遲緩愛德華氏菌Eta1-L-Gapdh融合蛋白在藍(lán)藻中的表達(dá)

王 智， 張澤峰， 王晶晶， 王春梅

(北京中醫(yī)藥大學(xué) 生物制藥系，北京 100102)

遲緩愛德華氏菌Eta1-L-Gapdh融合蛋白在藍(lán)藻中的表達(dá)

王 智， 張澤峰， 王晶晶， 王春梅*

(北京中醫(yī)藥大學(xué) 生物制藥系，北京 100102)

在藍(lán)藻中表達(dá)遲緩愛德華氏菌Eta1-L-Gapdh融合蛋白。提取遲緩愛德華氏菌基因組DNA為模板，用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增兩個(gè)已知具有較強(qiáng)免疫原性的基因eta1和gapdh，再采用重疊延伸PCR將這兩個(gè)基因融合，獲得目的融合基因eta1-L-gapdh。將目的基因連接到表達(dá)載體pRL489的兩個(gè)BamH I酶切位點(diǎn)之間構(gòu)建表達(dá)載體，用質(zhì)粒提取、PCR、酶切、測序等手段對表達(dá)載體進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的表達(dá)載體通過三親接合轉(zhuǎn)化野生魚腥藻PCC7120，用新霉素抗性篩選出轉(zhuǎn)基因藻落，通過質(zhì)粒提取和PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因藻。用RT-PCR和Western-blot分別從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平對轉(zhuǎn)基因藻中融合基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，含目的基因的表達(dá)載體構(gòu)建成功，目的基因在藍(lán)藻中轉(zhuǎn)錄并表達(dá)蛋白，該蛋白在藍(lán)藻中的表達(dá)量為2.46%。

遲緩愛德華氏菌;eta1；gapdh；魚腥藻PCC7120；三親接合；融合蛋白

遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)是一種危害性極大的致病菌[1]，可以感染包括淡水與海水養(yǎng)殖的多種魚類，并能在短期內(nèi)引起魚類大量死亡，近年來給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失[2]。科學(xué)家希望盡快研制疫苗以預(yù)防控制該疾病[3]。目前針對該菌的疫苗研究已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，主要來自于國內(nèi)[4-9]，且研究的重點(diǎn)方向之一是尋找具有較強(qiáng)免疫原性的蛋白。自從2004年日本學(xué)者Kawai等[10]發(fā)現(xiàn)37 kDa的遲緩愛德華氏菌外膜蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性后，越來越多的蛋白被證明能對遲緩愛德華氏菌起到免疫保護(hù)作用。到目前為止，至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)17種不同的蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，具有開發(fā)成疫苗的潛力。注射、浸泡和口服是魚類疫苗的主要接種方式[11]。其中口服方式實(shí)施簡單，但在發(fā)揮效應(yīng)前需要防止消化道酶的降解和腸上皮細(xì)胞胞飲作用的降解[12]。因此尋找合適的載體保護(hù)疫苗蛋白是開發(fā)口服疫苗需要解決的關(guān)鍵問題之一。藍(lán)藻是一種能進(jìn)行光合產(chǎn)氧的原核生物[13]，因其具有細(xì)胞壁，因此可以考慮將其用作疫苗的載體避免口服疫苗被魚類胃腸道消化酶降解；生產(chǎn)疫苗的藍(lán)藻還可作為魚類的理想食物直接喂養(yǎng)魚類，這也表明其適合開發(fā)成口服疫苗；同時(shí)其結(jié)構(gòu)簡單，生長迅速，適應(yīng)性強(qiáng)，易于進(jìn)行遺傳操作，用于生產(chǎn)疫苗的成本較低；且藍(lán)藻多數(shù)不含毒蛋白，用于生產(chǎn)疫苗非常安全[14]。鄧元告、Jia等[15-16]已經(jīng)利用藍(lán)藻表達(dá)對蝦白斑病毒VP28基因，將轉(zhuǎn)基因藻喂食對蝦后取得了較好的免疫保護(hù)作用。但目前國內(nèi)外未見利用藍(lán)藻表達(dá)魚類病害基因用以開發(fā)口服疫苗的報(bào)道。本研究采用魚腥藻PCC7120(Anabaenasp. PCC7120)表達(dá)遲緩愛德華氏菌的兩個(gè)具有較強(qiáng)免疫原性基因的融合基因，并從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測融合蛋白的表達(dá)，以期為該病的疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、藻種與質(zhì)粒 遲緩愛德華氏菌HtD來源于人工養(yǎng)殖的大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)，由山東煙臺萊州大華水產(chǎn)有限公司楊學(xué)宋經(jīng)理惠贈；野生型魚腥藻PCC7120由中國科學(xué)院過程工程研究所叢威教授惠贈；大腸埃希菌HB101由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸埃希菌ED8654由美國弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)Jeff Elhai教授惠贈；三親接合所用輔助質(zhì)粒pRL623由美國密歇根州立大學(xué)Peter Wolk教授惠贈；克隆載體pEasy Blunt Zero及感受態(tài)細(xì)胞Trans T1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸膏5，NaCl 10，根據(jù)需要添加100 μg/mL氨芐青霉素或50 μg/mL卡那霉素；BG-11培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)[17]。

1.1.3 主要試劑 Pfu DNA聚合酶、Anti-His單克隆抗體、核酸及蛋白分子Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；BamH I、T4 DNA 連接酶、EcoR I、熱敏磷酸酶均購自New ENGLAND Biolabs (NEB)公司；6×DNA Loading Buffer、DNAase I、cDNA第1鏈合成試劑盒購自TaKaRa公司；2×TaqPCR Master Mix、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；底物發(fā)光試劑盒、二抗Anti-Ms Ig(H+L)/HRP購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；實(shí)驗(yàn)所用其他生化試劑購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，均為分析純；PCR引物合成及序列測定均由北京博邁德基因技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 遲緩愛德華氏菌基因組DNA提取 實(shí)驗(yàn)方案參照精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(第4版)進(jìn)行[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取5 μL基因組DNA與1 μL 6×DNA Loading Buffer混合，進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測提取結(jié)果。

1.2.2 PCR擴(kuò)增免疫原性蛋白基因eta1及gapdh在NCBI上檢索獲得遲緩愛德華氏菌免疫原性蛋白基因eta1及gapdh的基因序列，其登錄號分別為JN802138.1和FJ605131.1，根據(jù)這兩個(gè)序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增這兩個(gè)基因的上下游引物，為了用pRL 489載體表達(dá)，在eta1上游引物的5′端添加一段SD序列GGAGAG，同時(shí)根據(jù)需要，在引物的5′端添加合適的酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增eta1基因用eta1F-eta1R引物對，擴(kuò)增gapdh基因用gapdhF-gapdhR引物對，引物信息見表1。用全式金公司的TransStart Fast Pfu DNA 聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，eta1基因反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min，(95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，35個(gè)循環(huán))，72 ℃ 5 min；gapdh基因的反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min，(95 ℃ 20 s，52 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán))，72 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果。

表1 實(shí)驗(yàn)所用部分引物信息Table 1 Primers used in this study

1.2.3 重疊PCR擴(kuò)增融合基因(eta1-L-gapdh) 將gapdh和eta1的PCR產(chǎn)物膠回收，分別取1 μL膠回收后的產(chǎn)物作模板，進(jìn)行重疊延伸反應(yīng)，選擇80 ℃作為退火溫度，不加入引物，但加入相應(yīng)濃度的dNTPs、Mg2+和Pfu DNA聚合酶并補(bǔ)水至20 μL，72 ℃延伸70 s，共進(jìn)行10個(gè)循環(huán)；第一階段的延伸結(jié)束后，從體系中取出1 μL作模板，用Pfu DNA 聚合酶進(jìn)行普通PCR反應(yīng)。普通PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min，(95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 70 s，35個(gè)循環(huán))，72 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果。

1.2.4 重組表達(dá)載體構(gòu)建 將所得融合基因膠回收純化后，按pEASY-Blunt Zero克隆載體說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)陽性轉(zhuǎn)化子，用試劑盒提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證并用M13通用測序引物測序驗(yàn)證。驗(yàn)證正確后用BamH I酶切含有目的基因的克隆質(zhì)粒，回收目的片段。同時(shí)，培養(yǎng)含pRL489載體的HB101菌株，提取質(zhì)粒用BamH I將其酶切，回收大片段用于連接。將酶切后膠回收得到的pRL489載體大片段用熱敏磷酸酶按說明書進(jìn)行去磷酸化，反應(yīng)條件為37 ℃水浴30 min，再65 ℃水浴5 min熱失活；再用酚氯仿抽提純化。用T4 DNA連接酶將pRL489大片段與融合基因片段進(jìn)行連接，連接反應(yīng)用PCR儀控溫，在25 ℃下連接1.5 h；取連接后產(chǎn)物10 μL于大腸埃希菌HB101感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行常規(guī)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)化后的陽性克隆用PCR、BamH I單酶切、EcoRI單酶切、測序等手段驗(yàn)證。

1.2.5 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化魚腥藻PCC7120 將培養(yǎng)于固體BG-11培養(yǎng)基上的野生魚腥藻PCC7120接種到液體培養(yǎng)基中搖床震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速140 r/min，培養(yǎng)溫度28 ℃，同時(shí)24 h提供光照強(qiáng)度為3 000～4 000 lx的白光。待其生長至對數(shù)期，參照文獻(xiàn)[19]的方法，將其和含有表達(dá)載體的大腸埃希菌HB101以及含有輔助質(zhì)粒和接合質(zhì)粒的大腸埃希菌ED8654混合，將混合液涂于貼在含BG-11固體培養(yǎng)基平皿上的濾膜表面。將平皿置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因魚腥藻的篩選和驗(yàn)證 上述平皿培養(yǎng)2 d后，將濾膜轉(zhuǎn)移至含40 μg/mL的新霉素的固體BG-11培養(yǎng)基平皿上正常培養(yǎng)至藻落可見。挑取藻落于25 mL含30 μg/mL新霉素的BG-11液體培養(yǎng)基中繼續(xù)篩選。參照文獻(xiàn)[20]的方法提取轉(zhuǎn)基因藻的質(zhì)粒，以所提質(zhì)粒為模板，PCR驗(yàn)證pRL489載體與eta1基因相連部分序列、eta1基因、gapdh基因及融合基因。所用引物對分別為pRL-eta1R引物對、eta1F-eta1R引物對、GaF-GaR引物對和eta1F-GaR引物對。引物信息見表1。PCR反應(yīng)程序分別為94 ℃ 8 min，(94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 65 s，30個(gè)循環(huán))，72 ℃ 5 min；94 ℃ 8 min，(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán))，72 ℃ 5 min；94 ℃ 8 min，(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 65 s，30個(gè)循環(huán))，72 ℃ 5 min；94 ℃ 8 min，(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 110 s，30個(gè)循環(huán))，72 ℃ 5 min；反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行電泳。

1.2.7 RT-PCR檢測融合基因表達(dá) 培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因藻至對數(shù)期，用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)基因藻和野生藻的總RNA，操作按照Trizol試劑說明書進(jìn)行。RNA提取后向體系中加入DNAase I，37 ℃水浴反應(yīng)30 min以除去其中痕量的DNA，再用pH<5.0的酚氯仿將其純化。按照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后用2×TaqPCR Master Mix進(jìn)行普通PCR反應(yīng)。用rnpBF-rnpBR引物對擴(kuò)增藍(lán)藻內(nèi)參基因rnpB以驗(yàn)證所提RNA的完整性，同時(shí)用eta1F-eta1R引物對(見表1)、EF-ER引物對、GF-GR引物對、EGF-EGR引物對分別檢測完整eta1基因、部分eta1基因、部分gapdh基因以及eta1基因與gapdh基因的連接序列(簡稱eg)的轉(zhuǎn)錄情況。所用引物信息見表2。PCR反應(yīng)程序均采用94 ℃ 8 min，(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán))，72 ℃ 5 min；反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行電泳。

表2 RT-PCR所用引物情況Table 2 Primers used for RT-PCR

1.2.8 藍(lán)藻總蛋白提取 取培養(yǎng)至對數(shù)后期顏色深綠的轉(zhuǎn)基因藻和野生藻10 mL于15 mL離心管中，2 000 r/min離心2 min沉淀藻細(xì)胞；小心棄去上清后將蓬松的藻細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中；10 000 r/min離心1 min，棄上清，加入100 μL蒸餾水，稍混勻后進(jìn)行超聲反復(fù)凍融，流程為-80 ℃凍10 min，室溫超聲3 min，重復(fù)5次；12 000 r/min離心5 min收集上清即為藍(lán)藻總蛋白。

1.2.9 Western-blot檢測融合蛋白表達(dá) 取藍(lán)藻總蛋白15 μL與3 μL 6×蛋白Loading Buffer混合煮沸5 min，冰浴2 min，10 000 r/min離心1 min吸取上清上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳條件設(shè)置為80 V/150 V，即開始電壓為80 V，待樣品濃縮到分離膠與濃縮膠界限處時(shí)將電壓調(diào)整至150 V，待染料泳動到距離玻璃板下邊緣1 cm處停止電泳；電泳結(jié)束后進(jìn)行常規(guī)Western-blot檢測，一抗為Anti-His單克隆抗體，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠多克隆抗體，稀釋比例均為1∶5 000。

1.2.10 融合蛋白表達(dá)量的確定 利用蛋白濃度為0.14 mg/mL的含組氨酸標(biāo)簽蛋白與蛋白濃度為6.9 mg/mL的含融合蛋白的藍(lán)藻總蛋白樣品共同上樣進(jìn)行Western-blot實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，掃描實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用Quantity One 4.62軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，比對其灰度值，根據(jù)灰度值的比值應(yīng)與蛋白量的比值相同，確定藻總蛋白中融合蛋白的濃度；計(jì)算融合蛋白表達(dá)量：融合蛋白表達(dá)量=藻液中融合蛋白濃度/藻總蛋白濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的獲得

遲緩愛德華氏菌基因組DNA提取結(jié)果見圖1a。由圖1a可知，樣品條帶大于10 kb，條帶單一明亮，無雜帶及彌散條帶，提取效果較好。利用所提取的基因組DNA做模板，先用普通PCR分別擴(kuò)增獲得遲緩愛德華氏菌eta1基因和gapdh基因，結(jié)果見圖1b。圖1b中eta1與gapdh所屬的泳道條帶單一明亮，eta1條帶介于700 bp和800 bp之間，與其理論大小(750 bp)一致；gapdh大小約為1 000 bp，與其理論大小 (1 068 bp ) 一致 ；再利用事先設(shè)計(jì)好的連接肽序列(GGGGS)3作為橋梁，采用重疊PCR擴(kuò)增目的融合基因，結(jié)果如圖1c所示。圖1c中條帶明亮單一，大小與預(yù)期相符，表明融合基因eta1-L-gapdh擴(kuò)增成功。

圖1 目的融合基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of the target fusion geneM1：1 kb DNA Marker1；M2：DNA Marker2；HtD：遲緩愛德華氏菌基因組DNA；gapdh：gapdh基因擴(kuò)增結(jié)果；eta1：eta1基因擴(kuò)增結(jié)果；rh：融合目的基因擴(kuò)增結(jié)果M1: 1 kb DNA Marker1;M2: DNA Marker2; HtD: genome DNA of Edwardsiellatarda; gapdh: PCR amplification of gapdh gene; eta1: PCR amplification of eta1 gene; rh: PCR amplification of the target fusion gene

2.2 重組表達(dá)載體構(gòu)建

構(gòu)建成功的表達(dá)載體經(jīng)過質(zhì)粒提取、PCR驗(yàn)證目的基因、酶切驗(yàn)證目的基因克隆方向等多層次的驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示。圖2a為質(zhì)粒提取結(jié)果；圖2b為目的融合基因PCR驗(yàn)證結(jié)果，其中條帶明亮單一，大小與預(yù)期相符；圖2c為BamH I和EcoR I單酶切結(jié)果，BamH I單酶切顯示兩條帶，大小與預(yù)期一致，EcoR I單酶切結(jié)果顯示除一條大于10 kb的條帶還有3條較小條帶，結(jié)合pRL489載體本身特點(diǎn)及目的融合基因序列，可知條帶均與預(yù)期相符，且同時(shí)表明目的基因連接的方向與預(yù)期一致。經(jīng)過上述初步驗(yàn)證后，設(shè)計(jì)測序引物，將表達(dá)載體送往公司測序，將所測得序列與理論序列進(jìn)行Blast比對，發(fā)現(xiàn)兩者完全一致。由此表明含目的融合基因的表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 表達(dá)載體驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 Verification of the expression vectorM1：DNA Marker 1;M2：DNA Marker2；P：表達(dá)載體質(zhì)粒；rh：融合基因PCR驗(yàn)證結(jié)果；E：EcoR I單酶切表達(dá)載體結(jié)果；B：BamH I單酶切表達(dá)載體結(jié)果M1: DNA Marker1; M2: DNA Marker2; P: the expression vector; rh: Verification of the fusiongene; E: the result of EcoR I digestion of the expression vector;B: the result of BamH I digestion of the expression vector

2.3 轉(zhuǎn)基因魚腥藻的獲得

將構(gòu)建好的表達(dá)載體通過三親接合轉(zhuǎn)化野生魚腥藻PCC7120后，用新霉素在固體平板和液體培養(yǎng)基中篩選陽性藻落(圖3a和3b)。經(jīng)過抗性篩選出的藻落用PCR進(jìn)一步驗(yàn)證目的融合基因和表達(dá)載體，結(jié)果見圖3c。圖中各條帶單一明亮，大小與預(yù)期一致，表明表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)入野生魚腥藻中。

圖3 轉(zhuǎn)基因魚腥藻(a和b)及PCR驗(yàn)證結(jié)果(c)Fig.3 The transgenic cyanobacterium (a and b) and the results of PCR verification (c)A：三親接合對照：野生魚腥藻PCC7120；B：三親接合后轉(zhuǎn)基因魚腥藻;M1：DNA Marker1；M2：DNA Marker2；1～4分別為：融合基因、pRL489載體與eta1基因相連部分序列、eta1基因、gapdh基因PCR驗(yàn)證結(jié)果A： wide-type Anabaena sp. PCC7120 as control; B: transgenic cyanobacteria;M1: DNA Marker1; M2: DNA Marker2; 1-4: fusion gene, the conjoint part of pRL489 and eta1 gene, eta1 gene,gapdh gene

2.4 目的融合基因的轉(zhuǎn)錄水平檢測

從轉(zhuǎn)錄水平對目的融合基因的表達(dá)情況進(jìn)行的檢測結(jié)果見圖4a和4b。圖4a為藍(lán)藻中內(nèi)參基因rnpB RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果，產(chǎn)物條帶單一明亮，大小正確，表明所提取的藍(lán)藻總RNA完整性較好，圖4b為各基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果，包括完整的eta1基因、部分eta1基因、部分gapdh基因、eta1基因與gapdh基因連接處序列，其大小均和理論相符，同時(shí)泳道5中野生型魚腥藻中eta1基因片段RT-PCR無結(jié)果，泳道6中直接以所提總RNA進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增eta1基因片段無結(jié)果，表明總RNA中無DNA殘留，上述事實(shí)表明目的融合基因在魚腥藻中確實(shí)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄。

圖4 融合基因轉(zhuǎn)錄(a和b)及翻譯水平(c)檢測結(jié)果Fig.4 Detection of expression of the target fusion gene at transcription (a and b) and translation level (c)M1：DNA Marker；M2：蛋白質(zhì)Marker；rnpB：藍(lán)藻內(nèi)參基因；1～4：分別為以轉(zhuǎn)基因藻總RNA為模板，eta1完整基因、eta1基因片段、eta1基因與gapdh基因連接部分序列、gapdh基因片段RT-PCR結(jié)果；5：以野生藻總RNA為模板，eta1基因片段RT-PCR結(jié)果；6：以轉(zhuǎn)基因藻總RNA為模板，eta1基因片段PCR結(jié)果； C、W、T：分別為含有pRL489空載體轉(zhuǎn)基因藻、野生藻、含目的基因轉(zhuǎn)基因藻總蛋白Western-blot檢測結(jié)果M1: DNA Marker; M2: protein Marker; rnpB: cyanobacteria reference gene; 1-4: RT-PCR results of intact eta1 gene, partial eta1 gene, the conjoint part of eta1 gene and gapdh gene, partial gapdh gene, respectively, using total RNA of transgenic cyanobacteria as the template; 5: RT-PCR result ofpartial eta1 gene by using total RNA of wide-type cyanobacteria as the template; 6: RT-PCR result of partial eta1 gene by using total RNA of transgenic cyanobacteria as the template; C: Western-blot detection of transgenic cyanobacteria bearing pRL489 vector; W: Western-blot detection of wide-type cyanobacteria bearing pRL489;T:Western-blot detection of transgenic cyanobacteria bearing the target fusion gene

2.5 目的融合基因的蛋白表達(dá)檢測

目的融合基因在翻譯水平的檢測結(jié)果見圖4c，與含有pRL489空載體轉(zhuǎn)基因藻及野生藻泳道相比，圖中含有目的基因的轉(zhuǎn)基因藻泳道出現(xiàn)一條特異條帶，表明融合蛋白得到了表達(dá)。經(jīng)過比對灰度值后取平均值，得到融合蛋白濃度與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度的比值為1.21。由此得到融合蛋白濃度為0.17 mg/mL。再根據(jù)1.2.10中公式得到目的蛋白在藍(lán)藻中的表達(dá)量約為2.46%。

3 討 論

本研究希望用藍(lán)藻表達(dá)具有免疫原性的遲緩愛德華氏菌蛋白，為日后口服疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)，因此需要合理選擇免疫原性蛋白。本研究選用的兩個(gè)蛋白分別來自遲緩愛德華氏菌的GAPDH和ETA1蛋白。其中GAPDH大小為37 kDa左右，是遲緩愛德華氏菌的一種外膜蛋白，具有較好的免疫保護(hù)作用[21]。該蛋白是最早從遲緩愛德華氏菌中發(fā)現(xiàn)的具有免疫原性的蛋白[10]，之后又有多個(gè)研究小組對其保護(hù)作用進(jìn)行了驗(yàn)證[22-25]，在此期間還發(fā)現(xiàn)該蛋白對其他病菌也能起到較好的免疫作用[23-25]。本研究選擇該蛋白作為抗原蛋白之一可以保證疫苗的免疫原性，同時(shí)也可以增加疫苗對其他病菌的適用性。ETA1理論分子大小為23.6 kDa，是一種細(xì)菌黏附素，也屬于外膜蛋白，該蛋白用作亞單位疫苗時(shí)，對日本牙鲆(Japaneseflounder)的保護(hù)率高達(dá)83.3%[26]。同時(shí)，本研究首次將這兩個(gè)蛋白用一段柔性連接肽連接，表達(dá)融合蛋白，希望可以進(jìn)一步增強(qiáng)疫苗的免疫原性和保護(hù)作用。具體到疫苗的實(shí)施，首先需要大規(guī)模培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因藻，離心收集藻體并低溫凍干，按照合適的劑量投入水體直接飼喂健康幼魚，或者根據(jù)需要，可以向藻體中添加適當(dāng)?shù)囊呙缱魟⑼ㄟ^多次間斷飼喂加強(qiáng)疫苗的免疫保護(hù)作用。

本研究采用藍(lán)藻中常用的表達(dá)載體pRL489[27]表達(dá)目的蛋白，pRL489載體上本身在兩個(gè)BamH I位點(diǎn)之間含有l(wèi)uxAB報(bào)告基因。本研究將該報(bào)告基因替換成融合目的基因，同時(shí)在目的基因上游端添加了優(yōu)化的SD序列[28]以增加表達(dá)量。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本研究表達(dá)的融合蛋白理論分子量應(yīng)為60.5 kDa，但實(shí)際檢測到的分子量比該值要小，接近50 kDa。造成這一現(xiàn)象可能有以下原因：①融合蛋白被宿主體內(nèi)的酶剪切斷，剩下一段攜帶有組氨酸標(biāo)簽，因此可以通過Western-blot檢測到；②由于改變了SD序列，引起了核糖體與mRNA結(jié)合位點(diǎn)的改變，翻譯起始密碼子的位置也由此改變，導(dǎo)致最終表達(dá)產(chǎn)物分子量的改變。分析eta1基因序列，發(fā)現(xiàn)除了N端起始密碼子外，其序列內(nèi)部另有2個(gè)甲硫氨酸密碼子，若分別以這兩個(gè)密碼子作為起始密碼子，表達(dá)的融合蛋白理論分子量大小分別是44和51.5 kDa，這樣其中的51.5 kDa可能和實(shí)驗(yàn)中檢測到的融合蛋白分子量大小相近。

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The Expression ofEdwardsiellatardaEta1-L-Gapdh Fusion Protein in Blue Algae (Anabaenasp. PCC7120)

WANG Zhi, ZHANG Ze-feng, WANG Jing-jing, WANG Chun-mei

(Dept.ofBiopharm.Sci.,BeijingUni.ofChineseMed.,Beijing100102)

In order to expressEdwardsiellatardaEta1-L-Gapdh fusion protein in blue algae (Anabaenasp. PCC7120), genome DNA ofE.tardawas purified and was used as a PCR template for the amplification ofeta1 andgapdhgene, two immunogenic genes that can be developed into vaccine againstE.tarda. Then overlap extension PCR was employed to linketa1 andgapdhgene into the target fusion geneeta1-L-gapdh. The target gene was inserted into the twoBamH I sites of an expression vector pRL489 in order to construct an expression vector that can express the target gene in cyanobacteria. The accuracy of the expression vector was confirmed by such methods as plasmid extraction, PCR, restriction enzyme digestion and sequencing. The confirmed vector was transformed into wide-type fishy algaAnabaenasp. PCC7120 using the method of triparental conjugal transferand neomycin sulfate to screen the transgenic cyanobacteria. The selected positive cyanobacterium was confirmed by plasmid extraction and PCR. Finally the expression of the fusion gene was detected at the transcription and translation level using RT-PCR and Western-blot respectively. The results showed and concluded that the expression vector was successfully constructed, and the target gene was transcribed inAnabaenasp. PCC7120 and a fusion protein was also detected. In addition, the relative expression level of the fusion protein was approximately 2.46%.

Edwardsiellatarda;eta1;gapdh;Anabaenasp. PCC7120; triparental conjugal transfer; fusion protein

北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題課題(2013-JYBZZ-JS-139)

王智 男，碩士研究生。研究方向?yàn)樗{(lán)藻基因工程制藥。E-mail: 1169454959@qq.com

* 通訊作者。女，教授，博士，碩土生導(dǎo)師。研究方向?yàn)樗{(lán)藻基因工程制藥。Tel: 010-84738646，E-mail: wchunmei@126.com

2015-12-14；

2016-02-03

Q78

A

1005-7021(2016)05-0078-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.014