雞源彎曲菌的分離鑒定和耐藥性檢測

廖昕萌，陳凱風(fēng)，周華亮，林琦杰，張建民*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)檢驗與生物技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510515；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部人獸共患病重點實驗室/廣東省動物源性人獸共患病重點實驗室/人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實驗室，廣東廣州 510642；3.深圳海關(guān)動植物檢驗檢測技術(shù)中心，廣東深圳 518026)

彎曲菌(Campylobacter)是一種重要的人畜共患病原菌，常見的有空腸彎曲菌(C.jejuni)和結(jié)腸彎曲菌(C.coli)[1-2]。人可通過食用未煮熟的肉類感染彎曲菌[3]，嚴(yán)重時會引起吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-barrst.Ref.96a，GBS)[4]。據(jù)監(jiān)測網(wǎng)估算，彎曲菌每年可致全球1.66億人感染[5]。近幾年彎曲菌污染情況日益嚴(yán)重，在歐洲一些地區(qū)彎曲菌已成為首要的致病菌，其發(fā)病率已經(jīng)超過了沙門氏菌、志賀氏菌及李斯特氏菌。而在中國食源性致病菌中彎曲菌占比10.8%，僅次于大腸埃希氏菌，成為第二大致病菌[5]。已有研究表明，雞肉是彎曲菌的主要傳染源[6]，彎曲菌可在雞腸道內(nèi)大量定殖。因此，在規(guī)?；B(yǎng)殖場中很容易發(fā)生彎曲菌的流行和傳播。

目前，對于彎曲菌的治療主要采用抗生素，但由于抗生素在畜禽養(yǎng)殖中的不規(guī)范使用，彎曲菌的耐藥性顯著升高[7-8]，已有研究表明耐藥彎曲菌多來自于禽類，且對環(huán)丙沙星和四環(huán)素耐藥性呈上升趨勢[9]，其中結(jié)腸彎曲菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥率普遍較高[10]。由此可見，對肉雞彎曲菌的耐藥性研究顯得尤為重要。

廣東省是肉雞養(yǎng)殖和消費大省，但肉雞養(yǎng)殖中彎曲菌的研究數(shù)據(jù)相對較少。因此，本研究以廣東省某肉雞養(yǎng)殖場為研究對象，跟蹤監(jiān)測該場彎曲菌的流行和耐藥情況，為肉雞養(yǎng)殖中彎曲菌病的預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 藥敏試驗質(zhì)控菌株(彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 NCTC11168)為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動物傳染病教研室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Columbia Blood Agar Base)、改良 CCD 瓊脂培養(yǎng)基、改良 Skirrow 氏瓊脂、去纖維綿羊血PBS溶液，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；丙三醇(甘油)、Goldview核酸染料，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；rTaqDNA聚合酶(PremixTaq)、DNA Marker DL 2 000，TaKaRa公司產(chǎn)品；瓊脂糖，Biowest公司產(chǎn)品；無菌脫纖維綿羊血，廣州蕊特生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.1.3 藥敏試紙 藥敏紙片，英國OXOID公司產(chǎn)品；ESBLs藥敏紙片，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 純水儀(Elix100)，美國Millipore公司產(chǎn)品；離心機(jī)(5430 R)，Eppendorf公司產(chǎn)品；高壓蒸汽滅菌鍋(MLS-3780)，日本Sanyo公司產(chǎn)品；超凈工作臺(YJ-1450)，蘇州凈化設(shè)備廠產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR)、PCR儀(T100 Thermal Cycler)、電泳儀(Power PacTM)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 彎曲菌的分離與鑒定 樣品的采集和分離純化主要參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.9-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 空腸彎曲菌檢驗》。于2018年12月至2019年6月從廣東省廣州市某肉雞養(yǎng)殖場中隨機(jī)采集泄殖腔拭子樣品140份。所有樣品在2 h內(nèi)與干冰一起轉(zhuǎn)移到實驗室，之后將棉簽拭子直接劃線到哥倫比亞血瓊脂平板上(含50 mL/L無菌脫纖維綿羊血)，然后在微需氧條件(85% N2，10% CO2，5% O2)下42℃培養(yǎng)48 h，挑取具有彎曲菌特征的菌落，同時三區(qū)劃線接種在Skirrow血瓊脂平板和CCD瓊脂平板上，繼續(xù)培養(yǎng)36 h～48 h，再次挑取具有明顯彎曲菌特征的疑似菌落采用煮沸法提取DNA模板，通過彎曲菌屬16S rRNA、空腸彎曲菌MapA基因和結(jié)腸菌ceuE基因的多重PCR進(jìn)一步鑒定。引物序列相關(guān)信息見表1。

表1 彎曲菌PCR鑒定引物

PCR反應(yīng)體系為25 μL：16S rRNA 上、下游引物各0.3 μL，mapA、ceuE上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，rTaq聚合酶12.5 μL，ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。

PCR反應(yīng)程序為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 90 s，72℃ 60 s，共35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.2.2 藥敏試驗 選擇9類12種抗菌藥物，根據(jù)世界衛(wèi)生組織推薦的KB紙片擴(kuò)散法和美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦的Kirby-Bauer法進(jìn)行抗生素藥物敏感性試驗，彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌 NCTC11168為質(zhì)控菌，結(jié)果參照CLSI制定的藥敏試驗抑菌環(huán)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判斷。12種藥敏紙片名稱規(guī)格及判斷標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 KB法藥敏試驗判定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 耐藥基因檢測 對分離到的彎曲菌用PCR擴(kuò)增的方法檢測三大類常用于彎曲菌治療藥物的耐藥基因，分別為大環(huán)內(nèi)酯類：ermB；氨基糖苷類：aacA4、aac(6′)-Ie、aph(2″)-If、aph2-Ig；四環(huán)素類：tet(O)。參照文獻(xiàn)[11-12]設(shè)計三類耐藥基因鑒定引物，具體的序列信息見表3。

表3 耐藥基因引物信息

PCR反應(yīng)體系為25 μL：上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，rTaq聚合酶12.5 μL，ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。

PCR反應(yīng)程序為：預(yù)變性95℃ 5 min；變性95℃ 30 s，退火溫度按照表3中的退火溫度設(shè)置30 s，延伸72℃ 60 s，共35個循環(huán)；最后延伸72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 彎曲菌分離鑒定結(jié)果

陽性彎曲菌分離株在改良Skirrow瓊脂平板上形成灰色、扁平、有光澤的菌落。通過多重PCR檢測，電泳可見空腸彎曲菌擴(kuò)增出2條大小為857 bp和589 bp的目的片段，結(jié)腸彎曲菌擴(kuò)增出2條大小為857 bp和462 bp的目的片段(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；N.陰性對照；1～16.空腸彎曲菌(857 bp和589 bp)；17～22.結(jié)腸彎曲菌(857 bp和462 bp)M.DNA Marker DL 2 000；N.Negative control；1-16.C.jejuni (857 bp and 589 bp)；17-22.C.coli (857 bp and 462 bp)

從廣東省某肉雞養(yǎng)殖場共采集泄殖腔拭子樣品140份，共分離到75株彎曲菌，分離率為53.6%，其中結(jié)腸彎曲菌的分離率為30.0%(42/140)，空腸彎曲菌的分離率為23.6%(33/140)，結(jié)腸彎曲菌的分離率高于空腸彎曲菌的分離率。

2.2 彎曲菌分離株的耐藥情況

KB紙片法檢測結(jié)果表明，75株分離菌對12種抗菌藥物耐藥率最高的是萘啶酸(88.0%)，其次是四環(huán)素(81.3%)、磺胺復(fù)合物(80.0%)、鏈霉素(80.0%)、克林霉素(77.3%)、紅霉素(73.3%)、環(huán)丙沙星(73.3%)、氨芐西林(72.0%)、慶大霉素(68.0%)、氟苯尼考(29.3%)，對阿米卡星(17.3%)和替加環(huán)素(2.7%)的耐藥率相對較低。有2株結(jié)腸彎曲菌對替加環(huán)素產(chǎn)生耐藥，耐藥率為2.7%?？傮w上看，結(jié)腸彎曲菌分離株耐藥率高于空腸彎曲菌分離株。75株彎曲菌中有69株彎曲菌對3類及以上的藥物耐藥，為多重耐藥菌株，多重耐藥率達(dá)到了92.0%(69/75)，結(jié)腸彎曲菌和空腸彎曲菌的多重耐藥率分別達(dá)到了52.0%和40.0%。多重耐藥中主要以耐7種和6種抗菌藥物的菌株為主，占比分別為15.0%和15.4%，其次為耐8種抗菌藥物(9.8%)、耐5種抗菌藥物(9.8%)和耐4種抗菌藥物(8.4%)。有1株結(jié)腸彎曲菌對12種抗菌藥物全部產(chǎn)生耐藥。

75株彎曲菌共產(chǎn)生了47個耐藥譜，其中結(jié)腸彎曲菌產(chǎn)生了31個耐藥譜，空腸彎曲菌產(chǎn)生了22個耐藥譜。結(jié)腸彎曲菌耐藥譜中優(yōu)勢耐藥譜為GEN+STR+ERY+CIP+NAL+TET+CLI+FFC+AMP+SXT(25.8%)，空腸彎曲菌耐藥譜中優(yōu)勢耐藥譜為GEN+STR+ERY+CIP+NAL+TET+CLI+AMP+SXT(31.8%)。

2.3 耐藥基因的檢測

對四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類和氨基糖苷類三大類常用抗生素進(jìn)行耐藥基因攜帶率的檢測結(jié)果顯示，檢出率最高的是四環(huán)素類耐藥基因tet(O)，為62.7%；其次為大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB和氨基糖苷類耐藥基因aph(2″)-If，分別為54.7%和48.0%，而氨基糖苷類耐藥基因aac(6′)、aacA4、aph2-Ig的檢出率較低，依次為10.7%、4.0%、12.0%?？傮w上，結(jié)腸彎曲菌的耐藥基因攜帶率要比空腸彎曲菌的高，且aac(6′)和aacA4在空腸彎曲菌中并未檢出。

3 討論

彎曲菌是一種重要的食源性致病菌，其中家禽被認(rèn)為是人類感染彎曲菌的主要來源[13]。隨著養(yǎng)殖業(yè)、食品貿(mào)易的國際化，多數(shù)發(fā)達(dá)國家都有一套對彎曲菌的系統(tǒng)化監(jiān)控計劃。發(fā)展中國家也越來越重視食品動物源性彎曲菌的流行情況監(jiān)測[14]。在對廣東省某肉雞養(yǎng)殖場中彎曲菌的分離鑒定和耐藥性研究檢測中發(fā)現(xiàn)，彎曲菌的分離率(53.6%)比張小燕等[15]報道的江蘇地區(qū)雞源彎曲菌分離率(38.68%)和張秀麗等[16]報道的河南省肉雞養(yǎng)殖場彎曲菌的分離率(31.1%)均要高。盡管我們的研究是在冬春季節(jié)采樣，溫度相對較低，但彎曲菌分離率依舊很高，可以看出廣東省彎曲菌的污染情況較為嚴(yán)重，這可能是由于華南地區(qū)常年高溫濕潤的天氣更有利于彎曲菌的生長繁衍。

在分離株中結(jié)腸彎曲菌的分離率(30.0%)比空腸彎曲菌的分離率(23.6%)高，與之前國內(nèi)外其他地區(qū)報道的空腸彎曲菌分離率較高的流行規(guī)律不同[17-19]。原因可能是不同地區(qū)氣候情況、季節(jié)性變化、地理位置、常規(guī)消毒和整體消毒的不同造成了彎曲菌流行分布的差異。

在本研究中彎曲菌分離株對氟喹諾酮類藥物顯示出了較高的耐藥率，特別是對萘啶酸耐藥率達(dá)到了88.0%，可能是因為氟喹諾酮類藥物是經(jīng)驗性治療未確診腹瀉的首選藥物，應(yīng)用較為廣泛所致。四環(huán)素可作為氟喹諾酮類藥物的替代藥用于彎曲菌的治療，但在本研究中四環(huán)素類抗生素的耐藥率高達(dá)81.3%。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(如紅霉素)是治療經(jīng)培養(yǎng)確認(rèn)的彎曲桿菌病例的一線藥物，當(dāng)發(fā)生嚴(yán)重的全身感染時應(yīng)使用氨基糖苷類藥物(如慶大霉素)進(jìn)行治療，本研究顯示紅霉素(73.3%)和慶大霉素(68.0%)的高耐藥率，與之前國內(nèi)的報道一致[20]，但是遠(yuǎn)高于先前國外的相關(guān)耐藥報道。這表明我國彎曲菌的耐藥性已經(jīng)比較嚴(yán)重。值得注意的是，替加環(huán)素被稱為治療細(xì)菌性感染的最后一道防線，在本研究中有2株結(jié)腸彎曲菌對其產(chǎn)生了耐藥，耐藥率為2.7%。

本研究肉雞養(yǎng)殖場彎曲菌的多重耐藥率高達(dá)92.0%，提示廣東省彎曲菌的耐藥情況嚴(yán)峻，應(yīng)該做好相關(guān)的檢測和監(jiān)控。在耐藥率和多重耐藥率方面，結(jié)腸彎曲菌均要高于空腸彎曲菌，這也可能是本研究養(yǎng)殖場中結(jié)腸彎曲菌分離率高于空腸彎曲菌的原因。

由于分離彎曲菌對常用于彎曲菌治療的四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和氨基糖苷類三類抗生素產(chǎn)生了較高的耐藥率，所以在耐藥基因方面做了進(jìn)一步的研究。發(fā)現(xiàn)四環(huán)素耐藥基因tet(O)的攜帶率最高為62.7%，這個結(jié)果與之前報道的tet(O)為最高攜帶率耐藥基因的結(jié)果一致[21]，但是，在本研究中四環(huán)素的耐藥率并不是最高，這表明在導(dǎo)致四環(huán)素的耐藥方面還可能存在其他的機(jī)制。在大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因攜帶方面發(fā)現(xiàn)ermB基因呈現(xiàn)陽性，該基因不僅可以介導(dǎo)大環(huán)內(nèi)酯類高水平耐藥，而且在自然條件下可在不同的菌株之間進(jìn)行水平傳播，因此，該基因的攜帶可能會引起養(yǎng)殖場對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥率的進(jìn)一步升高。氨基糖苷類耐藥基因中以aph(2″)-If的檢出(48.0%)為主，這與之前報道的aph(2″)-If的檢出率遠(yuǎn)高于其他基糖苷類耐藥基因的結(jié)果相同[22]。這表明aph(2″)-If可能是造成氨基糖苷類藥物耐藥的主要原因。

綜上所述，該雞場彎曲菌分離率較高，彎曲菌污染較為嚴(yán)重，提示在肉雞養(yǎng)殖場中應(yīng)加強(qiáng)彎曲菌的檢測和防控。分離株中結(jié)腸彎曲菌為優(yōu)勢菌株，且分離的彎曲菌耐藥和多重耐藥情況嚴(yán)重，因此在防控方面應(yīng)該根據(jù)實際流行狀況規(guī)范用藥。研究結(jié)果補(bǔ)充了廣東地區(qū)肉雞養(yǎng)殖場彎曲菌流行病學(xué)數(shù)據(jù)，可為彎曲菌病的防控和治療提供科學(xué)依據(jù)。