實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)在泌尿生殖道淋病中的應(yīng)用

王彥彬 李瑞鵬 鐘春燕 諸靖宇 徐智慧

實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)在泌尿生殖道淋病中的應(yīng)用

王彥彬 李瑞鵬 鐘春燕 諸靖宇 徐智慧

目的 探討實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（SAT）檢測(cè)泌尿生殖道淋病的靈敏度、特異度以及監(jiān)測(cè)療效的實(shí)用性。方法 回顧性分析12 816例因懷疑泌尿道淋球菌感染需行淋球菌檢測(cè)受試者臨床資料，其中淋球菌培養(yǎng)檢測(cè)6 323例，基于SAT開(kāi)發(fā)的淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒（NG-SAT）檢測(cè)7 107例，比較2種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率；再以淋球菌培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算同時(shí)行以上2種檢測(cè)的614例患者NG-SAT檢測(cè)尿液樣本的靈敏度和特異度；對(duì)2種檢測(cè)結(jié)果有差別的標(biāo)本，進(jìn)行熒光定量DNA雜交及聚合酶鏈反應(yīng)法（FQ-PCR）復(fù)測(cè)與分析；對(duì)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的患者進(jìn)行頭孢曲松治療，待癥狀消失后3d再次行以上2種檢測(cè)。結(jié)果 NG-SAT檢測(cè)尿液標(biāo)本的靈敏度為100.0%，特異度為98.2%。2種檢測(cè)結(jié)果有差別的標(biāo)本7份，均為SAT檢測(cè)陽(yáng)性、淋球菌培養(yǎng)陰性；FQ-PCR復(fù)測(cè)結(jié)果顯示6份陽(yáng)性、1份陰性。179例患者經(jīng)頭孢曲松治療后，NG-SAT檢測(cè)陽(yáng)性15例，淋球菌培養(yǎng)陽(yáng)性7例。結(jié)論 NG-SAT檢測(cè)尿液中淋球菌簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，且能準(zhǔn)確判斷預(yù)后，值得臨床推廣應(yīng)用。

淋病 實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù) 淋球菌培養(yǎng) 尿液

我國(guó)性傳播疾病監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，淋病發(fā)病率在30/ 10萬(wàn)左右[1]；其發(fā)病率高、社會(huì)危害性大，感染后若不及時(shí)治療，可伴發(fā)多種合并癥。早期診斷與治療是控制淋病傳播的關(guān)鍵。目前國(guó)內(nèi)仍以淋球菌培養(yǎng)法為主，雖然其準(zhǔn)確度高，但采樣困難、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)。近年來(lái)，新的淋球菌檢測(cè)方法不斷涌現(xiàn)[2-3]，其中實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（SAT）是2011年上海仁度公司在RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（TMA）基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的新一代核酸檢測(cè)技術(shù)，可同時(shí)檢測(cè)尿液和拭子，是一種非侵入性檢測(cè)方法，目前國(guó)內(nèi)已用于臨床結(jié)核桿菌、解脲脲原體、淋球菌等的檢測(cè)[4]。本研究以傳統(tǒng)淋球菌培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，分析基于SAT開(kāi)發(fā)的淋球菌核酸檢測(cè)試劑盒（NG-SAT）檢測(cè)泌尿生殖道淋病的靈敏度、特異度以及監(jiān)測(cè)療效的實(shí)用性，為NG-SAT檢測(cè)的臨床推廣提供依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2012年2月至2015年11月在杭州市第三人民醫(yī)院就診、因懷疑泌尿道淋球菌感染而行淋球菌檢測(cè)的1 2816例受試者臨床資料，年齡14～71（33.65±7.33）歲；出現(xiàn)癥狀時(shí)間（7.67±1.29）d；6 323例進(jìn)行了淋球菌培養(yǎng)，7 107例進(jìn)行了NG-SAT檢測(cè)，614例2種方法同時(shí)檢測(cè)[男369例（臨床診斷為尿道炎），女245例（臨床診斷為尿道炎或?qū)m頸炎）]。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 淋球菌分離培養(yǎng)基購(gòu)自珠海銀科醫(yī)學(xué)工程公司。SAT引物由上海仁度生物工程股份有限公司合成，RNA探針由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，Lightcy cycle 480熒光定量PCR儀購(gòu)自Roche公司。ABI 7500熒光定量 PCR儀購(gòu)自美國(guó) Applied Biosystems公司，PCR法試劑盒購(gòu)自上海復(fù)興長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司提供。

1.2.2 標(biāo)本采集 所有臨床檢驗(yàn)標(biāo)本均采集于杭州市第三人民醫(yī)院門(mén)診。（1）培養(yǎng)法標(biāo)本：用無(wú)菌棉簽采集男性患者尿道內(nèi)2～4cm分泌物（尿道拭子），采集女性患者宮頸口內(nèi)側(cè)0.5～1cm分泌物黏液（宮頸拭子），立即接種于淋球菌選擇性培養(yǎng)基（T-M），置于35℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。圓形、凸起、濕潤(rùn)、半透明或灰白為淋球菌特征，氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性和革蘭染色陰性的雙球菌判定為淋球菌陽(yáng)性。（2）SAT法標(biāo)本：標(biāo)本采集前2h內(nèi)不排尿，采集首段尿樣約1ml，并與lml尿樣保存液（試劑盒提供）混勻獲得尿液樣本，凍存于-70℃待檢。

1.2.3 SAT檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，400μl加有尿樣保存液的尿液樣本與100μl核酸提取液混勻，60℃恒溫5min，室溫放置10min，依次轉(zhuǎn)移到半自動(dòng)核酸提取儀上進(jìn)行提取，核酸RNA提取完成后，吸取30μl擴(kuò)增檢測(cè)液（含磁珠）至微量反應(yīng)管，預(yù)熱后加酶，在同一溫度下（42℃），以RNA為起始模板，通過(guò)MMLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生一個(gè)雙鏈DNA拷貝，利用T7-RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生100～1 000個(gè)RNA拷貝；每個(gè)RNA拷貝再?gòu)姆崔D(zhuǎn)錄開(kāi)始進(jìn)入下一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)帶，轉(zhuǎn)至Light Cycler 480熒光定量PCR儀中啟動(dòng)反應(yīng)程序。反應(yīng)程序：熒光標(biāo)記選擇羧基熒光素，42℃1min，共40個(gè)循環(huán)；每分鐘收集1次熒光信號(hào)，共檢測(cè)40次。

1.2.4 熒光定量DNA雜交及聚合酶鏈反應(yīng)法（FQ-PCR）檢測(cè) 使用ABI 7500熒光定量PCR儀，對(duì)NG-SAT檢測(cè)結(jié)果與淋球菌培養(yǎng)結(jié)果有差別的標(biāo)本、留存的拭子樣本進(jìn)行FQ-PCR復(fù)測(cè)，按照PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.5 治療方法及療效監(jiān)測(cè) 對(duì)614例同時(shí)行NGSAT檢測(cè)和淋球菌培養(yǎng)且至少1種檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的患者進(jìn)行頭孢曲松靜脈滴注抗感染治療，劑量2g，療程3～6d，停藥標(biāo)準(zhǔn)為癥狀消失且尿常規(guī)WBC轉(zhuǎn)陰；待癥狀消失后3d再行NG-SAT檢測(cè)與淋球菌培養(yǎng)，采樣及檢測(cè)方法同上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法；計(jì)量資料用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以淋球菌培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算SAT檢測(cè)尿液樣本、拭子樣本的靈敏度和特異度；對(duì)2種檢測(cè)結(jié)果有差別的樣本，根據(jù)Real-time RT-PCR復(fù)測(cè)結(jié)果作進(jìn)一步分析。

2 結(jié)果

2.1 2種方法檢測(cè)結(jié)果 NG-SAT檢測(cè)陽(yáng)性率為37.7%（2 679/7 107），高于淋球菌培養(yǎng)陽(yáng)性率35.9%（2 270/ 6 323），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.631，P＜0.05）。

2.2 NG-SAT檢測(cè)靈敏度和特異度 同時(shí)行淋球菌培養(yǎng)和NG-SAT檢測(cè)614例，以淋球菌培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，NG-SAT檢測(cè)靈敏度為100.0%，特異度為98.2%，假陰性率為0.0%，假陽(yáng)性率為1.8%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為96.9%，陰性預(yù)測(cè)值100.0%，Kappa值為0.975，見(jiàn)表1。以上2種檢測(cè)結(jié)果有差別的標(biāo)本有7份，均為NG-SAT檢測(cè)陽(yáng)性、淋球菌培養(yǎng)陰性；FQ-PCR復(fù)測(cè)結(jié)果顯示6份陽(yáng)性，1份陰性。

表1 614例同時(shí)行淋球菌培養(yǎng)和NG-SAT檢測(cè)的結(jié)果（例）

2.3 療效監(jiān)測(cè)結(jié)果 對(duì)227例患者進(jìn)行頭孢曲松抗感染治療，其中179例癥狀完全消失后3d門(mén)診復(fù)查，NG-SAT檢測(cè)陽(yáng)性15例（8.38%），淋球菌培養(yǎng)陽(yáng)性7例（3.91%），兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.122），見(jiàn)表2。

表2 隨訪179例同時(shí)行淋球菌培養(yǎng)和NG-SAT檢測(cè)的結(jié)果（例）

3 討論

淋病是我國(guó)重點(diǎn)監(jiān)測(cè)與報(bào)疫的8種性傳播疾病之一[1]。男性淋病可伴有前尿道、后尿道、精囊、附睪等部位炎癥，嚴(yán)重者淋球菌可侵入血液而引起敗血癥；女性淋病可合并上生殖系統(tǒng)感染，如淋菌性盆腔炎、子官內(nèi)膜炎、輸卵管炎、輸卵管卵巢囊腫、盆腔膿腫、腹膜炎等[5]。淋病早期檢測(cè)對(duì)病情控制十分重要[6]。目前淋球菌檢測(cè)主要采集泌尿生殖道分泌物為標(biāo)本，會(huì)給患者帶來(lái)取樣痛苦，降低其檢測(cè)意愿；此外，在敏感度和特異度亦存在不足[3]。男性淋菌性尿道炎患者發(fā)病期尿道口膿液通常較多，在尿道口或較淺尿道取樣均可檢出陽(yáng)性；而病程較長(zhǎng)者，尿道分泌物可能較少或沒(méi)有，易造成漏檢，因此病程較長(zhǎng)者往往淋球菌陽(yáng)性檢出率偏低[7]。NG-SAT是一種可同時(shí)檢測(cè)泌尿生殖道分泌物和尿液標(biāo)本的非侵入性檢查方法，本研究采集受試者的尿液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，不僅減輕了患者痛苦，也減少了臨床醫(yī)生的工作量。本研究結(jié)果顯示NG-SAT檢測(cè)尿液標(biāo)本的淋球菌陽(yáng)性檢出率明顯高于傳統(tǒng)淋球菌培養(yǎng)泌尿生殖道分泌物。以淋球菌培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，NG-SAT檢測(cè)靈敏度為100.0%，特異度為98.2%，假陰性率為0.0%，假陽(yáng)性率為1.8%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為96.9%，陰性預(yù)測(cè)值100.0%，kappa值為0.975。在療效監(jiān)測(cè)方面，淋球菌培養(yǎng)法易受到臨床使用抗生素的影響，可能無(wú)法在標(biāo)本培養(yǎng)出細(xì)菌，從而出現(xiàn)假陰性結(jié)果，影響臨床醫(yī)生對(duì)淋球菌治療效果的判斷；而NG-SAT檢測(cè)不受臨床用藥干擾，能準(zhǔn)確反映出淋球菌患者的治療效果。本研究經(jīng)門(mén)診頭孢曲松抗感染治療后復(fù)檢，有8例患者淋球菌培養(yǎng)陰性而NG-SAT檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性。

目前，非培養(yǎng)法越來(lái)越多應(yīng)用于淋球菌感染的診斷。TMA是其中一種，其靈敏度高于淋球菌培養(yǎng)法，目前商業(yè)化的淋球菌核酸擴(kuò)增試劑盒己成為診斷淋球菌感染的重要補(bǔ)充。WHO、歐美國(guó)家疾控部門(mén)均推薦分子診斷法作為首選方法，美國(guó)和澳大利亞各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)檢測(cè)淋球菌的方法均以TMA為主，其具有擴(kuò)增效率高的特點(diǎn)，即1h內(nèi)可將目的基因擴(kuò)增百萬(wàn)倍以上）和特異度高[8-9]。近來(lái)研究表明TMA檢測(cè)淋球菌的靈敏度高于RT-PCR和bDNA[10]。SAT是在TMA基礎(chǔ)上，以RNA為起始模板，通過(guò)M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生1個(gè)雙鏈DNA拷貝，利用T7-RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)（100～1 000個(gè)）RNA拷貝，每個(gè)RNA拷貝再?gòu)姆崔D(zhuǎn)錄開(kāi)始進(jìn)入下一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)帶，有熒光標(biāo)記的探針與這些RNA拷貝特異性結(jié)合而產(chǎn)生熒光。該熒光信號(hào)可由熒光PCR儀實(shí)時(shí)捕獲，直觀反映擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生，避免了國(guó)外TMA擴(kuò)增后雜交顯色檢測(cè)的繁瑣[11]。FQ-PCR作為一種核酸檢測(cè)方法，其敏感度、特異度均較高[12]，但其檢測(cè)靶標(biāo)為淋球菌DNA，而DNA在環(huán)境中較為穩(wěn)定，需2～3周才能徹底分解，因此FQ-PCR不能夠區(qū)分病原體是死菌還是活菌，難以即時(shí)判斷淋球菌治療效果[13]。而NG-SAT只檢測(cè)病原菌體RNA，只有活菌才有完整的RNA片段，故能排除患者治療后病灶處殘留DNA對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響；RNA可在死亡的病原體中快速降解，有利于臨床用藥后的療效監(jiān)測(cè)，國(guó)內(nèi)已有將SAT應(yīng)用于結(jié)核分支桿菌的治療與預(yù)后判斷的研究[14]。此外，RNA在環(huán)境中極不穩(wěn)定、易降解，大大降低了交叉污染引起假陽(yáng)性的問(wèn)題，污染概率小。本研究NG-SAT檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性而淋球菌培養(yǎng)法陰性的7例患者，F(xiàn)QPCR復(fù)測(cè)結(jié)果顯示6例陽(yáng)性，進(jìn)一步證實(shí)NG-SAT檢測(cè)假陽(yáng)性率較低。

綜上所述，NG-SAT是實(shí)驗(yàn)室淋球菌診斷的一種新型檢測(cè)手段，其檢測(cè)尿液標(biāo)本淋球菌的靈敏度和特異度均較高，具有采樣方便、耗時(shí)短、污染小、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床檢測(cè)與療效監(jiān)測(cè)。

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Detection of urinary Neisseria Gonorrhoea infection with simultaneous amplification and testing technique

WANG Yanbin,LI Ruipeng,ZHONG Chunyan.Department of Urology,Hangzhou Third People's Hospital，Hangzhou 310009,China

Objective To evaluate the application of real-time simultaneous amplification and testing(SAT)technique in detection of urinary Neisseria Gonorrhoea(NG)infection. Methods Total 12 816 patients with suspected urogenital tract infection were tested in our hospital between February 2012 and November 2015,of whom 6 323 were tested by bacterial culture and 7 107 were tested by NG-SAT,and 614 were test by both methods.Swab and urine samples were collected for tests,the swab was tested by liquid culture,while urine samples by SAT.Samples with inconsistent results of two tests were retested by PCR. Results The positive rates of liquid culture and SAT were 35.9%and 37.7%,respectively.The specificity and sensitivity of SAT were 100.0%and 98.2%.In 7 patients with positive SAT and negative culture results,PCR showed 6 of them were positive. Conclusion Detection of NG with SAT technique has high sensitivity and specificity,which provides a new diagnostic method for urinary NG infection.

Neisseria gonorrhoea SAT Culture Urine

2016-04-14）

（本文編輯：陳丹）

杭州市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)專(zhuān)科專(zhuān)病項(xiàng)目（20150733Q30）；杭州市衛(wèi)生計(jì)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015A20）

310009 杭州市第三人民醫(yī)院泌尿外科（王彥彬、李瑞鵬、諸靖宇），檢驗(yàn)科（鐘春燕）；浙江省人民醫(yī)院泌尿外科（徐智慧）

諸靖宇，E-mail：zjyurology@163.com