抗菌肽Lfcin15-Me8 分子設(shè)計(jì)及對老年呼吸道致病菌銅綠假單胞菌的抑菌性能分析

趙春雨， 趙曉宇， 李 響， 袁海峰 ， 鄭艷賀

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 附屬第四醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001;2.黑龍江省科學(xué)院 自然與生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江省科學(xué)院 高技術(shù)研究院，黑龍江 哈爾濱 150020;4.黑龍江省科學(xué)院 微生物研究所，黑龍江 哈爾濱 150010)

抗菌肽Lfcin15-Me8 分子設(shè)計(jì)及對老年呼吸道致病菌銅綠假單胞菌的抑菌性能分析

趙春雨1， 趙曉宇3，4*， 李 響1， 袁海峰2， 鄭艷賀1

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 附屬第四醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001;2.黑龍江省科學(xué)院 自然與生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江省科學(xué)院 高技術(shù)研究院，黑龍江 哈爾濱 150020;4.黑龍江省科學(xué)院 微生物研究所，黑龍江 哈爾濱 150010)

探討人工設(shè)計(jì)合成的Lfcin15-Me8分子對老年病患者中銅綠假單胞菌抑菌活性研究。從老年病患痰液中分離鑒定銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)感染情況，截取牛乳鐵蛋白素(LfcinB)1-15和蜂毒素(Melittin)1-8核心氨基酸序列，固相合成新型抗菌肽分子，采用微量肉湯稀釋法，測定新型抗菌肽分子對臨床分離菌株的抑菌活性。結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌占院內(nèi)感染的32.2%，位列致病菌第二位。合成的新型抗菌肽分子Lfcin15-Me8，為陽離子型抗菌肽，并富含α-螺旋。對臨床銅綠假單胞菌抑菌MIC值均達(dá)到128 μg/mL以下，其中最低達(dá)到32 μg/mL，具有良好抗菌活性。銅綠假單胞菌在老年呼吸道感染中占較大比重，需注意防控，人工合成的Lfcin15-Me8分子可抑制臨床銅綠假單胞菌的生長繁殖。

老年病；呼吸系統(tǒng)；銅綠假單胞菌；抗菌肽

目前，感染性疾病是全球第二致死的疾病[1]，銅綠假單胞菌可導(dǎo)致患者發(fā)生呼吸道感染，甚至導(dǎo)致患者死亡[2]。銅綠假單胞菌出現(xiàn)的多重感染，臨床治療極為困難[3]，研發(fā)區(qū)別于傳統(tǒng)抗菌機(jī)制的藥物，來控制微生物耐藥性的問題迫在眉睫[4]。2009年全球銷售的抗生素比過去5年年均增長4%[5]，抗生素濫用，耐藥菌株不斷涌現(xiàn)，而新抗生素的發(fā)現(xiàn)卻越來越少[6-7]?？咕?AMPs)是保守的具有天然免疫功能的活性分子[8-9]，具有靶向作用細(xì)胞的特殊殺菌機(jī)制[10-12]，使微生物更難產(chǎn)生耐藥性。因此，抗菌肽具有替代傳統(tǒng)抗生素成為新一代抗菌物質(zhì)的潛力[13]。牛乳鐵蛋白活性多肽(Lfcin B)是Bellamy等從牛乳鐵蛋白酶解后產(chǎn)物中分離的多肽，其抗菌活性比牛乳鐵蛋白高400多倍[14-15]。蜂毒素(Melittin)是含有26個(gè)氨基酸的抗菌肽，有廣譜的抗菌活性[16-17]。將已知抗菌肽的氨基酸組成進(jìn)行相應(yīng)的取代和缺失，以及應(yīng)用不同抗菌肽保守核心序列雜交構(gòu)建新型抗菌肽是一種有效提高抗菌肽生物活性的方法[18-19]。本研究截取了LfcinB和Melittin的核心序列，構(gòu)建了新型抗菌肽，并驗(yàn)證其對老年呼吸道銅綠假單胞菌的抑制活性，為抗菌物質(zhì)的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2015年1月至2015年10月，以哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院老年病病房65～95歲年齡區(qū)間患者為目標(biāo)，采集痰液98例。

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽設(shè)計(jì) 根據(jù)牛乳鐵蛋白素與蜂毒素的核心區(qū)氨基酸序列組成，選取牛乳鐵蛋白素(Lfcin B)的1～15 位氨基酸和蜂毒肽(Melittin)的1～8位氨基酸，將牛乳鐵蛋白素(Lfcin B)C端的A(丙氨酸)與蜂毒素(Melittin)N端的R(精氨酸)進(jìn)行連接，設(shè)計(jì)一種新型雜合肽分子，分子定名為Lfcin15-Me8，分子序列為FKCRRWQWRWKKLGARLKVLTTG。前15個(gè)氨基酸為LfcinB的部分分子組成，后8個(gè)氨基酸為蜂毒素部分氨基酸序列。利用生物信息學(xué)軟件ProtParam(http://us.expasy.org/tools/prot-param.html)計(jì)算雜合肽分子的分子量、電荷數(shù)、等電點(diǎn)以及α-螺旋含量等指標(biāo)，并利用Psipred軟件(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)進(jìn)行抗菌肽二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。

1.2.2 抗菌肽的合成與鑒定 雜合肽序列提交吉爾生化(上海)有限公司進(jìn)行化學(xué)合成。合成后的雜合肽通過反相高效液相色譜(RT-HPLC)鑒定其純度并通過ESI-MS測定合成雜合肽蛋白分子量，色譜檢測條件參考文獻(xiàn)[16]進(jìn)行檢測。通過ddH2O溶解稀釋合成后的抗菌肽Lfcin15-Me8，0.22 μm 濾器過濾保存[20]。

1.2.3 病原菌菌株的分離和鑒定 菌株分離鑒定方法參考文獻(xiàn)[21]進(jìn)行操作。

1.2.4 抗菌肽抑菌性能測定 采用微量肉湯稀釋法[22]測定Lfcin15-Me8的MIC值。將目標(biāo)菌接種于MHA培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)活化。用MHB培養(yǎng)基將測試菌的過夜培養(yǎng)物稀釋至2×105～7×105cfu/mL。將稀釋好的目標(biāo)菌分別加到含有抗菌肽的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的1孔至11號孔中，每孔100 μL，12 號孔加入100 μL 新鮮MHB培養(yǎng)基作為空白對照。將溶解后的抗菌肽進(jìn)行2倍系列稀釋(2 560、1 280、…、10、5 μg/mL)，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的1至10號孔中，每孔11 μL，11號孔不加抗菌肽，作為陽性對照。37 ℃搖床120 r/min恒溫培養(yǎng)18 h，在490 nm波長檢測吸光值。吸光值比11號孔低50%以上的孔內(nèi)雜合肽濃度定義為該肽對該測試菌的MIC值。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽設(shè)計(jì)與合成

設(shè)計(jì)的雜合肽Lfcin15-Me8由23個(gè)氨基酸組成如表1所示，其中含有賴氨酸、精氨酸各4個(gè)，含有亮氨酸、色氨酸各3個(gè)，含有蘇氨酸、甘氨酸各2個(gè)，含有結(jié)氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺各1個(gè)。通過生物信息學(xué)軟件工具ProtParam計(jì)算獲得了雜合肽基本分子性質(zhì)信息如表2所示。雜合肽分子質(zhì)量為2 918.5 u，帶有8個(gè)正電荷，等電點(diǎn)為12.2，含有12個(gè)α-螺旋，α-螺旋占二級結(jié)構(gòu)的65.22%。通過對設(shè)計(jì)雜合肽理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)等方面的預(yù)測及推斷顯示，設(shè)計(jì)的雜合肽Lfcin15-Me8分子屬于典型的α-螺旋陽離子型抗菌肽，符合抗菌肽的一般結(jié)構(gòu)特征，具備成為優(yōu)質(zhì)抗菌肽的潛力。并用Psipred軟件對雜合肽蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖1所示。

表1 Lfcin15-Me8分子氨基酸所占比例Table 1 Amino acid ratio of Lfcin15-Me8

表2 雜合肽的分子性質(zhì)Table 2 Molecular characters of the hybrid peptide Lfcin15-Me8

圖1 Lfcin15-Me8的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.1 Secondary structure prediction of Lfcin15-Me8

為保證合成的雜合肽純度，利用RT-HPLC對其純度進(jìn)行分析。采用C18柱進(jìn)行測定，Lfcin15-Me8的純度用RP-HPLC在ASB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，預(yù)平衡的0.1%三氟乙酸(TFA)來確定。洗脫液-A(含0.1% TFA的乙腈溶液)，在26 min內(nèi)線性地從22%提高到47%，而洗脫液-B為含有0.1% TFA的水溶液，檢測波長為220 nm。純度檢測結(jié)果如圖2所示，可見合成的雜合肽在26 min內(nèi)全部洗脫下來，主峰出現(xiàn)在13與15 min之間，為13.793 min，并且整個(gè)檢測過程幾乎沒有其他多余的雜峰，僅在9.190 min和11.076 min時(shí)刻出現(xiàn)兩個(gè)小雜峰。由峰面積計(jì)算，合成純化的Lfcin15-Me8純度達(dá)到95%以上，為98.89%，純度很高，完全能夠滿足抗菌活性測定的要求。如圖3所示，合成的Lfcin15-Me8蛋白經(jīng)質(zhì)譜檢測，測定合成的雜合肽的分子質(zhì)量為2 981.57 u，檢測結(jié)果與設(shè)計(jì)之初雜合肽的理論分子質(zhì)量2 981.5 u的數(shù)值基本一致，因此證明所合成的Lfcin15-Me8雜合肽氨基酸序列與設(shè)計(jì)序列完全相同。

圖2 Lfcin15-Me8分子RP-HPLC分析圖Fig.2 Analysis of Lfcin15-Me8 purity by RP-HPLC

圖3 Lfcin15-Me8分子質(zhì)譜檢測圖Fig.3 Molecular weight analysis of Lfcin15-Me8 by ESI-MS

2.2 銅綠假單胞菌病原菌分離分布情況

2015年1月至2015年10月共計(jì)10個(gè)月期間，從65～95歲98例老年病患者的痰液樣品中共分離出病原細(xì)菌115株。其中主要分離獲得肺炎克雷伯菌42株，占36.5%；銅綠假單胞菌37株，占32.2%；鮑曼不動桿菌18株，占15.7%；金黃色葡萄球菌11株，占9.6%。將分離獲得銅綠假單胞菌保藏編號分別為TL1～37。菌株分布具體情況見表3。

表3 病原菌分布情況Table 3 Distribution of pathogenic bacteria

2.3 抑菌活性測定

利用微量肉湯稀釋法測定Lfcin15-Me8對臨床分離獲得的37株銅綠假單胞菌進(jìn)行MIC測定。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著抗菌肽濃度的增加，分離獲得的37株銅綠假單胞菌的生長均受到不同程度的抑制。根據(jù)MIC的定義，測得Lfcin15-Me8對所分離的銅綠假單胞菌抑制程度有所區(qū)別，其中1、8、10、29、32號菌株的MIC值達(dá)到32 μg/mL，占所分離菌株的13.51%。而5、21、25、27號菌株為128 μg/mL，占分離菌株的10.81%。其余菌株MIC值為64 μg/mL，占75.68%。絕大多數(shù)菌株的MIC值維持在這一水平。

表4 雜合肽對銅綠假單胞菌MIC值Table 4 The MICs of Lfcin15-Me8 on the tested strains

3 討 論

呼吸道感染在老年人感染性疾病中最為常見，也是主要死亡原因。由于銅綠假單胞菌繁殖能力強(qiáng)，對生長條件要求低，是引起院內(nèi)感染的主要病原菌，老年人住院治療后加大其感染的幾率，尤其肺部感染最為常見廣泛，因此成為最兇險(xiǎn)的并發(fā)癥[23-26]。本研究在呼吸道感染的老年患者中所分離到的銅綠假單胞菌排在致病菌的第二位，占32.2%。可見，銅綠假單胞菌的感染占較大的比重，若在特定條件下爆發(fā)，將極大威脅老年人健康。銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制包括藥物作用靶位的改變、酶的修飾鈍化作用、外膜通透性降低、主動泵出作用等。銅綠假單胞菌攜帶一種或幾種耐藥基因均可造成對抗生素的耐藥性[27]，急需進(jìn)行新型抗菌物質(zhì)的篩選研究。

隨著對抗菌肽結(jié)構(gòu)、功能與殺菌機(jī)理研究的深入，人們開始嘗試設(shè)計(jì)殺菌活力更強(qiáng)、抗菌譜更廣的新型抗菌肽。雜合肽的設(shè)計(jì)主要是基于結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，通過一系列生物信息學(xué)方法，定向改造或全新設(shè)計(jì)，將兩種或多種抗菌肽的部分肽鏈雜合以獲得具有高抗菌活性、低溶血性、低細(xì)胞毒性的新型多肽[28-29]。結(jié)構(gòu)決定其功能的發(fā)揮，研究表明：陽離子性、疏水性、α-螺旋結(jié)構(gòu)、肽鏈長度、端基結(jié)構(gòu)、自組裝抗菌肽納米形貌等是影響其功能發(fā)揮的主要因素。目前對抗菌肽進(jìn)行分子設(shè)計(jì)策略主要體現(xiàn)在：一是改變抗菌肽天然構(gòu)效[30]；二是改變α-螺旋結(jié)構(gòu)域及其帶的正電荷量、肽鏈長度，增強(qiáng)肽鏈的兩親性質(zhì)[31]。另外就是將不同抗菌肽分子雜合獲得新型抗菌肽分子、提高抗菌肽活性[32]。有報(bào)道天蠶素A-馬蓋寧雜合肽對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均具有良好的抑菌作用[33]。

本研究以哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院老年病房中罹患呼吸道感染患者的痰液為研究對象，所分離獲得的銅綠假單胞菌占32.2%的比重，排在各類致病菌的第二位。將LfcinB(1～15)的氨基酸和Melittin(1～8)氨基酸連接起來，設(shè)計(jì)一種新的抗菌肽分子Lfcin15-Me8，利用生物學(xué)軟件分析預(yù)測其分子性質(zhì)與結(jié)構(gòu)特征。利用固相合成與高效液相色譜及質(zhì)譜檢測技術(shù)，獲得了高純度的Lfcin15-Me8蛋白。其對老年呼吸系統(tǒng)致病菌銅綠假單胞菌具有抑菌活性，最高達(dá)到32 μg/mL。本研究為研究開發(fā)新型抑菌活性抗菌肽分子提供了新的研究思路，但雜合肽Lfcin15-Me8的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能、構(gòu)效關(guān)系、抗菌機(jī)制、以及其他生物學(xué)功能等方面還需進(jìn)一步的研究?？咕姆肿涌梢栽诩?xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜上穿孔而形成離子孔道，引起膜通透性增加而致細(xì)胞快速死亡。也可通過其他機(jī)制發(fā)揮抗菌作用，包括①抑制細(xì)胞呼吸作用；②抑制蛋白的合成；③干擾DNA的合成等。目前，抗菌肽作用機(jī)制的研究還沒有一個(gè)定論，但形成細(xì)胞膜通道被認(rèn)為是抗菌肽的最主要作用途徑，Lfcin15-Me8分子的抗菌機(jī)制推測也與其有關(guān)。

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Molecular Design of Antimicrobial Peptide Lfcin15-Me8 and Its Inhibition Performance Analysis on Respiratory Tract PathogenicPseudomonasaeruginosain Senile

ZHAO Chun-yu1, ZHAO Xiao-yu3, 4, LI Xiang1, YUAN Hai-feng2, ZHENG Yan-he1

(1. 4thAffil.Hosp.HarbinMed.Uni.,Harbin150001; 2.Inst.ofNat. &Ecol.HelongjiangProv.Acad.ofSci.,Harbin150040; 3.Inst.ofHi-Tech.HelongjiangProv.Acad.ofSci.,Harbin150020;4.Inst.ofMicrobiol.HelongjiangProv.Acad.ofSci.,Harbin150010)

Antibacterial activity of artificially designed, synthesized antimicrobial peptide (AMP) Lfcin15-Me8 againstPseudomonasaeruginosaisolated from geriatric patients was investigated. Infection status ofP.aeruginosaisolated and identified from sputum of geriatric patients was carried out. A novel antimicrobial peptide (AMP) Lfcin15-Me8 was designed base on cut-out core amino acid sequence of bovine lactoferricin (Lfcin 1-15) and mellitin (mellitin 1-8), and obtained by solid phase synthesis. The inhibition activity of the novel AMP molecule on clinical isolated strains was determined adopting trace broth dilution method. The results showed that the specific gravity of infection within the hospital ofP.aeruginosaaccount for 32.2%, located at the second place among the pathogens. The synthetic novel AMP molecule Lfcin15-Me8 was classified as cationic AMP and rich in α-helix. The minimum inhibition concentration (MIC) against clinicalP.aeruginosawas all below 128 μg/mL, among them the lowest was at 32 μg/mL, possessing fine antibiotic activity.P.aeruginosaoccupied fairly high specific gravity among respiratory tract infection in geriatric patients, it needs prevention and control, the artificial synthetic Lfcin15-Me8 could inhibit the growth and propagation of clinicalP.aeruginosa.

geriatric disease； respiratory system；Pseudomonasaeruginosa； antimicrobial peptides

黑龍江省教育廳基金面上項(xiàng)目(12541402)

趙春雨 女，副主任醫(yī)師，碩士。主要從事老年病防治臨床研究。E-mail:zhaochunyu856@sohu.com

* 通訊作者。男，副研究員，碩士。主要從事抗菌肽的生物技術(shù)研究。Tel:0451-84613825，E-mail:zhao1612@163.com

2016-06-06；

2016-06-17

Q939.93;R453

A

1005-7021(2016)05-0062-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.011