發(fā)揮抑菌作用的重要靶點(diǎn)，其深入的抑菌機(jī)制也將是我們下一步研究的方向?？咕目梢酝ㄟ^(guò)阻斷胞內(nèi)的多條代謝途徑，發(fā)揮殺傷作用，從而抑制、殺滅細(xì)菌。由于抗菌肽對(duì)細(xì)菌存在多個(gè)作用靶點(diǎn)，使其不易產(chǎn)生耐藥性，而有望成為新一代抗菌藥物或輔助治療藥物。

天蠶素A-馬蓋寧雜合肽作用于MRSA后可以抑制細(xì)胞DNA、RNA、總蛋白的合成能力，抑制胞內(nèi)酶的活性和細(xì)胞能量代謝功能，通過(guò)阻斷細(xì)菌胞內(nèi)多條代謝途徑，干擾細(xì)胞的正常生理代謝，發(fā)揮胞內(nèi)殺傷作用，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)、殺滅細(xì)菌。

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Effect of CecropinA-Magainin Hybrid Peptide in Physiological Metabolism of Methicillin-ResistantStaphylococcusaureus

LIU Er-qiang1, CHEN Xiang-jun2, HUI Li-yuan2, ZHU Ming-xing3, WANG Xiu-qing2

(1.BeijingNorthernHosp.ofWeaponryIndust,Beijing100089; 2.Inst.ofClinic.Lab.ofMed.,3.Sci. &Technol.Ctr.,NingxiaMed.Uni.,Yinchuan750004)

The effect of cecropin A-magainin heterozygous peptide in physiological metabolism of methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA) was studied. The effect of DNA, RNA, total protein, β-galactosidase, alkaline phosphatase after the reaction of the heterozygous peptide were determined with holo-wave length ELISA instrument. The respiration of the cell was determined using dissolve oxygen electrode. The variation of the cell ATP production was examined with bioluminescence analyzer. The results showed that the synthetic abilities of DNA, RNA, total protein decreased after treated with heterozygous peptide were inhibited. And the expression ability of β-galactosidase, alkaline phosphatase was significantly inhibited. Therefore, after treated with heterozygous peptide the intracellular synthetic abilities of macro-molecules, the expression activities of intracellular enzymes, and the energy metabolism of the cell was inhibited of biological, and play the inhibition role through intracellular mechanism.

cecropin A-magainin; methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA); physiological metabolism; biomacromolecule; antimicrobial peptides

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360622)

劉二強(qiáng) 男，碩士研究生。研究方向?yàn)榕R床病原微生物與分子診斷學(xué)。E-mail:kku6666@163.com

* 通訊作者。女，博士，碩士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)榕R床病原微生物與分子診斷學(xué)。Tel：0951-4083334，E-mail:xiuqingwang1979@163.com

2015-09-07；

2015-09-28

Q936

A

1005-7021(2016)05-0044-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.008