2015-2018年豫南地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型分子流行病學(xué)調(diào)查

連慧香，朱鳳霞，王俊鋒*，易先國，張偉彬，劉 濤，董建國，曲哲會，趙 瑜，劉 佳*

(1.信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院/河南省大別山區(qū)生態(tài)畜禽健康生產(chǎn)工程研究中心，河南信陽 464000；2.駐馬店市動物疫病預(yù)防控制中心，河南駐馬店 463000；3.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南洛陽 451450)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是單股、環(huán)狀、閉合的DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬[1]。該病毒主要破壞豬體免疫系統(tǒng)而引起免疫抑制，在臨床上常發(fā)生與其他病原微生物共同感染的情況，誘發(fā)其他疾病的發(fā)生而使發(fā)病豬的死亡率明顯升高，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。

PCV2基因組為單鏈環(huán)狀DNA病毒，大小為1 766 bp～1 768 bp，含有11個開放閱讀框(ORF)，其中ORF2基因編碼的衣殼結(jié)構(gòu)蛋白(Cap)與病毒致病性及免疫原性有關(guān)。有研究人員利用軟件預(yù)測PCV全序列中的抗原位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)PCV中存在的抗原位點(diǎn)共有5個，4個位于ORF2中[4]，這也證實(shí)了ORF2編碼的Cap蛋白上擁有PCV2病毒的主要保護(hù)性抗原表位，是刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的結(jié)構(gòu)蛋白[5-6]，因此ORF2已成為PCV2疫苗開發(fā)研究的主要候選基因之一[7]。并且PCV2的毒力與ORF2基因有很大的關(guān)系，不同地區(qū)分離到的PCV2毒株之所以毒力不同，也很有可能是由于ORF2基因發(fā)生了變異造成的[8]。

目前已發(fā)現(xiàn)PCV2有6種基因亞型(PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e、PCV2f)，其中PCV2a、PCV2b和PCV2d是國內(nèi)主要流行的3種基因亞型毒株[9-10]，而河南省流行的主要為PCV2b[12]和PCV2d亞型毒株[11-12]，但關(guān)于PCV2在豫南地區(qū)的分子流行病學(xué)情況還未見報道。鑒于此，本研究通過對2015年—2018年豫南地區(qū)豬場疑似PCV2發(fā)病豬采集病料，利用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，設(shè)計特異性引物擴(kuò)增部分PCV2陽性毒株的全基因，與國內(nèi)外已發(fā)表毒株相應(yīng)的基因序列比對分析并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，以便分析PCV2在豫南地區(qū)的流行情況和分子遺傳變異規(guī)律，為PCVD的防控和基因型疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2015年-2018 年期間分別采集豫南地區(qū)疑似PCV2感染豬的淋巴結(jié)、脾及肺臟組織樣品，共157份，置-80℃保存以備用。

1.1.2 主要試劑 2×TaqMix混合酶，南京諾唯贊生物科技有限公司(Vazyme)產(chǎn)品；PMD18-T vector、DNA Marker，大連寶生物工程公司(TaKaRa)產(chǎn)品；DNA抽提試劑盒、膠回收試劑盒，愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 PCR儀(MyCycler)，Bio-Rad公司產(chǎn)品；低溫離心機(jī)(5920 R)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠電泳儀(JY-SPAT)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司產(chǎn)品；紫外成像儀(VWR82026-836)，美國 UVP 公司產(chǎn)品等。

1.2 方法

1.2.1 病料的處理 取病料1 g左右作為待檢樣品進(jìn)行研磨，用生理鹽水按1∶5比例稀釋成乳劑反復(fù)凍融3 次，12 000 r/min離心5 min，取上清分裝，置于-80℃保存?zhèn)溆?。按DNA抽提試劑盒的方法提取病毒DNA。

1.2.2 引物的設(shè)計與合成 登錄GenBank參照PCV2序列設(shè)計引物，P1/P2為樣品檢測引物，目的片段為1 154 bp；A1/A2為擴(kuò)增全基因引物，擴(kuò)增出的片段大小為1 767 bp。引物使用終濃度為10 μmol/L，稀釋后置-20℃保存。引物序列如表1所示。

表1 PCR引物序列

1.2.3 病料PCR的檢測 按DNA抽提試劑盒的方法提取病毒DNA，以P1/P2(表1)作為特異性引物檢測PCV2，反應(yīng)體系為25 μL/sample：上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，2×TaqMix12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，DNA模板3 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸50 s，35個循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物通過12 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.4 PCV2陽性毒株全基因組的擴(kuò)增及序列分析 利用A1/A2引物對PCV2陽性標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL/sample：DNA模板3 μL，2×TaqMix25 μL，上、下游引物(10 μmoL/L)各1.0 μL，ddH2O 20 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保存。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物膠回收純化后與PMD-18T載體連接，用A1/A2引物進(jìn)行菌液PCR鑒定，篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確后送至上海杰李公司進(jìn)行序列測定。測序所獲得的基因序列應(yīng)用生物軟件Lasergene、MEGA5.2分析。

1.2.5 所用參考毒株序列 本研究所用參考毒株序列見表2。

表2 PCV2參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 病料PCR檢測結(jié)果

2015年-2018年共采集豫南地區(qū)疑似PCV2感染樣品157份，使用引物P1和P2進(jìn)行PCR檢測。共有43份擴(kuò)增出約1 154 bp大小的目的片斷，與預(yù)期長度一致，為PCV2陽性，樣品陽性率為27.39%。部分陽性結(jié)果見圖1。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～8.擴(kuò)增的目的片段M.DNA Marker DL 2 000; 1-8.PCR products using Pland P2 primers

2.2 陽性樣品全基因組的擴(kuò)增和基因組進(jìn)化分析

2.2.1 PCV2全基因擴(kuò)增結(jié)果 利用PCV2特異性引物A1和A2通過PCR擴(kuò)增PCV2陽性病料的全基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，在2000bp處有特異性條帶，大小約為1.7kb,與預(yù)期一致，見圖2。將擴(kuò)增的全基因PCR產(chǎn)物連接載體克隆測序，得到13株P(guān)CV2豫南株全基因序列，長度均為1 767 bp。分別命名為YuNan1-13。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～18.PCV2全基因擴(kuò)增產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2 000; 1-18.The PCR products of the complete genome of PCV2

2.2.2 PCV2全基因的序列分析 用DNAStar軟件對獲得的13株P(guān)CV2基因序列與國內(nèi)外已發(fā)表的10株代表毒株的全基因序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果見圖2。序列分析結(jié)果顯示本試驗(yàn)所獲得的13株全基因序列之間的核酸同源性為94.2%～99.8%，與國內(nèi)外已發(fā)表毒株同源性為90.7%～99.4%。

2.2.3 PCV2全基因遺傳進(jìn)化樹分析 為了進(jìn)一步探討分離株基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系，本研究所獲得的13株毒株與10株參考毒株構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果見圖3。遺傳進(jìn)化關(guān)系顯示，13株豫南分離株可分為三大分支(PCV2a、PCV2b和PCV2d)。其中有10株屬于PCV2d，2株屬于PCV2b，1株屬于PCV2a，未發(fā)現(xiàn)其他亞型。

圖3 PCV2分離株全基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2.4 13株P(guān)CV2 ORF2氨基酸序列分析 通過DNAStar分析軟件，將13株P(guān)CV2的ORF2與10株參考毒株推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果13株豫南分離株ORF2氨基酸同源性為86.8%～100%，與10株參考毒株ORF2氨基酸序列同源性為80.9%～99.6%。PCV2a基因型分離株與參考毒株ORF2氨基酸同源性為93.5%～97.9%，PCV2b基因型分離株與參考毒株ORF2氨基酸同源性為97.0%～98.3%，PCV2d基因型分離株與參考毒株ORF2氨基酸同源性為95.3%～99.1%。氨基酸序列比較和分析結(jié)果顯示，PCV2各基因型主要在8、53-77、86-91、121、130-134、151、169、185-191、203-217、232的氨基酸位點(diǎn)上表現(xiàn)不同，PCV2a其特異性氨基酸位點(diǎn)在77D、86-91TNKISI，PCV2b其特異性氨基酸位點(diǎn)在89R、210E，PCV2d其特異性氨基酸位點(diǎn)在89L、90T、134N。10株P(guān)CV2d和3株P(guān)CV2d參考毒株的ORF2氨基酸分析比對發(fā)現(xiàn)，近年來分離的PCV2d毒株的ORF2氨基酸序列與2010年前參考毒株對比發(fā)現(xiàn)，氨基酸8Y變異為8F，59位R或A變異為K，68A變異為N，151P變異為T。

3 討論

PCV2不但是一種基因組較小，且有較高進(jìn)化速率的DNA病毒，而且還是影響?zhàn)B豬業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要病原體[13]。目前，在我國不同地區(qū)均具有一定的感染率，且分布廣泛。但關(guān)于PCV2近年來在豫南地區(qū)的流行情況報道較少。本研究通過對來自2015年—2018年期間采集的豫南地區(qū)疑似PCV2感染的157份樣品采用PCV2特異性檢測引物進(jìn)行PCR檢測，檢測出43 份PCV2陽性樣品，陽性率達(dá)27.39%。這一結(jié)果接近連慧香等[14]的調(diào)查結(jié)果，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于黃立等[15]和曲哲會等[16]的調(diào)查結(jié)果，說明豫南地區(qū)當(dāng)前采取的PCV2 綜合防控措施效果較好，但PCV2感染依然存在且較為嚴(yán)重。另外，本研究采集病料的豬場大部分進(jìn)行了PCV2疫苗的免疫，還有如此高的感染率，這可能與病毒的變異有關(guān)。

據(jù)資料報道，國內(nèi)PCV2感染主要流行的有PCV2a亞型、PCV2b亞型和PCV2d亞型，2012 年之后PCV2d逐漸成為優(yōu)勢流行毒株[17]。豫南地區(qū)也是PCV2感染較嚴(yán)重的地區(qū)之一，但關(guān)于PCV2在豫南地區(qū)的分子流行病學(xué)情況還未見報道，為了解豫南地區(qū)PCV2分子流行概況，將檢測為PCV2陽性的部分樣品進(jìn)行全基因的克隆、測序并進(jìn)行序列分析。結(jié)果顯示，獲得的13 株P(guān)CV2全基因序列之間的核酸同源性為94.2%～99.8%，與國內(nèi)外已發(fā)表毒株同源性為90.7%～99.4%，表明PCV2各毒株之間相對保守，具有較高的相似性。通過與國內(nèi)外10株參考株進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)所得到的全基因序列分為3個亞群，10株屬于PCV2d，2 株屬于PCV2b，1株屬于PCV2a。由此可見，PCV2d基因亞型逐漸成為豫南地區(qū)的優(yōu)勢流行毒株。這與李明亮[12]、徐朋麗[18]、時慶賀等[11]和鄧文芳等[19]的研究結(jié)果基本一致。此外，在PCV2d分支中，本研究10株分離株與2017年分離的MG732801處于同一分支，與較早分離的AY181946和EF524517關(guān)系較遠(yuǎn)。PCV2a分支中，本研究中1株分離株與2015年分離的MH663459處于同一分支，與2007年分離的GU049340關(guān)系較遠(yuǎn)；PCV2b分支中，本研究2株分離株與2017年分離的MK281580處于同一分支，與2005年分離的HQ713495關(guān)系較遠(yuǎn)。以上結(jié)果表明，豫南分離株與早期分離株同源性相對較低，與近期分離株同源性相對較高，說明PCV2在豫南地區(qū)也在不斷變異和進(jìn)化。

ORF2基因編碼PCV2的衣殼蛋白(Cap)，是與病毒致病力有關(guān)的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，參與宿主的免疫應(yīng)答和病毒復(fù)制，該蛋白由233或234個氨基酸構(gòu)成，其中53-91 aa、121-151 aa和190-210 aa是3 個主要的異構(gòu)域，包含著4個蛋白質(zhì)表位：69-83 aa、117-131 aa、132-146 aa和195-202 aa。本研究中，通過ORF2基因編碼的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，PCV2各基因型主要在8、53-77、86-91、121、130-134、151、169、185-191、203-217、232的氨基酸位點(diǎn)上表現(xiàn)不同，這些變異位點(diǎn)基本上都位于衣殼蛋白的抗原表位上，可能會導(dǎo)致衣殼蛋白出現(xiàn)新的表面構(gòu)象及病毒毒力和免疫原性的改變，從而使疫苗產(chǎn)生的抗體無法正常識別，這將會導(dǎo)致免疫失敗的發(fā)生。不同基因型有獨(dú)特基因變異位點(diǎn)，這些獨(dú)特的基因變異位點(diǎn)可能構(gòu)成了各基因型特有的表面構(gòu)象而成為特有的基因型。

通過對本研究獲得的10 株P(guān)CV2d和3 株P(guān)CV2d參考毒株的ORF2氨基酸序列分析比對發(fā)現(xiàn)，近年來分離的PCV2d毒株的ORF2氨基酸序列與2010 年前參考毒株對比發(fā)現(xiàn)，氨基酸在8、59、68、151位產(chǎn)生變異，而這些位點(diǎn)的改變可能使病毒毒力改變。此外，有報道提出PCV2d毒株大量存在并流行于免疫后的豬場[20]，其可能的原因是在疫苗免疫誘導(dǎo)的選擇壓力下，基因發(fā)生了突變，導(dǎo)致PCV2的抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，出現(xiàn)具有逃避疫苗免疫能力的PCV2流行毒株，從而導(dǎo)致PCV2d最近幾年的廣泛流行，其具體原因還有待進(jìn)一步探索研究。