miR-30c調(diào)控PAI-1對血管內(nèi)皮細(xì)胞活力和遷移的影響*

譚曉勇， 羅 茂， 盧培林， 吳劍波

(西南醫(yī)科大學(xué)藥物研究中心， 藥學(xué)院心血管藥理實驗室， 四川 瀘州 646000)

miR-30c調(diào)控PAI-1對血管內(nèi)皮細(xì)胞活力和遷移的影響*

譚曉勇▲， 羅 茂▲， 盧培林， 吳劍波△

(西南醫(yī)科大學(xué)藥物研究中心， 藥學(xué)院心血管藥理實驗室， 四川 瀘州 646000)

目的： 深入研究微小RNA (miR)-30c靶向調(diào)控纖溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)表達(dá)對血管內(nèi)皮細(xì)胞活力和遷移能力的影響。方法:應(yīng)用miR-30c模擬物(mimic)、抑制物(inhibitor)及陰性對照(NC)序列轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)后，RT-qPCR檢測miR-30c水平及PAI-1的mRNA表達(dá)，Western blot法檢測PAI-1蛋白的表達(dá)，CCK-8法和劃痕實驗分別檢測細(xì)胞活力和遷移能力。生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-30c與PAI-1的mRNA 3’-UTR結(jié)合位點，并用雙螢光素酶報告基因驗證miR-30c對PAI-1 mRNA的靶向作用。結(jié)果:miR-30c能夠靶向調(diào)控PAI-1的mRNA和蛋白表達(dá)，與對照組和NC序列轉(zhuǎn)染組比較，增加miR-30c表達(dá)可導(dǎo)致PAI-1的mRNA和蛋白表達(dá)降低，進(jìn)而增強HUVECs的活力和遷移能力；相反，抑制miR-30c表達(dá)可導(dǎo)致PAI-1 的mRNA和蛋白表達(dá)升高，進(jìn)而抑制HUVECs的活力和遷移能力。結(jié)論:高表達(dá)miR-30c可抑制PAI-1表達(dá)，導(dǎo)致HUVECs 活力和遷移能力明顯增強，提示miR-30c可能參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能。

微小RNA-30c； 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞； 纖溶酶原激活物抑制物1； 細(xì)胞活力； 細(xì)胞遷移

血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖、遷移是血管生成的關(guān)鍵[1-2]。研究顯示，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、激活和修復(fù)與部分心血管疾病如動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓、糖尿病等的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[3]。微小RNA (microRNA, miRNA, miR)是一類內(nèi)源性的、19～25個堿基長度的小分子非編碼RNA，它可以通過與靶mRNA的3’-UTR互補導(dǎo)致其降解或抑制蛋白翻譯，從而在人體生命活動中具有廣泛的調(diào)控作用[4-5]。近來研究表明，部分miRNA廣泛參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能如增殖、遷移和凋亡等過程，參與血管生成的調(diào)節(jié)，與諸多心血管疾病的病理生理進(jìn)程密切相關(guān)[6-7]。

已有研究表明，miR-30c與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[8]，但miR-30c與心血管類疾病的研究尚少。其中，Duisters等[9]研究表明左心室肥厚病人和動物模型心肌組織中miR-30c表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致miR-30c靶標(biāo)結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)表達(dá)升高，促進(jìn)心室重構(gòu)；Patel 等[10]研究發(fā)現(xiàn)人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞的miR-30c能夠直接靶向作用于組織型纖溶酶原激活物抑制物1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)表達(dá)，參與鐮狀細(xì)胞貧血，該過程受胎盤生長因子(placental growth factor，PIGF)誘導(dǎo)。PAI-1 是調(diào)節(jié)纖溶活性的重要因子，生理條件下是組織纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，t-PA)和尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，u-PA)的特異性抑制物[11-13]。研究顯示，PAI-1 能夠通過影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程和細(xì)胞黏附功能從而參與調(diào)節(jié)血管生成[13]。綜合提示，miR-30c可能通過靶向調(diào)控PAI-1表達(dá)，參與內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移調(diào)節(jié)，進(jìn)而調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能和血管生成。

材 料 和 方 法

1 材料

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購自ATCC；改良型RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基(HyClone)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、TRIzol和DEPC水(Invitrogen)；Mir-XTMmiRNA第1鏈合成試劑盒和SYBR?RT-qPCR試劑盒(Clontech)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa)；E.colipoly (A) Polymerase和rATP (NEB)；DNA Ladder Marker和2×Taq PCR Master Mix(北京天根生化科技公司)；CCK-8試劑盒、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素(碧云天生物技術(shù)研究所)；兔抗人β-actin、PAI-1單克?、窨购涂雇肐gG Ⅱ抗(CST)；雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)(Promega)；其它試劑為進(jìn)口產(chǎn)品或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。高速冷凍離心機(Eppendorf)；自動凝膠成像系統(tǒng)Gel DocXR+、蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)和CFX96 Touch 實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad)；ND-1000微量紫外可見分光光度計(NanoDrop)；超凈工作臺(SW-CJ)；-80 ℃超低溫冰箱(Thermo)。吸頭、離心管等經(jīng)0.1% DEPC水浸泡24 h后高溫滅菌，50 ℃烘干備用。PCR引物由Invitrogen公司合成,具體序列見表1。

表1 引物序列

F: forward; R: reverse.

2 方法

2.1 HUVECs的培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清的改良型RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基(1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)培養(yǎng)HUVECs，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.2 miR-30c靶基因的預(yù)測 應(yīng)用在線軟件miRBase[14](http://www.mirbase.org/)獲得miR-30c的基本信息，結(jié)合miRanda[15](http://www.microrna.org/)、TargetScan 6.2[16](http://www.targetscan. org/)和PicTar[17](http://www.pictar.org/)靶基因預(yù)測結(jié)果，分析其中交集結(jié)果并提交miTarbas[18](http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)與已證實靶基因比對，結(jié)合已有文獻(xiàn)報道[10]，預(yù)測miR-30c與PAI-1 mRNA存在的靶向結(jié)合位點，用于后續(xù)實驗分析。

2.3 miR-30c的轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h，取對數(shù)生長期HUVECs(1×105)鋪于6孔板中，待生長至60%～70%匯合時，更換無血清培養(yǎng)基后同步進(jìn)行miR-30c mimic (50 nmol/L)、miR-30c inhibitor (100 nmol/L)及對應(yīng)陰性對照(negative control，NC)序列的轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染12 h 后更換新鮮培養(yǎng)基，24 h收集細(xì)胞提取總RNA，48 h收集細(xì)胞提取蛋白。

2.4 pMIR-REPORT螢光素酶報告基因檢測 根據(jù)預(yù)測的靶基因結(jié)合位點設(shè)計并合成 miR-30c 與 PAI-1 mRNA 3’-UTR 結(jié)合的30～60 bp 寡核苷酸序列并插入雙酶切位點，經(jīng)酶切、PCR擴增鑒定、質(zhì)粒抽提以及測序等步驟確定重組載體質(zhì)粒pMIR-Luc-miR-30c-PAI-1 3’-UTR構(gòu)建成功。進(jìn)一步以構(gòu)建的質(zhì)粒為模板進(jìn)行定點突變，構(gòu)建突變型質(zhì)粒。各步所用引物序列見表1。

將HEK 293細(xì)胞鋪于48孔板，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，結(jié)合pMIR-Luc-miR-30c-PAI-1 3’-UTR重組質(zhì)粒、對應(yīng)的突變型質(zhì)粒和miR-30c mimic (50 nmol/L)、miR-30c inhibitor (100 nmol/L)及其對應(yīng)NC共轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞72 h后，利用螢光素酶檢測試劑盒(Promega)檢測螢光素酶活性，驗證作用靶點的真實性。

2.5 用RT-qPCR檢測miR-30c的水平和靶標(biāo)PAI-1的mRNA表達(dá) TRIzol試劑盒提取各實驗組的細(xì)胞總RNA，并分別應(yīng)用Mir-XTMmiRNA 第1鏈合成試劑盒和SYBR?RT-qPCR 試劑盒和PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒制備cDNA模板。分別以U6 和 18S rRNA為內(nèi)參照檢測miR-30c的水平和靶標(biāo)PAI-1的mRNA表達(dá)。應(yīng)用SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa)進(jìn)行qPCR檢測。擴增條件為： 95 ℃ 10 min； 95 ℃ 10 s， 50 ℃～ 60 ℃ 20 s， 72 ℃ 30 s， 40個循環(huán)； 72 ℃ 3 min， 60 ℃～95 ℃繪制熔解曲線。應(yīng)用2-ΔΔCt法計算miR-30c和靶標(biāo)PAI-1 mRNA的表達(dá)量，引物見表1。

2.6 Western blot法檢測PAI-1蛋白的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后加入適量預(yù)冷的RIPA buffer(含Roche蛋白酶抑制劑cocktail)，超聲裂解后12 000 r/min，4 ℃ 離心15 min，取上清。BCA法測定蛋白濃度后，樣品蛋白：5×上樣緩沖液比例為4∶1，100 ℃變性后，進(jìn)行10% SDS-PAGE膠上樣并轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)封閉1 h后加入I抗4 ℃孵育過夜(PAI-1和內(nèi)參照β-actin抗體的稀釋比例均為1∶2 000)。TBST洗膜3次后，II抗孵育1 h，再次TBST漂洗3次后顯影。

2.7 細(xì)胞活力和遷移能力的檢測 HUVECs(1×104)接種于96孔板，待其基本融合時更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑37 ℃孵育1 h，全自動酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度(A)，每組均取6復(fù)孔計算均值，統(tǒng)計學(xué)分析比較細(xì)胞活力的變化。HUVECs轉(zhuǎn)染24 h后按1×105接種至6孔板，設(shè)置4個復(fù)孔，待細(xì)胞基本匯合后，在細(xì)胞表面劃1條粗細(xì)均一的劃痕，洗去懸浮的細(xì)胞并更換低血清培養(yǎng)基，于培養(yǎng)0 h、12 h和24 h時，倒置顯微鏡下觀察拍照，使用ImageJ 軟件分析遷移距離評估遷移能力的變化。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 16.0 軟件統(tǒng)計分析，所有實驗數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和方差齊性檢驗，兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-30c對HUVECs活力和遷移能力的影響

應(yīng)用劃痕實驗和CCK-8法分析HUVECs的遷移能力和細(xì)胞活力，結(jié)果顯示與對照組和NC組比較，miR-30c mimic組的HUVECs遷移能力及細(xì)胞活力增高；反之，miR-30c inhibitor組的HUVECs遷移能力及細(xì)胞活力均下降(P<0.05)。上述結(jié)果說明過表達(dá)miR-30c可以顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和細(xì)胞活力；抑制miR-30c表達(dá)可明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和細(xì)胞活力，見圖1。

2 miR-30c靶基因PAI-1的預(yù)測及螢光素酶報告基因驗證

在線軟件預(yù)測、比對及文獻(xiàn)分析結(jié)果顯示，存在miR-30c與PAI-1 mRNA 3’-UTR區(qū)的靶向結(jié)合位點，可用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控實驗驗證。根據(jù)預(yù)測的靶基因結(jié)合位點，我們成功構(gòu)建pMIR-Luc-miR-30c-PAI-1 3’-UTR重組質(zhì)粒及其突變型質(zhì)粒。螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與對照組和NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-30c mimic可顯著抑制螢光素酶活性，轉(zhuǎn)染miR-30c inhibitor抑制miR-30c后螢光素酶活性增強(P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒組各組螢光素酶活性均無明顯變化(數(shù)據(jù)未顯示)，提示miR-30c可直接結(jié)合于PAI-1 3’-UTR，靶向調(diào)控PAI-1的表達(dá),見圖2。

Figure 1.The effect of miR-30c on the migratory ability and viability of HUVECs. A: the representative images and quantitative analysis of the wound healing test (scale bar=1 mm;n=4); B: the result of CCK-8 assay (n=6). Mean±SD.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNC group.

圖1 miR-30c對內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力和細(xì)胞活力的影響

Figure 2.Bioinformatic predictions and reporter gene assay of miR-30c targeting PAI-1. A: stem-and-loop structure of miR-30c; B: predictions of miR-30c binding to PAI-1; C: assessment of miR-30c binding to PAI-1 3’-UTR by reporter gene assays. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNC group.

圖2 miR-30c靶基因PAI-1的生物信息學(xué)預(yù)測及螢光素酶報告基因驗證

3 miR-30c調(diào)控靶標(biāo)PAI-1的mRNA表達(dá)

與對照組和NC組比較，過表達(dá)miR-30c能夠顯著抑制靶基因PAI-1 的mRNA表達(dá)；反之，抑制miR-30c表達(dá)可顯著增強PAI-1的mRNA表達(dá)(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The expression levels of miR-30c (A) and its target PAI-1 mRNA (B) measured by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNC group.

圖3 miR-30c對靶標(biāo)PAI-1 mRNA表達(dá)的影響

4 miR-30c調(diào)控靶標(biāo)PAI-1蛋白表達(dá)

如圖4所示，Western blot實驗的結(jié)果表明，與對照組和NC組比較，過表達(dá)miR-30c能夠明顯抑制靶標(biāo)PAI-1 蛋白的表達(dá)；相反，抑制miR-30c表達(dá)可明顯增強PAI-1蛋白的表達(dá)(P<0.05)。

Figure 4.The effect of miR-30c on the protein levels of PAI-1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNC group.

圖4 miR-30c對靶標(biāo)PAI-1 蛋白表達(dá)的影響

討 論

研究表明，血管生成過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能激活是關(guān)鍵，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移等功能變化對維持血管壁穩(wěn)定與循環(huán)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，與心血管系統(tǒng)疾病如動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓等發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。研究顯示部分miRNA可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能，參與內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、激活和修復(fù)等過程調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成，在大量心血管疾病病理生理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[6-7, 19]。例如，Bernstein 等[19]研究顯示，大量miRNA通過Dicer通路加工形成，進(jìn)而調(diào)控內(nèi)皮毛細(xì)血管芽生和管腔形成，調(diào)控部分促血管生成的重要因子如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管生成素1/2(angiopoietin 1/2，Ang-1/2)等表達(dá)變化，進(jìn)而調(diào)控血管的生成。

PAI-1是調(diào)節(jié)纖溶活性的重要因子，生理條件下是t-PA和u-PA的特異性抑制物[11-13]。研究顯示，PAI-1能夠通過影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程和細(xì)胞黏附功能從而參與調(diào)節(jié)血管生成[11]。進(jìn)一步推測其機制，PAI-1活性升高，可抑制纖溶，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)降解障礙；高水平PAI-1也通過阻止玻連蛋白(vitronectin)的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)親合力功能區(qū)從而破壞細(xì)胞的黏附和遷移功能。其中，玻連蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)中的主要黏附成分[12]。我們最近發(fā)現(xiàn)PAI-1與玻連蛋白結(jié)合可通過αvβ3整合素通路阻止VEGF誘導(dǎo)的VEGFR-2磷酸化，進(jìn)一步研究顯示通過調(diào)節(jié)纖維蛋白溶酶、尿激酶受體和αvβ3整合素受體，PAI-1 能夠抑制VEGF誘導(dǎo)的血管形成[13]。

已有研究表明，miR-30c與脂肪干細(xì)胞分化、上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤等相關(guān)[20-21]。最近研究揭示，miR-30c在心血管系統(tǒng)中同樣扮演著重要角色[9-10]。例如，miR-30c通過靶向調(diào)控結(jié)締組織生長因子表達(dá)，參與心室重構(gòu)過程的調(diào)節(jié)[9]；HPMVEC細(xì)胞內(nèi)miR-30c經(jīng)PIGF誘導(dǎo)后靶向調(diào)控PAI-1表達(dá)，參與鐮狀細(xì)胞貧血過程的調(diào)節(jié)[10]；本文研究結(jié)果顯示，miR-30c能夠靶向結(jié)合PAI-1 3’-UTR種子序列，從而直接靶向負(fù)調(diào)控PAI-1的mRNA和蛋白表達(dá)，參與內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、細(xì)胞活力的調(diào)節(jié)，提示過表達(dá)miR-30c可抑制PAI-1表達(dá)，導(dǎo)致HUVECs 細(xì)胞活力和遷移能力的明顯增強，推測miR-30c可能通過直接靶向調(diào)控PAI-1表達(dá)，影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解或黏附過程，進(jìn)而參與血管生成過程。

Wu等[13]研究表明2 型糖尿病中應(yīng)用PAI-1 抑制劑可明顯修復(fù)缺血誘導(dǎo)的血管生成，增加下肢的血流灌注，提示PAI-1 可作為糖尿病微血管并發(fā)癥血管生成治療的一個潛在重要靶點，臨床研發(fā)如miR-30c增強劑等新型PAI-1抑制劑將可能改善心血管類血管并發(fā)癥的治療及預(yù)后，如糖尿病下肢缺血血管生成治療過程，增加血管重構(gòu)，阻止血管滲漏，達(dá)到最理想治療效果。本研究結(jié)果為進(jìn)一步設(shè)計新型PAI-1抑制劑提供一定依據(jù)，其結(jié)果具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effects of miR-30c on viability and migratory ability of HUVECs by targeting

PAI-1TAN Xiao-yong, LUO Mao, LU Pei-lin, WU Jian-bo

(DrugDiscoveryResearchCenter,LaboratoryforCardiovascularPharmacology,TheSchoolofPharmacy,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China.E-mail:jbwucn@163.com)

AIM: To investigate the effect of microRNA (miR)-30c on the viability and migratory ability of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) by targeting plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1).METHODS: The HUVECs were transfected with miR-30c mimic and inhibitor or negative control (NC), and then the expression levels of miR-30c, PAI-1 mRNA and protein were detected by RT-qPCR and Western blot. The viability and migratory ability of HUVECs were measured by CCK-8 assay and wound healing test. After bioinformatic analysis, the assessment of miR-30c binding to PAI-1 3’-UTR was carried out using a luciferase reporter gene assay. RESULTS: miR-30c directly down-regulated PAI-1 levels by binding to the 3’ UTR seed sequence of PAI-1 mRNA. Furthermore, transfection of a miR-30c mimic down-regulated the expression of PAI-1 at mRNA and protein levels, leading to enhanced migratory ability and viability of the HUVECs. However, transfection of a miR-30c inhibitor up-regulated the expression of PAI-1 at mRNA and protein le-vels, leading to decreased migratory ability and viability. CONCLUSION: Regulation of miR-30c level changes the migratory ability and viability of HUVECs by affecting the PAI-1 expression, indicating the involvement of miR-30c in modulating endothelial function.

MicroRNA-30c; Human umbilical vein endothelial cells; Plasminogen activator inhibitor-1; Cell viability; Cell migration

1000- 4718(2016)12- 2199- 06

2016- 07- 15

2016- 08- 30

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81172050; No. 81570263);四川省科技廳課題(No. 2014FZ0104);四川省教育廳課題(No.16ZA0178)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.012

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