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    A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素重鏈干預(yù)大鼠脊髓損傷后蛋白表達(dá)的初步研究*

    2017-01-03 09:55:01王亞芳李夏青
    中國(guó)病理生理雜志 2016年12期
    關(guān)鍵詞:重鏈肉毒分子量

    蘭 婧, 王 紅, 白 娟, 王亞芳, 李夏青

    (山西醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室, 山西 太原 030001)

    A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素重鏈干預(yù)大鼠脊髓損傷后蛋白表達(dá)的初步研究*

    蘭 婧, 王 紅, 白 娟, 王亞芳, 李夏青△

    (山西醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室, 山西 太原 030001)

    目的: 初步觀察大鼠脊髓損傷模型基礎(chǔ)上局部注射小劑量A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素重鏈(BoNT/A HC)后對(duì)局部蛋白表達(dá)譜的影響,為探討B(tài)oNT/A HC干預(yù)在體神經(jīng)損傷后相關(guān)蛋白表達(dá)及其干預(yù)神經(jīng)再生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:復(fù)制大鼠單側(cè)腰段脊髓損傷模型;采用SDS-PAGE及雙向電泳觀察不同劑量BoNT/A HC(2 μg、4 μg、6 μg和8 μg)對(duì)脊髓損傷后局部(包括損傷部位及其近頭端部分脊髓組織)蛋白表達(dá)譜的干預(yù)作用。結(jié)果:大鼠單側(cè)腰段脊髓損傷2 d時(shí)局部脊髓組織結(jié)構(gòu)明顯破壞崩解,損傷波及左側(cè)脊髓灰質(zhì)及白質(zhì);脊髓損傷局部SDS-PAGE及考馬斯亮藍(lán)染色顯示,于損傷同時(shí)局部一次性注射不同劑量BoNT/A HC后,某些蛋白表達(dá)與單純損傷組相比明顯不同,而與正常組基本一致;雙向電泳結(jié)果進(jìn)一步顯示,損傷局部注射6 μg BoNT/A HC后2 d和20 d時(shí),在不同等電點(diǎn)及不同蛋白分子量水平上,有10余種蛋白表達(dá)與單純損傷組明顯不同,呈向正常轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。結(jié)論:大鼠脊髓損傷局部注射BoNT/A HC一定時(shí)間可影響損傷局部蛋白表達(dá)譜的變化,這種變化呈現(xiàn)由損傷造成的蛋白表達(dá)變化被轉(zhuǎn)向正常的趨勢(shì)。

    脊髓損傷; A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素重鏈; 神經(jīng)損傷; 神經(jīng)再生

    脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是由于創(chuàng)傷性或非創(chuàng)傷性因素導(dǎo)致的脊髓結(jié)構(gòu)破壞,譬如創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤及缺血等。嚴(yán)重的脊髓損傷可導(dǎo)致?lián)p傷相應(yīng)節(jié)段所支配的軀體運(yùn)動(dòng)及感覺功能障礙。由于脊髓損傷局部的神經(jīng)細(xì)胞及白質(zhì)纖維缺乏再生能力,因此脊髓損傷是一種致殘率極高的疾病,嚴(yán)重影響人們的正常生活,同時(shí)給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。長(zhǎng)期以來,探討促進(jìn)脊髓損傷后修復(fù)的各種手段成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

    A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素(botulinum neurotoxin type A, BoNT/A)是迄今研究最為廣泛且早已用于臨床實(shí)踐的肉毒桿菌毒素。BoNT/A的毒性機(jī)制主要是通過其分子結(jié)構(gòu)中的重鏈與運(yùn)動(dòng)終板神經(jīng)突起前膜上相應(yīng)受體結(jié)合介導(dǎo)其分子結(jié)構(gòu)中的輕鏈入胞、并通過輕鏈的Zn2+依賴性蛋白水解酶作用導(dǎo)致突觸小體相關(guān)蛋白25(synaptosomal-associated protein 25, SNAP-25)裂解,使突觸囊泡內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)(乙酰膽堿)釋放受阻,骨骼肌收縮障礙發(fā)生麻痹[1-2]。除影響乙酰膽堿外,BoNT/A對(duì)不同神經(jīng)細(xì)胞突觸囊泡內(nèi)的其它遞質(zhì)或多肽如P物質(zhì)、鈣調(diào)素相關(guān)基因多肽等也具有抑制釋放作用[1]。根據(jù)其致病機(jī)理,臨床上BoNT/A主要用于面肌痙攣、斜頸、多汗癥、慢性神經(jīng)性痛、美容除皺等[3]。一些在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BoNT/A局部注射引起肌肉麻痹的后期局部出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)終板樣結(jié)構(gòu)形成[4]。除此外,體外實(shí)驗(yàn)也觀察到培養(yǎng)液內(nèi)加入BoNT/A可以直接刺激原代運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)[5-6]?;谏鲜鲅芯浚緦?shí)驗(yàn)采用大鼠脊髓損傷半離斷模型局部注射人工重組的BoNT/A重鏈(heavy chain, HC),以期觀察BoNT/A對(duì)脊髓損傷后局部蛋白表達(dá)譜的影響,為探討B(tài)oNT/A重鏈干預(yù)在體神經(jīng)損傷后相關(guān)蛋白表達(dá)及其干預(yù)神經(jīng)再生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    材 料 和 方 法

    1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

    雄性SD大鼠,6~7周齡,體重200~220 g,由北京海淀興旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供,許可證號(hào)為SCXK(京)2014-0013。實(shí)驗(yàn)分為4組(每組4只):(1)單純損傷組(一側(cè)腰段脊髓離斷性損傷);(2)脊髓損傷+BoNT/A HC干預(yù) 2 d組,BoNT/A HC劑量分別采用2 μg、4 μg、 6 μg和8 μg,于損傷當(dāng)時(shí)由注射器注入脊髓腔內(nèi);(3)脊髓損傷+BoNT/A HC 干預(yù)20 d組,劑量及方法同 (2);(4)正常對(duì)照組,只行皮膚切開、暴露背部脊椎,不進(jìn)行脊髓損傷。

    2 方法

    2.1 單側(cè)腰段脊髓損傷模型復(fù)制 脊髓損傷模型的方法及步驟參照文獻(xiàn)進(jìn)行并略作改動(dòng)[7]。大致?lián)p傷步驟如下:用1%戊巴比妥鈉腹腔注射(0.3~0.4 mL/kg)麻醉大鼠后將其背位固定于手術(shù)臺(tái)上。腰段脊髓定位:大鼠俯臥位時(shí)根據(jù)髂后上棘首先定位腰3~腰4(L3~L4)椎間隙,以此向頭端依次確定6節(jié)脊椎,第6和第7節(jié)為胸9~胸10(T9~T10)椎間隙,以T9~T10緊靠后棘突間左側(cè)插入改良的直形注射器針頭直至椎板,垂直提拉針頭十?dāng)?shù)次并做背腹部抽動(dòng),抽出直形針頭后再用彎形針頭在同一位置進(jìn)行背腹部提拉數(shù)十次。損傷過程中大鼠出現(xiàn)脊椎向腹側(cè)彎曲、損傷側(cè)后肢短暫抽搐,表明損傷成功,縫合筋膜及皮膚,模型復(fù)制完畢。待動(dòng)物麻醉蘇醒后呈現(xiàn)一側(cè)后肢拖地行走,表明造模成功。

    2.2 HE染色確定損傷部位及范圍 于大鼠腰段脊髓損傷模型復(fù)制后1 d,經(jīng)4%多聚甲醛溶液(新鮮配置,4 ℃)灌注固定后,由背部打開脊髓腔,暴露損傷部位脊髓,分別于損傷處上一脊髓及下一脊髓段切取脊髓組織置于4%多聚甲醛進(jìn)行后固定(1 h),標(biāo)本置于30%蔗糖溶液4 ℃冰箱內(nèi)過夜,經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、行脊髓額狀縱形切片(切片厚度5 μm),經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色后,對(duì)損傷的范圍及程度進(jìn)行觀察。

    2.3 BoNT/A 重鏈髓腔內(nèi)注射 脊髓損傷模型同時(shí)由改良的損傷器針頭連接微量注射器注入人工重組的BoNT/A重鏈(List Biological Laboratories)溶液,總量為20 μL。每只大鼠給藥量分別為 2 μg、4 μg、6 μg及8 μg,將所需劑量的BoNT/A重鏈溶于20 μL生理鹽水內(nèi)進(jìn)行注射。

    2.4 脊髓蛋白表達(dá)的檢測(cè)

    2.4.1 單向凝膠電泳及考馬斯亮藍(lán)染色 于模型復(fù)制+不同劑量BoNT/A重鏈干預(yù)后2 d、20 d時(shí)在深度麻醉狀態(tài)下,沿原手術(shù)切口打開背部皮膚,用咬骨鉗經(jīng)腰椎第3~4椎間隙依次而上打開椎板至脊髓損傷部位,充分暴露脊髓,用剃須刀片在距損傷上下2~3 mm處分別切斷,取出脊髓,將損傷側(cè)脊髓分離作為測(cè)定標(biāo)本。將標(biāo)本用剪刀剪碎,置入玻璃管研磨器中,加入預(yù)冷的蛋白裂解液內(nèi)(蛋白裂解液配置方法:尿素 21 g、硫脲 7.9 g、DTE 0.5 g和Tris 0.5 g,純水定容至50 mL)。每3 mm脊髓組織加500 μL裂解液,每個(gè)脊髓標(biāo)本共加入裂解液1 000 μL,標(biāo)本置于玻璃研磨器內(nèi)于冰上研磨成為組織懸液。并將組織懸液進(jìn)行超聲間斷粉碎3 min,進(jìn)一步充分裂解蛋白。組織蛋白懸液內(nèi)加入5倍體積的預(yù)冷丙酮震蕩混合,-20 ℃沉淀2 h或過夜;次日將組織混懸液進(jìn)行離心(4 ℃,12 000×g30 min),棄去上清,收集沉淀;加入蛋白裂解液(500 μL)再次懸浮沉淀,充分混勻后采用ABC法進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。

    將20 μg樣本蛋白溶于凝膠電泳樣本溶解液內(nèi),水浴中煮沸10 min。分別上樣于15%的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳(電壓 80~100 mV,時(shí)間 1.5 h)。凝膠置于0.025% 考馬斯亮藍(lán)溶液中(考馬斯亮藍(lán) 0.025 g、甲醇 400 mL,冰乙酸 70 mL,純水定容至1 000 mL)漂染2 h,用洗脫液(甲醇 400 mL和冰乙酸 70 mL,純水定容至1 000 mL)對(duì)凝膠進(jìn)行漂洗3~4 h,染色后的凝膠條帶經(jīng)Bio-Rad圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行成像分析。

    2.4.2 雙向電泳及銀染色 蛋白提取方法同4.1,蛋白上樣量為150 mg。選用pH 3~10 NL IPG預(yù)制干膠條,進(jìn)行第一向等電聚焦; 將聚焦完成的膠條用 2D equilibration buffer [6 mol/L 尿素,50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8), 30%甘油, 2%SDS, 1% DTT,痕量溴酚藍(lán)] 進(jìn)行清洗和平衡;將平衡后的膠條放入凝膠板中,加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液(0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖+電泳緩沖液),室溫靜置20 min后進(jìn)行第二向電泳。第二向聚丙烯酰胺凝膠濃度為12.5%,電泳參數(shù)設(shè)定為100 mV,45 min,隨后改為200 mV直至溴酚藍(lán)離膠下沿0.5 cm處停止;冷循環(huán)設(shè)定溫度為15 ℃。

    對(duì)完成電泳后的凝膠進(jìn)行硝酸銀染色。大致染色步驟為凝膠水化、10%乙醇漂洗及敏化、0.1%硝酸銀染色20 min、充分水洗后加入銀染色顯影液(0.25%碳酸鈉、0.04%甲醛溶液)顯影3~5 min、充分水洗;采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)對(duì)銀染色后的凝膠進(jìn)行成像及分析處理。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示,多組間均數(shù)差異用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 大鼠腰段脊髓半離斷損傷及HE染色

    模型復(fù)制2 d后,由L3~L4椎間隙依次向上打開椎板充分暴露腰段脊髓。肉眼可見損傷部位位于腰膨大下部,局部充血腫脹,與周圍組織較易辨別。低倍鏡可見損傷部位主要位于脊髓左側(cè)(損傷側(cè))。損傷側(cè)脊髓正常結(jié)構(gòu)破壞、組織斷斷續(xù)續(xù),脊髓前后角及灰白質(zhì)不可辨認(rèn),損傷側(cè)外側(cè)面脊髓組織缺失。高倍鏡下可見損傷處神經(jīng)組織呈現(xiàn)液化性壞死、損傷灶內(nèi)部分神經(jīng)細(xì)胞呈現(xiàn)典型壞死形態(tài)學(xué)特征(核濃縮、碎裂)、小血管明顯擴(kuò)張、損傷區(qū)域炎性細(xì)胞浸潤(rùn)不十分明顯。除此外,鏡下可見損傷灶越過中央管略向?qū)?cè)延伸,脊髓中央管不易辨認(rèn),見圖1。

    Figure 1.Gross and histological views of unilateral lumbar spinal cord injury. A: one-side damage was observed on the dorsum of the lumbar spinal cord; B: the longitudinal section of spinal cord including the injury site; C: the cross section of spinal cord injury location; D: the gray matter which surrounded the injury site with clear normal histological features (magnification); E: the center of the damage location with obvious destruction in structures and micro-foci of liquefaction, the gray and white matter couldn’t be recognized.

    圖1 單側(cè)腰椎脊髓損傷的大體觀和組織學(xué)形態(tài)

    2 脊髓損傷局部注射BoNT/A重鏈對(duì)局部蛋白表達(dá)譜的影響

    損傷后2 d脊髓局部的蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組相比,損傷局部的蛋白表達(dá)譜發(fā)生明顯變化,其中主要表現(xiàn)在分子量為180 kD、120 kD、40 kD及30 kD附近的蛋白表達(dá)量明顯增加,而分子量約在65 kD的蛋白質(zhì)降解成數(shù)條蛋白帶,分子量約在75 kD的蛋白表達(dá)減少。BoNT/A重鏈注射后2 d及20 d,上述相應(yīng)部位的蛋白表達(dá)不同程度地趨向于正常對(duì)照組的表達(dá)譜特征;更值得注意的是,在6 μg BoNT/A HC注射后20 d左右,分子量約在75 kD、65 kD及20 kD部位的蛋白表達(dá)量甚至超過正常對(duì)照組。凝膠電泳的考馬斯亮藍(lán)染色的初步結(jié)果提示BoNT/A HC可能干預(yù)脊髓損傷后損傷局部蛋白的表達(dá),見圖2。

    Figure 2.The comparison of protein expression in spinal cord tissue after unilateral spinal cord injury with different doses of BoNT/A heavy chain injection. *: the protein bands displayed various changes after injury of spinal cord, most of which increased and some degraded; #: the obvious reversal effect of BoNT/A heavy chain on the proteins with decreased expression after spinal cord injury; !: BoNT/A heavy chain reduced the protein expression which appeared increased after injury.

    圖2 單側(cè)脊髓損傷并注射不同劑量的BoNT/A HC后損傷脊髓組織中蛋白表達(dá)的比較

    3 BoNT/A 重鏈干預(yù)脊髓損傷局部蛋白表達(dá)

    雙向電泳結(jié)果顯示脊髓損傷后局部蛋白整體表達(dá)譜發(fā)生明顯變化,一些蛋白表達(dá)明顯增多,而另一些蛋白的表達(dá)則減少或消失。這些蛋白表達(dá)的變化有些呈集中趨勢(shì),表現(xiàn)為蛋白組群整體變化,而大部分則為一些散在的蛋白表達(dá)點(diǎn)的變化。總體上看,可以將這些蛋白表達(dá)發(fā)生變化的區(qū)域按照等電點(diǎn)(isoelectronic point,pI)及分子量(molecular weight,MW)的交叉分成4個(gè)亞區(qū): a區(qū): pI在8~9, MW為60~110 kD; b區(qū): pI在5~6, MW為25 kD左右; c區(qū): pI在6~7, MW為20 kD左右; d區(qū): pI接近8, MW為45 kD左右,見圖3。

    將上述部位進(jìn)一步放大可以看到,單純損傷后a區(qū)的蛋白表達(dá)呈點(diǎn)群表達(dá)量增多,主要集中于MW接近60 kD水平上有多組蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著增多(P<0.01);除此外,MW在110 kD水平位置的蛋白表達(dá)也明顯增強(qiáng)。BoNT/A 重鏈注射后2 d,上述2個(gè)部位的蛋白表達(dá)即表現(xiàn)明顯下降,注射后20 d時(shí),上述部位蛋白表達(dá)特征與正常對(duì)照組極相似,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見圖4。 單純損傷時(shí)c區(qū)的突出變化是在分子量為18.4 kD及20 kD的水平上分別出現(xiàn)2個(gè)新的蛋白表達(dá)點(diǎn)。BoNT/A 重鏈用藥2 d時(shí)18 kD水平的蛋白表達(dá)明顯降低,而對(duì)20 kD位置的蛋白表達(dá)未顯示干預(yù)作用;用藥20 d時(shí),上述2個(gè)位點(diǎn)的蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組基本接近,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見圖5。

    Figure 3.Analysis of the protein expression in the spinal cord tissue after unilateral spinal cord injury with different doses of BoNT/A heavy chain injection by 2-demensional SDS-PAGE. a, b, c and d pointed the location where the protein expression altered after injury and intervention with BoNT/A heavy chain. MW: molecular weight; pI: isoelectronic point.

    圖3 單側(cè)脊髓損傷并注射BoNT/A HC不同時(shí)間后脊髓組織蛋白表達(dá)的雙向電泳分析

    單純脊髓損傷時(shí)b區(qū)和d區(qū)2個(gè)部位分別有數(shù)個(gè)蛋白點(diǎn)呈現(xiàn)表達(dá)降低,第1個(gè)蛋白點(diǎn)出現(xiàn)在b區(qū),分子量約為50 kD左右,損傷后表達(dá)基本消失;第2個(gè)及第3個(gè)出現(xiàn)在d區(qū),分子量基本接近,在25 kD左右,二者損傷時(shí)皆表達(dá)減少。采用BoNT/A 重鏈后2 d,b區(qū)的蛋白表達(dá)有所回升,用藥達(dá)20 d時(shí),蛋白表達(dá)水平基本達(dá)到正常對(duì)照組水平,而d區(qū)的2個(gè)蛋白點(diǎn)在BoNT/A 重鏈用藥2 d時(shí),表達(dá)呈現(xiàn)回升,用藥達(dá)20 d時(shí)又表現(xiàn)減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖6。

    總之,在體脊髓損傷時(shí)脊髓局部組織蛋白質(zhì)表達(dá)變化非常顯著,一些蛋白質(zhì)組群表達(dá)增強(qiáng),甚至出現(xiàn)新的蛋白質(zhì),而另外一些蛋白表達(dá)則明顯降低。BoNT/A重鏈的給予可以使這些由于損傷發(fā)生變化的蛋白質(zhì)出現(xiàn)向正常轉(zhuǎn)化的趨勢(shì),使損傷后表達(dá)增強(qiáng)的蛋白質(zhì)趨于降低,表達(dá)減少的蛋白質(zhì)趨于增多,且隨著給藥后時(shí)間的延長(zhǎng)這種逆轉(zhuǎn)作用表現(xiàn)更為突出。

    Figure 4.Comparison of the protein expression at the selective location from Figure 3a (MW range: 45~116.2 kD). →: the protein located at 100 kD level;: the protein located at 60 kD. Mean±SEM.n=4.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsinjury group.

    圖4 圖3中a區(qū)域蛋白表達(dá)的比較

    Figure 5.The comparison of the protein expression at the selective location from Figure 3c (MW range: 14~20 kD). →: the protein located at 20 kD level;: the protein located at 18 kD. Mean±SEM.n=4.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsinjury group.

    圖5 圖3中c區(qū)域蛋白表達(dá)的比較

    Figure 6.The comparison of the protein expression at the selective location from Figure 3d (A; MW range: 45~60 kD) and Figure 3b (B; MW range: 20~30 kD). →: MW was around 50 kD;: MW was around 23 kD;: MW was around 25 kD. Mean±SEM.n=4.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsinjury group.

    圖6 圖3中d和b區(qū)域蛋白表達(dá)的比較

    討 論

    脊髓損傷后的修復(fù)是臨床醫(yī)學(xué)的難題之一,探索能夠促進(jìn)脊髓損傷后修復(fù)或?qū)ふ夷艽碳ぞ植看婊钌窠?jīng)細(xì)胞恢復(fù)再生能力的新藥/制劑是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域重要研究方向。迄今,很多研究者對(duì)此進(jìn)行了多種嘗試,譬如:在椎管內(nèi)注入神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子;將神經(jīng)干細(xì)胞植入損傷局部;按照中醫(yī)的方法進(jìn)行針灸、按摩、電針或中藥離子導(dǎo)入,促進(jìn)患者脊髓功能的康復(fù)[8-10]。然而,由于上述各種治療的局限或不確定性,目前仍未找到治療脊髓損傷后再生的有效藥物及療法。

    BoNT/A與神經(jīng)再生之間的關(guān)系起源于對(duì)肉毒毒素局部注射后期出現(xiàn)新的運(yùn)動(dòng)終板樣結(jié)構(gòu)的形成及體外實(shí)驗(yàn)BoNT/A可刺激原代運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元神經(jīng)突起生長(zhǎng)[4]。BoNT/A的化學(xué)結(jié)構(gòu)為蛋白多肽,分為重鏈和輕鏈,兩者借二硫鍵相互連接。毒素重鏈主要與宿主細(xì)胞膜上的特異受體結(jié)合介導(dǎo)毒素入胞;進(jìn)入胞漿的輕鏈?zhǔn)嵌舅匕l(fā)揮毒性的催化單位[11]。采用商品化的人工重組的BoNT/A重鏈僅保留毒素的入胞結(jié)構(gòu)域而排除了毒素的毒性結(jié)構(gòu)。因此,這種人工重組的BoNT/A重鏈體內(nèi)應(yīng)用不會(huì)引起肉毒毒素中毒反應(yīng),而且毒素重鏈與宿主細(xì)胞膜上相應(yīng)受體的結(jié)合及隨后的受體-配體內(nèi)吞入胞勢(shì)必會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)某些信號(hào)系統(tǒng)的激活。我們前期的體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)人工重組的BoNT/A重鏈可促進(jìn)Neuro-2a細(xì)胞突起增長(zhǎng)并可促進(jìn)某些再生相關(guān)信號(hào)分子,譬如ERK1/2及Akt的磷酸化[5-6]。

    脊髓損傷后采用BoNT/A重鏈干預(yù)是否可促進(jìn)局部的損傷修復(fù)目前尚無報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)損傷同時(shí)給予BoNT/A重鏈后一定時(shí)間,可使損傷后某些增加或減少的蛋白質(zhì)表達(dá)量趨于正常化,SDS-PAGE+考馬斯亮藍(lán)及2-D膠電泳的結(jié)果提示BoNT/A 重鏈對(duì)脊髓損傷后蛋白產(chǎn)生干預(yù)作用的位點(diǎn)分布相對(duì)較廣,較為明顯的變化出現(xiàn)在分子量為60~110 kD、45 kD及18~25 kD的蛋白點(diǎn)或組群。在單純損傷時(shí),這些部位的蛋白表達(dá)有些增高,有些降低,甚至損傷后出現(xiàn)個(gè)別新的蛋白表達(dá)點(diǎn),當(dāng)采用不同劑量BoNT/A重鏈注射后,這些損傷后的蛋白表達(dá)譜呈現(xiàn)逆轉(zhuǎn)性變化、與正常對(duì)照組的脊髓蛋白表達(dá)譜接近,尤以用藥后20 d時(shí)表現(xiàn)明顯;多數(shù)觀察到的蛋白變化在損傷后給藥2 d與給藥20 d呈現(xiàn)逐步恢復(fù)到正常的趨勢(shì),與單純損傷時(shí)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,總體上體現(xiàn)了BoNT/A重鏈逆轉(zhuǎn)損傷所帶來的脊髓蛋白表達(dá)異常的作用。

    發(fā)育成熟的中樞神經(jīng)細(xì)胞基本喪失其再生能力,即使神經(jīng)元仍然存活,其上行突起也不能再生,不能與上一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞的軸突形成突觸;另外中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時(shí)伴有的髓鞘崩解破壞而產(chǎn)生的髓磷脂抑制因子,通過與神經(jīng)細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合而發(fā)揮其對(duì)軸突生長(zhǎng)的抑制作用,與此同時(shí),髓鞘崩解產(chǎn)物刺激膠質(zhì)細(xì)胞增生形成的膠質(zhì)瘢痕也對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的再生修復(fù)產(chǎn)生阻礙。因此,不論是腦還是脊髓損傷后,這些髓磷脂相關(guān)抑制因子及其膠質(zhì)瘢痕蛋白的表達(dá)增加。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,可溶性髓磷脂相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)和少突細(xì)胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp)分子量皆在110 kD左右,這些蛋白皆屬于髓磷脂抑制因子[12]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)單純脊髓損傷時(shí)MW在110 kD、pI為8左右的蛋白點(diǎn)或蛋白組群數(shù)量表達(dá)明顯增多,當(dāng)采用BoNT/A重鏈后2 d時(shí)這些分子量水平的蛋白組群數(shù)量及蛋白表達(dá)均有所下降,到20 d時(shí)呈現(xiàn)與正常對(duì)照組類似的水平。另外,雙向電泳結(jié)果顯示MW在60 kD左右、pI為8~9的堿性蛋白質(zhì)在損傷后也明顯增多,當(dāng)采用BoNT/A重鏈后2 d這些分子量水平的蛋白組群數(shù)量及蛋白表達(dá)均也有所下降,到20 d時(shí)也呈現(xiàn)與正常對(duì)照組類似的水平。研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí),Nogo-66(來源于髓磷脂的另一種生長(zhǎng)抑制蛋白)以及髓磷脂抑制因子受體的分子量分別為66 kD和65 kD[13]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后局部所產(chǎn)生的大量髓磷脂抑制因子與神經(jīng)軸突膜上相應(yīng)受體結(jié)合、激活細(xì)胞內(nèi)抑制信號(hào)通路(譬如RhoA-ROCK-MLC)最終導(dǎo)致成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元軸突再生抑制。從上述2個(gè)位點(diǎn)的蛋白表達(dá)譜變化可以推測(cè),BoNT/A 重鏈局部注射可能一方面通過干預(yù)髓磷脂抑制因子的產(chǎn)生或降解而削弱其抑制作用;另一方面可能通過減少神經(jīng)軸突膜上神經(jīng)抑制因子相應(yīng)受體的表達(dá)而減少髓磷脂抑制因子的作用。因此,BoNT/A 重鏈促神經(jīng)再生的現(xiàn)象有可能通過降低髓磷脂抑制因子的抑制作用而實(shí)現(xiàn)。

    除此之外,實(shí)驗(yàn)中還觀察到單純脊髓損傷時(shí)MW在45 kD、pI為堿性的一些蛋白表達(dá)點(diǎn)較正常對(duì)照組明顯減少,而在BoNT/A重鏈注射后2 d就顯示其表達(dá)灰度值有所恢復(fù),甚至較正常對(duì)照組略偏高。 就目前所知,體內(nèi)一些再生相關(guān)蛋白或再生相關(guān)信號(hào)蛋白,譬如ERK1/2、Akt、GAP-43、Wnt/β-catenin、Eph-Ephrin、JNK等蛋白分子量多在40~55 kD之間[5-6, 14-15]。ERK1/2、Akt是目前公認(rèn)的參與組織細(xì)胞再生的重要信號(hào)蛋白;生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43是一種胞膜磷酸蛋白質(zhì),與神經(jīng)再生關(guān)系密切。損傷后再生能力越強(qiáng),再生的軸突末梢生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43的表達(dá)也就越明顯[16]。有文獻(xiàn)報(bào)道增加Wnt/β-catenin、Eph-Ephrin及JNK的表達(dá)或促進(jìn)激活可以促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,BoNT/A重鏈可能在抑制髓磷脂抑制因子及其受體的同時(shí),促進(jìn)神經(jīng)突起或細(xì)胞內(nèi)一些參與再生的信號(hào)蛋白分子的表達(dá)。事實(shí)上,我們前期的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)BoNT/A重鏈可促進(jìn)ERK1/2和Akt/PKB的磷酸化[5]。

    在本實(shí)驗(yàn)中還觀察到,MW約在25 kD、pI為5~6的一些小分子蛋白在單純損傷時(shí)表達(dá)減少,而在BoNT/A重鏈用藥2 d時(shí)表達(dá)明顯增多,但用藥達(dá)20 d時(shí)則變化不明顯。小鳥嘌呤核苷三磷酸酶的Rho家族成員——RhoA、Rac1、Cdc42等皆屬于小分子蛋白[17]。如前所述,RhoA是細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)抑制信號(hào)通路中的重要啟動(dòng)蛋白,RhoA的表達(dá)減少或抑制則標(biāo)志著下游信號(hào)通路不能被激活,神經(jīng)生長(zhǎng)抑制作用被削弱。然而,由于只是在BoNT/A重鏈注射后2 d時(shí)小分子水平的蛋白表達(dá)較單純損傷組減少,而用藥時(shí)間達(dá)到20 d時(shí)這種現(xiàn)象消失,因此考慮這種變化可能屬于BoNT/A重鏈對(duì)某些蛋白表達(dá)的短效作用。

    總之,上述多個(gè)位點(diǎn)的蛋白表達(dá)變化特征提示,脊髓損傷后給予BoNT/A重鏈可以干預(yù)局部蛋白的表達(dá)、促進(jìn)損傷后局部蛋白代謝趨向正?;?; BoNT/A重鏈可能通過多種機(jī)制促進(jìn)神經(jīng)損傷后修復(fù)再生,譬如削弱神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子的抑制作用,增強(qiáng)再生相關(guān)蛋白的表達(dá)等。

    由于本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果僅僅是脊髓損局部的整體蛋白表達(dá)譜的變化,就目前的結(jié)果也還不能解釋BoNT/A重鏈干預(yù)脊髓損傷后蛋白的具體機(jī)制。然而蛋白表達(dá)譜的變化對(duì)于闡明BoNT/A重鏈在脊髓損傷后再生修復(fù)中的作用至關(guān)重要,因此,有待于今后在此基礎(chǔ)上進(jìn)行蛋白質(zhì)譜并結(jié)合蛋白生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)BoNT/A重鏈所引起的脊髓損傷后蛋白表達(dá)的逆轉(zhuǎn)進(jìn)行更進(jìn)一步的分析,以期最終能夠闡明BoNT/A重鏈干預(yù)神經(jīng)損傷后再生的確切機(jī)制。

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    (責(zé)任編輯: 林白霜, 羅 森)

    Botulinum neurotoxin type A heavy chain intervenes in expression of ge-neral proteins in spinal cord after unilateral spinal cord injury in rats

    LAN Jing, WANG Hong, BAI Juan, WANG Ya-fang, LI Xia-qing

    (DepartmentofPathophysiology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:xqli2013@126.com)

    AIM: To observe the effect of botulinum neurotoxin type A heavy chain (BoNT/A HC) on the pattern of spinal protein expression by intrathecal injection after spinal cord injury in rats, and to explore the role of BoNT/A HC intervention in spinal protein expression and some of its mechanisms in nerve regeneration after injury. METHODS: The model of unilateral lumbar spinal cord injury was established. The effects of BoNT/A HC intervention at different doses (2 μg, 4 μg, 6 μg and 8 μg) on the general pattern of protein expression in the spinal cord tissues at the injury site and the cranial part adjacent to the injury site was measured and evaluated by SDS-PAGE and Coomassie brilliant blue staining first, and then by two-dimensional SDS-PAGE. RESULTS: The histological structure of the ipsilateral side of lumbar spinal cord showed obvious destruction and degradation, mainly affecting both gray and white matter of the left side of the cord. The result of SDS-PAGE with Coomassie brilliant blue staining from injured spinal cord tissue displayed that the expression of some proteins after one-time BoNT/A HC treatment appeared obviously different from that without BoNT/A HC treatment. Moreover, the pattern of the protein expression affected by BoNT/A HC was similar to that of the normal spinal cord. The more detail information from two-dimensional SDS-PAGE indicated that more than 10 proteins with different molecular weight and isoelectronic points were differentially expressed at day 2 and day 20 after local injection of 6 μg BoNT/A HC. This altered expression actually appeared a tendency toward the pattern shown in normal group. CONCLUSION: The immediate application of BoNT/A HC at the injury site after unilateral lumbar spinal cord injury is able to affect the pattern of local protein expression. The altered protein expression by injury could be reversed back to normal or approximately normal by local BoNT/A HC administration.

    Spinal cord injury; Botulinum neurotoxin type A heavy chain; Nerve injury; Nerve regeneration

    1000- 4718(2016)12- 2125- 08

    2016- 07- 08

    2016- 09- 09

    國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81171178);山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(No. 2012046)

    R363.2+1

    A

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.002

    雜志網(wǎng)址: http://www.cjpp.net

    △通訊作者 Tel: 0351-4135067; E-mail: xqli2013@126.com

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