滅活枯草芽孢桿菌對(duì)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞β-防御素-1表達(dá)的影響

趙霏霏，辛雅明，楊 丹，楊銀鳳*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

防御素是一類具有6個(gè)保守半胱氨酸的帶正電荷的小分子肽，是廣泛存在于動(dòng)物中[1]的先天免疫重要組成成分，具有廣譜的抗微生物活性和免疫調(diào)節(jié)功能[2-3]。哺乳動(dòng)物防御素根據(jù)其結(jié)構(gòu)中半胱氨酸的位置以及形成二硫鍵的連接方式可進(jìn)一步分為α-防御素、β-防御素和θ-防御素3種類型。其中β-防御素是脊椎動(dòng)物中最大的防御素家族，最初是從牛的上皮細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中分離出來的[4]，隨后的研究幾乎在所有的脊椎動(dòng)物中都鑒定出了β-防御素[5]。研究發(fā)現(xiàn)β-防御素主要是由上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞群分泌[6]，主要通過發(fā)揮抗微生物活性作用和免疫調(diào)控作用來提高機(jī)體的抗病能力[7]。

飼用益生菌是一類綠色、高效、無(wú)殘留的飼料添加劑，在2020年飼料全面禁止添加抗生素后越來越引起人們的關(guān)注[8]。常用的飼用益生菌添加劑主要有芽孢桿菌類、乳酸菌類以及酵母菌等，其中枯草芽孢桿菌是農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄(2013)》中允許添加的兩種飼用芽孢桿菌之一?？莶菅挎邨U菌是一種能產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧菌，具有耐酸、耐高溫、抗逆性強(qiáng)、耐胃腸道各種酶，可以很好的定植于胃腸道內(nèi)消耗胃腸道內(nèi)的氧氣造成厭氧環(huán)境維持胃腸道內(nèi)的微生物平衡，對(duì)動(dòng)物的健康和生長(zhǎng)有積極的影響。相關(guān)研究表明在畜禽日糧中添加枯草芽孢桿菌可以提高生產(chǎn)性能[9]，增強(qiáng)畜禽的免疫功能[10]，但大多研究是從增強(qiáng)免疫細(xì)胞活性方面來闡明枯草芽孢桿菌增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的，在誘導(dǎo)β-防御素表達(dá)方面研究的較少。2015年王佩等[11]用不同濃度的枯草芽孢桿菌刺激綿羊瘤胃上皮細(xì)胞(ovine rumen epithelial cells，ORECs)，發(fā)現(xiàn)活的枯草芽孢桿菌可以顯著上調(diào)綿羊β-防御素-1(sheep β-defesin-1，SBD-1)的表達(dá)，但是其誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)的有效成分并不確定。本試驗(yàn)采用qPCR和ELISA方法檢測(cè)用不同濃度熱滅活枯草芽孢桿菌刺激不同時(shí)間的體外培養(yǎng)的綿羊瘤胃上皮細(xì)胞中SBD-1 mRNA和蛋白表達(dá)量的變化，驗(yàn)證枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)SBD-1的有效成分是否會(huì)被熱滅活，為后續(xù)確定枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)SBD-1有效成分的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 綿羊瘤胃組織 綿羊瘤胃上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)的組織取自于呼和浩特市北亞屠宰場(chǎng)。

1.1.2 供試菌株 枯草芽孢桿菌CMCC63501購(gòu)于中國(guó)微生物菌種網(wǎng)。

1.1.3 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基，Gibico公司產(chǎn)品；青鏈霉素，Gibico公司產(chǎn)品；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；DMSO，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒Axygen公司產(chǎn)品；Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；TB green? Premix ExTaqTM，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；綿羊β-防御素-1 ELISA試劑盒，武漢新啟迪生物科技有限公司。

1.1.4 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀，Bio Tek公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 原代綿羊瘤胃上皮細(xì)胞(ORECs)的培養(yǎng) 原代ORECs的培養(yǎng)參照金鑫等[12]建立的ORECs培養(yǎng)方法進(jìn)行。

1.2.2 枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)及滅活菌的制備 將枯草芽孢桿菌的菌種接種于LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖菌24 h，按照倍比稀釋的方法用無(wú)抗生素的DMEM/F12調(diào)整菌落濃度為107、108、109、1010、1011CFU/mL。在130℃、30 min的條件下使其完全失活。取菌液均勻涂布于固體LB培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)48 h后觀察，無(wú)枯草芽孢桿菌菌落生長(zhǎng)，即滅活成功可用于后續(xù)刺激試驗(yàn)。

1.2.3 滅活枯草芽孢桿菌對(duì)ORECs的刺激試驗(yàn) 將ORECs接種于6孔板中，待細(xì)胞鋪滿板底85%以上時(shí)棄掉培養(yǎng)基，用含青鏈霉素的PBS清洗3次，加入2 mL DMEM/F12培養(yǎng)基，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行24 h的饑餓處理。饑餓處理完成后每孔分別加入200 μL的5種不同濃度的滅活枯草芽孢桿菌，同時(shí)用等體積的DMEM/F12培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，放入37℃溫箱內(nèi)刺激2 h。用PBS清洗3次，繼續(xù)誘導(dǎo)8 h，利用RNA提取試劑盒(Axygen)分別提取各組ORECs總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR技術(shù)檢測(cè)SBD-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，篩選出SBD-1 mRNA表達(dá)量最高的刺激濃度為最佳刺激濃度。用最佳刺激濃度的滅活枯草芽孢桿菌在37℃溫箱刺激ORECs 2h，繼續(xù)分別誘導(dǎo)2 h、4 h、8 h、12 h后分別提取各組ORECs總RNA。用qPCR技術(shù)檢測(cè)SBD-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。收集所有刺激組和對(duì)照組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液存儲(chǔ)在-80℃，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 MTT法檢測(cè)滅活枯草芽孢桿菌對(duì)ORECs的毒性作用 生存狀態(tài)良好的細(xì)胞傳到96孔板中，待細(xì)胞鋪滿板底85%以上時(shí)分別加入5種不同濃度的滅活枯草芽孢桿菌刺激ORECs 8 h和誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)量最高的滅活枯草芽孢桿菌濃度刺激ORECs 2 h、4 h、8 h、12 h，同時(shí)單獨(dú)培養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照組，空白孔只加100 μL DMSO作為空白組。誘導(dǎo)刺激完成后，在每孔加入100 μL的DMEM/F12培養(yǎng)基和10 μL MTT(5 mg/mL)，在37℃、5% CO2條件下孵育4 h，小心吸取培養(yǎng)上清棄掉，然后每孔加入100 μL DMSO，待結(jié)晶充分溶解后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)的OD值，通過計(jì)算細(xì)胞存活率來評(píng)定滅活枯草芽孢桿菌對(duì)ORECs的毒性作用。細(xì)胞存活率=[(試驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)]×100%

1.2.5 ORECs總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 按總RNA提取試劑盒(Axygen)的說明書進(jìn)行操作，提取ORECs的總RNA；使用酶標(biāo)儀檢測(cè)所提RNA在260 nm和280 nm波長(zhǎng)的OD值，分析其濃度和純度，同時(shí)對(duì)RNA做凝膠電泳試驗(yàn)檢測(cè)其完整性。然后將RNA濃度調(diào)整到統(tǒng)一濃度，按照去基因組DNA的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 qPCR方法檢測(cè)SBD-1 mRNA的表達(dá)量 內(nèi)參基因β-actin和目的基因SBD-1的特異性引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成(表1)。qPCR試驗(yàn)按照GreenTB?Premix Ex TaqTM說明書進(jìn)行操作，所有反應(yīng)體系均在冰上配制，在QuantStudioTM7Flex Real-Time PCR System上進(jìn)行反應(yīng)。根據(jù)反應(yīng)得到的CT值，用2-ΔΔCt法計(jì)算出ORECs的SBD-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。qPCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL的產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)其擴(kuò)增產(chǎn)物是否特異單一。

表1 引物序列及擴(kuò)增片段大小

1.2.7 ELISA方法檢測(cè)SBD-1蛋白的表達(dá) 將保存于-80℃的細(xì)胞培養(yǎng)上清在冰上融化，同時(shí)將綿羊SBD-1 ELISA試劑盒從-20℃取出平衡至室溫后按照試劑盒說明書進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。用酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)樣品在450 nm處的OD值，使用GraphPad Prism 7繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到二次多項(xiàng)式擬合方程，并求出各樣品的蛋白表達(dá)量。

1.2.8 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析 分別使用SPSS和GraphPad Prism 7軟件對(duì)試驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和圖標(biāo)的制作。試驗(yàn)結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。其中P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 滅活枯草芽孢桿菌對(duì)ORECs的毒性作用

本試驗(yàn)用與刺激試驗(yàn)相對(duì)應(yīng)的滅活枯草芽孢桿菌濃度和時(shí)間刺激ORECs，之后用MTT法測(cè)定各組ORECs的存活率，以確定滅活枯草芽孢桿菌對(duì)ORECs的毒性作用。結(jié)果如圖1所示，不同濃度的滅活枯草芽孢桿菌刺激ORECs，在試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)細(xì)胞存活率同對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，表明試驗(yàn)用的滅活枯草芽孢桿菌濃度和刺激時(shí)間對(duì)ORECs的細(xì)胞活性幾乎沒有影響。

A.不同濃度滅活枯草芽孢桿菌對(duì)ORECs的活性影響; B.滅活枯草芽孢桿菌刺激不同時(shí)間對(duì)ORECs的活性影響

2.2 總RNA純度及質(zhì)量分析

將ORECs總RNA經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果出現(xiàn)了RNA具有代表性的28S、18S和5S 3個(gè)條帶，條帶清晰且無(wú)拖尾(圖2)，說明提取的RNA完整無(wú)降解。酶標(biāo)儀檢測(cè)在260 nm/280 nm處OD值比值在2.0左右，說明所提RNA無(wú)蛋白及多糖污染，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 ORECs總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 β-actin和SBD-1基因qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性分析

2.3.1 β-actin和SBD-1基因擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析 以所提ORECs總RNA為模板反轉(zhuǎn)為cDNA，以β-actin為內(nèi)參基因，SBD-1為目的基因，經(jīng)qPCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示，擴(kuò)增曲線出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的S型曲線，表明擴(kuò)增效果良好(圖3A、B)；經(jīng)熔解曲線分析β-actin和SBD-1，分別在88.5℃和84℃出現(xiàn)單一的峰，沒有異常增寬的峰和雜峰，且主峰對(duì)應(yīng)Tm值與預(yù)期產(chǎn)物的Tm相一致(圖3C、D)。

A.β-actin的擴(kuò)增曲線；B.SBD-1的擴(kuò)增曲線；C.β-actin的溶解曲線；D.SBD-1的溶解曲線A.Amplification curve of β-actin; B.SBD-1 amplification curve; C.The dissolution curve of β-actin; D.Dissolution curve of SBD-1

2.3.2 qPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析 將β-actin和SBD-1的qPCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示，在208 bp和133 bp的位置上各出現(xiàn)一條單一的條帶，與引物設(shè)計(jì)的預(yù)期大小相符，擴(kuò)增條帶整齊且無(wú)引物二聚體，可以確定qPCR產(chǎn)物分別為β-actin和SBD-1的特異性產(chǎn)物。

Marker:DL 2 000

2.4 滅活枯草芽孢桿菌刺激ORECs對(duì)SBD-1 mRNA表達(dá)量的影響

為確定滅活枯草芽孢桿菌對(duì)ORECs SBD-1 mRNA表達(dá)量的影響，首先用107、108、109、1010、1011CFU/mL的滅活枯草芽孢桿菌刺激ORECs 2 h，同時(shí)設(shè)置未刺激組作為空白對(duì)照，誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h后，通過數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如圖5 A所示，107CFU/mL組與空白對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，其他濃度的刺激組與空白對(duì)照組相比SBD-1 mRNA表達(dá)量均增加，并且呈極顯著差異(P<0.01)。隨著滅活枯草芽孢桿菌濃度的增加，SBD-1 mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，在刺激濃度為1010CFU/mL達(dá)到峰值，之后SBD-1 mRNA表達(dá)量開始下降。選取誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)量最高的1010CFU/mL濃度滅活枯草芽孢桿菌刺激ORECs 2 h、4 h、8 h、12 h后，發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加SBD-1 mRNA的表達(dá)量隨著增加，到8 h的時(shí)候達(dá)到峰值，并且與空白對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，8 h以后SBD-1 mRNA的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)(圖5 B)。通過以上分析可知，1010CFU/mL的滅活枯草芽孢桿菌刺激ORECs 8 h時(shí)SBD-1 mRNA表達(dá)量最高。

A.不同濃度滅活枯草芽孢桿菌對(duì)ORECs SBD-1 mRNA表達(dá)的影響；B.最佳刺激濃度誘導(dǎo)不同時(shí)間對(duì)ORECs SBD-1 mRNA表達(dá)量的影響。**.P<0.01；*.P<0.05；

2.5 滅活枯草芽孢桿菌對(duì)ORECs SBD-1蛋白表達(dá)量的影響

2.5.1 ELISA試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 ELISA試驗(yàn)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示，橫坐標(biāo)為不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品在450 nm波長(zhǎng)的吸光值，縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，其二次多項(xiàng)式擬合方程為y=347.35x2+1972.8x-154.3，相關(guān)系數(shù)R2為0.998 5，說明所測(cè)的樣品蛋白濃度可以用此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

圖6 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.2 滅活枯草芽孢桿菌對(duì)ORECs SBD-1蛋白表達(dá)量的影響 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線計(jì)算出SBD-1的表達(dá)量，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理分析，結(jié)果如圖7所示，SBD-1在蛋白水平上與mRNA水平的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，表達(dá)趨勢(shì)也呈先上升后下降的趨勢(shì)，在刺激濃度為1010CFU/mL時(shí)蛋白表達(dá)量達(dá)到峰值，與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。用1010CFU/mL刺激ORECs

A.不同濃度滅活枯草芽孢桿菌對(duì)ORECs SBD-1蛋白表達(dá)影響；B.最佳刺激濃度誘導(dǎo)不同時(shí)間對(duì)ORECs SBD-1蛋白表達(dá)量影響。**P<0.01

2 h、4 h、8 h、12 h時(shí)SBD-1的表達(dá)量從4 h開始與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，并隨著刺激時(shí)間的增減，SBD-1的表達(dá)量呈遞增的趨勢(shì)。與mRNA水平不同的是刺激12 h后的蛋白濃度高于10 h刺激組。

3 討論

近年來畜牧業(yè)迅速的發(fā)展，從之前的散養(yǎng)、小規(guī)模養(yǎng)殖，逐漸發(fā)展為集約化、規(guī)模化養(yǎng)殖，由于飼養(yǎng)數(shù)量和密度的增加，容易導(dǎo)致病原微生物的富集，飼養(yǎng)動(dòng)物機(jī)體的抵抗力下降，飼養(yǎng)的動(dòng)物更加容易患病，這增加了養(yǎng)殖業(yè)的風(fēng)險(xiǎn)?？股仉m然可以防治動(dòng)物疾病的發(fā)生和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[13]，但是其容易在畜產(chǎn)品內(nèi)殘留，以及引起細(xì)菌的耐藥性等缺點(diǎn)，甚至影響人類的健康，因此控制抗生素在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的用量，開發(fā)取代抗生素的藥品成為了研究的新熱點(diǎn)[14]。β-防御素是機(jī)體自身分泌的抗微生物活性肽，在維持動(dòng)物自身健康上發(fā)揮重要的作用，但是在體內(nèi)固有表達(dá)量很少，而且用化學(xué)、生物工程等手段合成成本太高，這些原因造成了防御素難以規(guī)模化生產(chǎn)，不能廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐[15]。β-防御素具有可誘導(dǎo)性，用合適的誘導(dǎo)劑可以增加β-防御素表達(dá)量，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病原微生物的抵抗力，這也是一種有效的利用防御素的方法[16]。

本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)滅活枯草芽孢桿菌可以誘導(dǎo)ORECs SBD-1 mRNA的表達(dá)，滅活枯草芽孢桿菌以不同濃度誘導(dǎo)8 h時(shí)，SBD-1的mRNA和蛋白水平都呈先上升后下降的趨勢(shì)，并且都是在濃度為1010CFU/mL時(shí)達(dá)到峰值。用濃度為1010CFU/mL的滅活枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)ORECs 2 h、4 h、8 h、12 h，SBD-1 mRNA表達(dá)量隨著刺激時(shí)間的增加先上升后下降且在8 h時(shí)的表達(dá)量最大，這與本課題組前期研究的活枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)ORECs SBD-1 mRNA的表達(dá)的結(jié)果相一致。黎觀紅等[17]等人用鼠李糖乳桿菌刺激雞小腸上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌可以顯著提高雞抗菌肽AvBD9的表達(dá)，菌液濃度為2×106CFU/mL刺激12 h AvBD9表達(dá)達(dá)到峰值。金鑫等[18]研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母菌可顯著提高ORECs SBD-1的表達(dá)，且菌液濃度為5.2×107CFU/mL刺激綿羊瘤胃上皮細(xì)胞12 h后，SBD-1mRNA表達(dá)達(dá)到峰值。張曼等[19]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母菌β-葡聚糖可誘導(dǎo)ORECs SBD-1的表達(dá)，β-葡聚糖濃度為10 μg/mL刺激ORECs 2 h時(shí)SBD-1 mRNA表達(dá)達(dá)到峰值。金鑫等[20]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母菌甘露聚糖可誘導(dǎo)ORECs SBD-1的表達(dá)甘露聚糖濃度為50 μg/mL刺激ORECs 4 h時(shí)SBD-1 mRNA表達(dá)達(dá)到峰值。以上研究揭示了益生菌及其細(xì)胞成分可以誘導(dǎo)防御素的表達(dá)，益生菌細(xì)胞的不同成分，在誘導(dǎo)防御素的表達(dá)上最佳的刺激濃度和時(shí)間也不相同。通過以上論證我們可推測(cè)，枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)ORECs SBD-1表達(dá)的有效成分沒有被熱滅活，那么枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)ORECs SBD-1表達(dá)的有效成分可能是熱穩(wěn)定性較強(qiáng)的細(xì)胞成分，為后續(xù)確定枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)ORECs SBD-1表達(dá)的有效成分的研究提供了思路。

本試驗(yàn)通過體外細(xì)胞試驗(yàn)證明了熱滅活的枯草芽孢桿菌可以顯著提高ORECs mRNA和蛋白的表達(dá)，且呈濃度和時(shí)間依賴性，為枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)的有效成分的研究提供了基礎(chǔ)。