辣蓼黃酮乙酸乙酯部分干預(yù)LPS誘導(dǎo)RAW264.7炎癥反應(yīng)機制

劉夢倩，陶俊宇，胡雯月，韋英益，胡庭俊

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西南寧 530021；3.上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200030)

辣蓼黃酮是中草藥辣蓼的一種有效成分。研究表明，辣蓼黃酮能降低LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥對小鼠造成的多臟器損傷[1-2]。辣蓼黃酮能降低脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7炎性因子分泌[3]。過量的LPS可激活單核巨噬細(xì)胞，并通過細(xì)胞內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)和核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κB，NF-κB)兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化多種炎性因子[4]。在炎癥反應(yīng)中，激活的NF-κB會引起一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧合酶2型(COX-2)以及腫瘤壞死因子α(TNF-α)等多種炎癥因子的表達(dá)[5-6]。同時，MAPKs家族參與細(xì)胞生長、細(xì)胞分化、細(xì)胞死亡和免疫反應(yīng)等多種生理活動的p38、ERK與JNK也會被炎癥因子激活[7]。研究表明，JNK可保護細(xì)胞不受TNF-α誘導(dǎo)的凋亡，對細(xì)胞凋亡起著重要的調(diào)節(jié)作用[8]?；罨腏NK可以使c-Jun的ser63和ser73位點發(fā)生磷酸化，從而合成誘生型iNOS和TNF-α的特異性轉(zhuǎn)錄激活因子AP-1。AMPK是炎性調(diào)節(jié)因子，其催化亞基AMPKα1在脂肪組織和巨噬細(xì)胞中有著較高的表達(dá)量，活化的AMPKα1可以抑制巨噬細(xì)胞的炎性[9]。本研究旨在通過構(gòu)建體外炎癥模型，測定炎癥相關(guān)蛋白和磷酸化水平，探究辣蓼黃酮乙酸乙酯部分(FEA)對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 脂多糖，Sigma公司產(chǎn)品；iNOS(D6B6S)兔抗單克隆抗體、COX2(D5H5)兔抗單克隆抗體、MAPK family antibody sampler kit 試劑盒、Phospho-MAPK family antibody sampler kit 試劑盒、AMPKα(D5A2)兔抗單克隆抗體、Phospho- AMPKα(Three172)(40H9)兔抗單克隆抗體、c-Jun(60A8)兔抗單克隆抗體、Phospho-c-Jun(Ser73)兔抗單克隆抗體、β-Actin(13E5)兔抗單克隆抗體、GADPH(14C10)兔抗單克隆抗體、辣根過氧化物酶連接的抗兔IgG，美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品；complete tablets EDTA-free蛋白酶抑制劑、phosSTOP磷酸酶抑制劑，瑞士羅氏公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑盒、10×TBST、Western抗體稀釋液、蛋白膜再生液、麗春紅染色試劑、考馬斯亮藍(lán)染液，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(C150)，德國BINDER公司產(chǎn)品；細(xì)胞超聲破碎儀(JY92-ⅡD)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；純水儀(CD-UPT-1)，成都純越科技有限公司產(chǎn)品；微量離心機(TYPE1-14)，SIGMA公司產(chǎn)品；超聲波清洗機(DTDN)，寧波新芝生物科技有限公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡(TS100)，Nikon公司產(chǎn)品；搖床(TS-100C)，上海天呈公司產(chǎn)品；垂直電泳槽(Mini-Protein Tetra System)，BIO-RAD公司產(chǎn)品；蛋白半干轉(zhuǎn)系統(tǒng)(TRANS-BLOT SD)，Bio-Rad公司產(chǎn)品；蛋白成像系統(tǒng)(Chemi Doc MP)，BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 藥品制備 辣蓼黃酮乙酸乙酯部分(FEA)，廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實驗室采用酶解-超聲偶聯(lián)法提取后的濾液，經(jīng)過石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯部分，經(jīng)XDA-8大孔吸附樹脂分離純化,得辣蓼黃酮乙酸乙酯部分 (FEA)。將得到的FEA通過高效液相色譜法(HPLC)測定其中蘆丁、槲皮素和槲皮苷的含量。再以蘆丁為參比物，采用紫外分光光度法測定了所得FEA中總黃酮的含量。

1.2.2 細(xì)胞處理與分組 將處于對數(shù)生長期的RAW264.7消化后輕輕吹打至單個細(xì)胞，調(diào)節(jié)濃度至2×105個/mL，每孔100 μL加至96孔板中，用100 mL/L FBS的DMEM維持培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜。棄去上清，空白對照組加入維持培養(yǎng)基，模型組加入含LPS終濃度為1.0 μg/mL的維持培養(yǎng)基，藥物處理組加入含40 μg/mL、80 μg/mL FEA的維持培養(yǎng)基與細(xì)胞孵育2 h、4 h之后棄去上清，再加入含LPS終濃度為1.0 μg/mL的維持培養(yǎng)基，2 h(測MAPK、AMPKα或c-Jun及其磷酸化)或24 h(測iNOS與COX-2)時收集細(xì)胞樣品。

1.2.3 蛋白樣品制備 按1.2.2所述處理細(xì)胞后，用預(yù)冷的PBS洗1次，輕輕吹下收集于EP管中，2 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入RIPA(1∶1)細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑(1∶100)和磷酸酶抑制劑(1∶1 000)冰上裂解20 min，用超聲破碎儀超聲處理樣品，防止樣品黏稠，分裝后-80℃保存。使用前用蛋白測定試劑盒測定各樣本蛋白濃度，使?jié)舛缺３忠恢?，加?×Loading buffer。EP管加封口膜，沸水浴煮沸5 min，4℃、12 000 r/min離心5 min，取上清待測。

1.2.4 iNOS與COX-2的檢測 按1.2.2所述處理細(xì)胞并按1.2.3所述制備蛋白樣，上樣50 μg蛋白。iNOS蛋白使用80 g/L的SDS-PAGE膠分離1.5 h，并在3 mA/cm2的恒流狀態(tài)下半干轉(zhuǎn)75 min；COX-2蛋白用100 g/L的SDS-PAGE膠分離1 h，并在1.5 mA/cm2的恒流狀態(tài)下半干轉(zhuǎn)1 h。用BSA在37℃下封閉1 h。一抗4℃孵育過夜，PBST洗3次，37℃下二抗孵育1 h，PBST洗3次，顯影。

1.2.5 AMPKα與磷酸化AMPKα的檢測 按1.2.2所述處理細(xì)胞并按1.2.3所述制備蛋白樣，上樣50 μg蛋白。使用100 g/L的SDS-PAGE膠分離1 h，并在1.5 mA/cm2的恒流狀態(tài)下半干轉(zhuǎn)45 min。用BSA 37℃下封閉1 h。一抗4℃孵育過夜，PBST洗3次，37℃下二抗孵育1 h，PBST洗3次，顯影。

1.2.6 MAPK家族ERK、JNK、p38及其相應(yīng)蛋白磷酸化的檢測 按1.2.2所述處理細(xì)胞并按1.2.3所述制備蛋白樣，上樣50 μg蛋白。ERK與p-ERK蛋白用100 g/L的SDS-PAGE膠分離1 h，并在1.5 mA/cm2的恒流狀態(tài)下半干轉(zhuǎn)35 min；SAPK/JNK與p-SAPK/JNK用100 g/L的SDS-PAGE膠分離1.5 h，并在1.5 mA/cm2的恒流狀態(tài)下半干轉(zhuǎn)40 min；P38與p-P38用120 g/L的SDS-PAGE膠分離45 min，并在1.5 mA/cm2的恒流狀態(tài)下半干轉(zhuǎn)30 min；用BSA 37℃下封閉1 h。一抗4℃孵育過夜，PBST洗3次，37℃下二抗孵育1 h，PBST洗3次，顯影。

1.2.7 c-Jun與磷酸化c-Jun的檢測 按1.2.2所述處理細(xì)胞并按1.2.3所述制備蛋白樣，上樣50 μg蛋白。c-Jun與p-c-Jun用100 g/L的SDS-PAGE膠分離1 h，并在1.5 mA/cm2的恒流狀態(tài)下半干轉(zhuǎn)35 min。用BSA 37℃下封閉1 h。一抗4℃孵育過夜，PBST洗3次，37℃下二抗孵育1 h，PBST洗3次，顯影。

2 結(jié)果

2.1 iNOS蛋白的表達(dá)

由圖1可知，與空白對照組相比，LPS刺激24 h后的模型組的iNOS蛋白表達(dá)水平均極顯著升高；而用40 μg/mL、80 μg/mL的FEA預(yù)處理RAW264.7 2 h和4 h后均能極顯著降低iNOS蛋白的表達(dá)。表明FEA預(yù)處理RAW264.7能極顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7中iNOS蛋白的表達(dá)。

A.空白對照組；B.LPS模型組；C.40 μg/mL FEA處理組；D.80 μg/mL FEA處理組；*表示與LPS模型組相比，差異顯著(P<0.05)，**表示與LPS模型組相比，差異極顯著(P<0.01)

2.2 COX-2蛋白的表達(dá)

由圖2可知，與空白組相比，LPS刺激24 h后，模型組的COX-2蛋白表達(dá)水平均極顯著升高；用80 μg/mL的FEA預(yù)處理RAW264.7 2 h和4 h后均能顯著降低COX-2蛋白的表達(dá)水平。表明用80 μg/mL的FEA預(yù)處理后能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7中COX-2蛋白的表達(dá)。

A.空白對照組；B.LPS模型組；C.40 μg/mL FEA處理組；D.80 μg/mL FEA處理組；*表示與LPS模型組相比，差異顯著(P<0.05)，**表示與LPS模型組相比，差異極顯著(P<0.01)

2.3 磷酸化AMPK的表達(dá)

由圖3可知，F(xiàn)EA預(yù)處理RAW264.72 h后，LPS組與空白組相比p-AMPKα/AMPKα的蛋白表達(dá)比值無顯著差異；FEA處理組與LPS組相比，80 μg/mL的FEA能顯著增加p-AMPKα/AMPKα的比值。FEA預(yù)處理RAW264.74 h后，LPS組與空白組相比，p-AMPKα/AMPKα的蛋白表達(dá)比值顯著降低，F(xiàn)EA處理組與LPS組相比，40 μg/mL和80 μg/mL 的FEA能極顯著增加p-AMPKα/AMPKα的比值。表明FEA預(yù)處理能顯著增加LPS誘導(dǎo)的RAW264.7中磷酸化AMPK的表達(dá)水平。

A.空白對照組；B.LPS模型組；C.40 μg/mL FEA處理組；D.80 μg/mL FEA處理組；*表示與LPS模型組相比，差異顯著(P<0.05)，**表示與LPS模型組相比，差異極顯著(P<0.01)

2.4 磷酸化ERK的表達(dá)

由圖4可知，與空白組相比，LPS刺激2 h后模型組的p-ERK/ERK水平均極顯著升高。分別用40 μg/mL和80 μg/mL的FEA預(yù)處理RAW264.7 2 h后能極顯著抑制p-ERK/ERK水平。用80 μg/mL的FEA預(yù)處理RAW264.7 4 h后，極顯著增加了p-ERK/ERK水平。表明FEA預(yù)處理2 h能極顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7中磷酸化ERK的表達(dá)。

A.空白對照組；B.LPS模型組；C.40 μg/mL FEA處理組；D.80 μg/mL FEA處理組；*表示與LPS模型組相比，差異顯著(P<0.05)，**表示與LPS模型組相比，差異極顯著(P<0.01)

2.5 磷酸化P38的表達(dá)

由圖5可知，與空白組相比，LPS刺激2 h后，模型組的p-P38/P38水平有所升高，但差異不顯著。分別用40 μg/mL和80 μg/mL的FEA預(yù)處理RAW264.7 2 h后增加了p-p38/p38水平，但差異仍然不顯著。分別用40 μg/mL和80 μg/mL的FEA預(yù)處理RAW264.7 4 h后，能極顯著降低p-p38/p38水平。表明FEA預(yù)處理RAW264.7 4 h后，能極顯著抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)磷酸化P38的表達(dá)。

A.空白對照組；B.LPS模型組；C.40 μg/mL FEA處理組；D.80 μg/mL FEA處理組；*表示與LPS模型組相比，差異顯著(P<0.05)，**表示與LPS模型組相比，差異極顯著(P<0.01)

2.6 磷酸化JNK的表達(dá)

由圖6可知，與空白組相比，LPS刺激2 h后模型組p-JNK/JNK水平極顯著的升高，而用80 μg/mL的FEA預(yù)處理RAW264.7 2 h和4 h后均能極顯著抑制p-JNK/JNK水平。表明80 μg/mL FEA預(yù)處理后極顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的RAW264.7中磷酸化JNK的表達(dá)。

A.空白對照組；B.LPS模型組；C.40 μg/mL FEA處理組；D.80 μg/mL FEA處理組；*表示與LPS模型組相比，差異顯著(P<0.05)，**表示與LPS模型組相比，差異極顯著(P<0.01)

2.7 磷酸化c-Jun的表達(dá)

由圖7可知，與空白組相比，LPS刺激下2 h后模型組c-Jun磷酸化水平均極顯著升高，用80 μg/mL的FEA預(yù)處理RAW264.7 2 h后能降低磷酸化c-Jun的表達(dá)水平，但差異不顯著；用80 μg/mL的FEA預(yù)處理RAW264.7 4 h后能極顯著抑制磷酸化c-Jun的表達(dá)水平。表明80 μg/mL的FEA預(yù)處理4 h后極顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的RAW264.7中磷酸化c-Jun的表達(dá)。

A.空白對照組；B.LPS模型組；C.40 μg/mL FEA處理組；D.80 μg/mL FEA處理組；*表示與LPS模型組相比，差異顯著(P<0.05)，**表示與LPS模型組相比，差異極顯著(P<0.01)

3 討論

辣蓼是我國分布較廣的一種傳統(tǒng)中草藥，具有祛風(fēng)利濕,散淤止痛,解毒消腫等功效。辣蓼全草的主要成分為鞣質(zhì)、黃酮類和揮發(fā)油，其中總黃酮部分是辣蓼發(fā)揮抗氧化、抗炎和抗病毒作用的主要活性成分[10-12]。近年來有關(guān)辣蓼黃酮生物活性的研究較多，周淑棉等[13]為探究辣蓼黃酮正丁醇部分(FNB)體外抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PPRSV)的效果，采用不同濃度的FNB作用于PPRSV毒株感染的Marc-145細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，使用FNB處理后的藥物組細(xì)胞存活率顯著高于病毒組細(xì)胞，結(jié)果說明不同濃度的FNB可以抑制PPRSV的大量繁殖，從而提高M(jìn)arc-145細(xì)胞的存活率，顯示出抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的作用。趙雅媚等[14]為探究總黃酮體外抗氧化活性，采用熱回流提取辣蓼總黃酮測定其對DPPH和羥基自由基的清除率后發(fā)現(xiàn)，辣蓼黃酮的濃度越高對DPPH和羥基自由基的清除率越高，證明辣蓼黃酮的抗氧化特性。辣蓼黃酮的抗炎效果也是近年來討論的焦點，由于目前臨床上治療炎癥的藥物對腎臟的損害很大，而辣蓼屬于天然藥物，在治療疾病時相較于人工合成的西藥副作用小，使用起來也更加安全[15-16]。前期已證實辣蓼黃酮正丁醇部分和乙酸乙酯部分具有良好的抗炎效果[3]，而有關(guān)于辣蓼黃酮乙酸乙酯部分抑制炎癥反應(yīng)分子機制的研究尚未見報道。

有研究表明[17]，人與小鼠的神經(jīng)元細(xì)胞中，激活腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)有助于提高抗炎藥物的作用，因此激活A(yù)MPK被認(rèn)定為炎癥進(jìn)程被抑制的標(biāo)志之一。炎癥相關(guān)試驗中常以LPS誘導(dǎo)RAW264.7構(gòu)建炎癥模型，通過測定炎癥反應(yīng)中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平推斷該炎癥反應(yīng)中的分子機制。有研究表明，當(dāng)LPS刺激RAW264.7構(gòu)建炎癥模型后，LPS會激活MAPK通路中的p38、ERK與JNK。這3個MAPK亞基的激活導(dǎo)致iNOS和COX-2蛋白的高表達(dá)[18]。再者p38、ERK與JNK的激活直接或間接的使Elk-1,c-Jun以及ATF-1磷酸化[19]?；罨腏NK分子會磷酸化c-Jun的ser63和ser73位點并激活c-Jun[20]。通過LPS刺激RAW264.7構(gòu)建炎癥模型，測定細(xì)胞內(nèi)iNOS、COX-2蛋白表達(dá)和相關(guān)蛋白磷酸化水平即可判斷該炎癥反應(yīng)可能的分子機制。

本試驗為探究辣蓼黃酮乙酸乙酯部分(FEA)對炎性反應(yīng)干預(yù)的分子機制，采用LPS誘導(dǎo)RAW264.7構(gòu)建炎癥模型，測定細(xì)胞內(nèi)iNOS和COX-2的表達(dá)水平，以及AMPK、ERK、P38、JNK、c-Jun及其相應(yīng)蛋白磷酸化水平，從而推斷可能的干預(yù)機制。結(jié)果表明，在一定給藥劑量或是孵育時間的情況下，F(xiàn)EA預(yù)處理均能抑制LPS誘導(dǎo)的p38、ERK與JNK的磷酸化，從而減緩細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。其中80 μg/mL的FEA預(yù)處理抑制LPS誘導(dǎo)的JNK的磷酸化效果更好，F(xiàn)EA預(yù)處理孵育2 h能抑制LPS誘導(dǎo)的ERK磷酸化效果更好。試驗還表明，F(xiàn)EA不僅能抑制MAPK家族JNK的磷酸化，還能抑制JNK的反應(yīng)底物c-Jun的磷酸化，這也許是FEA抗炎活性的主要作用靶點之一。

綜上所述，辣蓼黃酮乙酸乙酯部分(FEA)對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7具有抗炎作用，其作用機制可能與抑制細(xì)胞內(nèi)iNOS與COX-2蛋白的高表達(dá)、抑制MAPKs信號通路p38、ERK與JNK的磷酸化和增加磷酸化AMPK的表達(dá)水平有關(guān)。