基質(zhì)金屬蛋白酶-3基因多態(tài)性與無癥狀性頸動脈狹窄的相關(guān)性

黃小亞 韓麗雅 黃向東 管朝紅 茅新蕾 林彩丹

基質(zhì)金屬蛋白酶-3基因多態(tài)性與無癥狀性頸動脈狹窄的相關(guān)性

黃小亞 韓麗雅 黃向東 管朝紅 茅新蕾 林彩丹

目的 探討中國漢族人群基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）基因多態(tài)性與無癥狀性頸動脈狹窄的關(guān)系。方法 選擇2011年1月至2013年12月來院體檢的425例年齡≥60歲健康者為研究對象，經(jīng)頸動脈超聲檢測，其中頸動脈狹窄（≥50%）65例，無頸動脈狹窄360例；并采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切片段長度多態(tài)性方法，分析與比較兩組人群MMP-3基因啟動子區(qū)-1171位點的5A/6A多態(tài)性。結(jié)果 頸動脈狹窄與無狹窄人群基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）；兩組人群MMP-3 5A/6A基因型和5A等位基因分布比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。經(jīng)logistic回歸模型分析，校正多項血管危險因素后，5A/6A或5A/5A基因型是無癥狀性頸動脈狹窄的獨立危險因素（OR=1.98，95%CI：1.05～3.72）。結(jié)論 MMP-3基因啟動子區(qū)-1171位點的5A/6A多態(tài)性與無癥狀性頸動脈狹窄的發(fā)生可能相關(guān)。

基質(zhì)金屬蛋白酶-3 基因多態(tài)性 無癥狀性頸動脈狹窄

腦卒中是目前成人第一位致殘原因和第二位致死原因[1]。相關(guān)研究表明腦卒中發(fā)病率存在人種、區(qū)域差異，其中以中國為代表的東亞地區(qū)是腦卒中高發(fā)地區(qū)[2]。腦梗死是腦卒中最常見的類型，約占全部腦卒中的80%，具有發(fā)病率高、病死率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高等特點。近年來我國人群預(yù)期壽命延長，人口老齡化不斷加快，腦梗死發(fā)病率持續(xù)上升[3]。除了時間窗內(nèi)靜脈溶栓和動脈介入治療外[4-5]，目前仍缺乏有效的腦梗死早期診斷與防治方法。因此，早期篩選出腦梗死高危人群和易感個體，積極做好早期預(yù)防，對降低腦梗死發(fā)病率、致殘率和病死率具有重要意義。細胞外基質(zhì)（ECM）是組成血管壁的“骨架”，不僅保證了血管壁的彈性和對牽拉的抵抗性，還為血管壁細胞傳遞增殖、遷移、分化和凋亡等調(diào)控信號，調(diào)節(jié)血管壁細胞對生長因子和趨化因子的反應(yīng)能力。ECM的異常降解可引起血管中層平滑肌細胞侵襲和遷移至內(nèi)膜，與動脈粥樣硬化形成的病理過程密切相關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是鋅、鈣依賴的內(nèi)肽酶家族，對ECM成分有較高的親和力，幾乎可以降解所有ECM成分，參與機體多種病理、生理過程[6]?；|(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）是MMPs家族的重要成員，在調(diào)節(jié)ECM重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn)MMP-3基因啟動子區(qū)-1171位點的5A/6A多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死、頸動脈易損斑塊等密切相關(guān)[7-8]；而本研究旨在探討該位點多態(tài)性與中國漢族人群無癥狀性頸動脈狹窄間的關(guān)系，為早期篩選腦梗死高危人群提供理論依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 以2011年1月至2013年12月在本院體檢的425例健康者為研究對象，其中男245例，女180例，年齡60～87（70.06±5.53）歲；均為中國浙江地區(qū)的漢族人，彼此無血緣關(guān)系，均無心血管、腦血管及外周血管病史，排除感染、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、肝腎功能不全等疾病。頸動脈狹窄65例（15.29%），其中存在2處及以上斑塊29例，孤立性斑塊36例，共檢出斑塊106處，包括易損斑塊31處，混合斑塊23處，穩(wěn)定斑塊52處；左側(cè)斑塊69處，右側(cè)斑塊37處。無頸動脈狹窄360例，占84.71%。頸動脈狹窄人群高血壓、高脂血癥患病比例均明顯高于無頸動脈狹窄組（均P＜0.05），而年齡、性別、糖尿病患病比例、吸煙比例和BMI水平兩組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準，且所有研究人員簽署知情同意書。

表1 頸動脈狹窄與無頸動脈狹窄人群的一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 一般資料登記 一般資料包括年齡、性別、身高、體重、吸煙史以及高脂血癥、高血壓、糖尿病病史。高血壓的診斷標準：既往有高血壓病史，或目前正在使用降壓藥物控制血壓，或收縮壓和（或）舒張壓≥140/ 90mmHg，排除繼發(fā)性高血壓。高脂血癥的診斷標準：根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會1997年制定的《血脂異常防治建議》診斷標準。糖尿病的診斷標準：依據(jù)WHO制定的診斷標準[9]，同時排除1型糖尿病及繼發(fā)性糖尿病患者。吸煙的定義：每日吸煙≥1支且連續(xù)吸煙時間≥1年，包括既往吸煙和目前仍在吸煙者。

1.2.2 頸動脈超聲檢測 采用美國產(chǎn)GE Vivid 7型彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率為7.5MHZ，由超聲診斷科高年資醫(yī)師操作，分別檢測雙側(cè)頸總動脈、頸動脈分叉處、頸內(nèi)動脈和頸外動脈。受檢前休息5min，檢查時取仰臥位，頸后墊枕，頸部放松，頭偏向檢查對側(cè)，顯露檢查一側(cè)頸部，依次檢查雙側(cè)頸動脈。頸動脈狹窄依據(jù)2003年美國超聲放射學(xué)學(xué)會制定的頸內(nèi)動脈狹窄的超聲診斷標準[10]；參考既往研究，當(dāng)頸動脈狹窄50%～60%時，臨床卒中事件隨之增加[11]，故本文將頸動脈狹窄≥50%定義為頸動脈狹窄，若受檢者雙側(cè)頸內(nèi)動脈存在狹窄，則取較嚴重側(cè)的狹窄值作為其狹窄值。

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切片段長度多態(tài)性方法（1）主要試劑：血液基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）購自上海捷瑞生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶Psy I及緩沖液均購自New England Biolabs公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自上海生工公司，引物由上?；倒竞铣伞＃?）標本采集：采集入選對象空腹12h的靜脈血，用于生化指標測定及DNA抽提；其中用于基因組DNA抽提的血標本2ml，以EDTA-Na2抗凝，于-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩＃?）DNA的抽提：按照全血基因組DNA抽提試劑盒操作步驟進行DNA抽提。（4）參照Dunleavey等[12]的方法擴增MMP-3基因啟動子區(qū)-1171位點及其側(cè)翼區(qū)，上游引物A：5′-GGT TCTCCATTCCTTTGATGGGGGGAAAGA-3′；下游引物B：5′-CTTCCTGGAATTCAC ATCACTGCCACCACT-3′。PCR反應(yīng)體系：10×緩沖液2.5μl，dNTP（各10mmol/L）0.5μl，上下游引物0.5μl+0.5μl（各20μmol/L），DNA模板0.1μg，Taq DNA聚合酶2U，加雙蒸水至總體積25μl。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃2min，變性94℃45s，退火65℃1.5min，延伸72℃2min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，吸取擴增產(chǎn)物5μl，于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像分析PCR產(chǎn)物特異性。（5）酶切反應(yīng)：取經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物進行酶切，反應(yīng)體系包括PCR產(chǎn)物1μg，10×緩沖液2μl，限制性內(nèi)切酶 Psy I 2.5U，加雙蒸水至總體積20μl，置37℃水浴16h，終止酶切反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳后，EB染色，使用凝膠成像系統(tǒng)判定結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；頸動脈狹窄組與無頸動脈狹窄組均采用Hardy-Weinberg平衡評價基因分布特點；MMP-3 5A/6A基因型與頸動脈狹窄的風(fēng)險采用多元logistic回歸模型預(yù)測，校正因素包括：年齡、性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙史及BMI。

2 結(jié)果

2.1 頸動脈狹窄與無狹窄人群MMP-3 5A/6A基因型和等位基因的分布 頸動脈狹窄組中6A/6A基因型47例，5A/6A基因型18例，無5A/5A基因型；頸動脈無狹窄組中6A/6A基因型306例，5A/6A基因型52例，5A/ 5A基因型2例。因5A/5A基因型所占比例較小，故本文將5A/6A、5A/5A基因型合并統(tǒng)計。經(jīng)檢驗，頸動脈狹窄（χ2=1.68，P=0.20）與無狹窄（χ2=0.02，P=0.90）人群基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡。頸動脈狹窄與無狹窄人群MMP-3 5A/6A基因型和等位基因分布比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.09、4.96，均P＜0.05），見表2。

表2 頸動脈狹窄與無狹窄人群MMP-3 5A/6A基因型和等位基因的分布（例）

2.2 MMP-3 5A/6A基因型與頸動脈狹窄風(fēng)險的logistic回歸分析 在未校正其他因素的情況下，5A/6A或5A/5A基因型攜帶者發(fā)生頸動脈狹窄的風(fēng)險較6A/6A基因型攜帶者增加1.17倍（OR=2.17，95%CI：1.17～4.02）。校正年齡和性別后，5A/6A或5A/5A基因型攜帶者發(fā)生頸動脈狹窄的風(fēng)險較6A/6A基因型攜帶者增加1.18倍（OR=2.18，95%CI：1.18～4.05）。校正年齡、性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙史和BMI后，5A/6A或5A/5A基因型攜帶者發(fā)生頸動脈狹窄的風(fēng)險較6A/6A基因型攜帶者增加0.98倍（OR=1.98，95%CI：1.05～3.72），見表3。

表3 MMP-3 5A/6A基因型與頸動脈狹窄風(fēng)險的logistic回歸分析

3 討論

頸動脈粥樣硬化是導(dǎo)致腦梗死的一個重要原因[13]。既往研究發(fā)現(xiàn)中度（狹窄≥50%）無癥狀性頸動脈狹窄患者中，年齡≥70歲的男性占12.5%，而高齡女性占7%[14]。存在無癥狀性頸動脈狹窄的患者，發(fā)生同側(cè)頸動脈供血區(qū)的腦梗死、急性冠狀動脈事件和血管性死亡的危險性增高[15-16]。從血管內(nèi)皮細胞功能障礙到血管內(nèi)斑塊形成，再到臨床缺血事件的發(fā)生，慢性炎癥反應(yīng)均起到重要作用，在這一系列病理過程中，炎癥細胞所分泌的MMPs是其主要環(huán)節(jié)。

MMP-3是MMPs家族的主要成員，可由體內(nèi)多種細胞分泌，它既能降解膠原、蛋白聚糖、彈性蛋白、纖維連接蛋白等ECM成分，又可激活其他MMPs，形成一個正反饋環(huán)，共同調(diào)節(jié)細胞的增殖和遷移。人類MMP-3基因位于染色體11q22.3，含有10個外顯子和9個內(nèi)含子。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)MMP-3啟動子序列中1個常見的變異位于由轉(zhuǎn)錄起始上溯600 bp，在此部位1個等位基因有6個腺苷核苷（6A），而其他只有5個腺苷核苷（5A），且體外實驗顯示5A等位基因所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性是6A的2倍[17-18]。

MMP-3基因啟動子區(qū)-1171位點的5A/6A多態(tài)性在1995年首次被描述，即6A/6A基因型會加速冠狀動脈粥樣硬化的進程[19]。隨后一系列研究發(fā)現(xiàn)MMP-3 5A/6A多態(tài)性與動脈粥樣硬化性疾病關(guān)系密切。Hirashiki等[20]對經(jīng)冠狀動脈造影確診為冠狀動脈粥樣硬化的患者進行研究，發(fā)現(xiàn)6A/6A基因型與冠狀動脈嚴重狹窄支數(shù)密切相關(guān)。Beyzade等[21]亦得出相同結(jié)論，并發(fā)現(xiàn)至少有1支冠狀動脈狹窄率＞50%的人群中，5A/5A基因型攜帶者心肌梗死發(fā)病率明顯增高。A－billeira等[22]一項薈萃分析顯示5A等位基因與急性心肌梗死相關(guān)，提示5A等位基因在易損斑塊形成中具有一定作用。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)5A等位基因攜帶者發(fā)生頸動脈易損斑塊和動脈粥樣硬化性腦梗死的風(fēng)險均明顯升高[7-8]；而本研究結(jié)果顯示頸動脈狹窄人群5A/6A+5A/ 5A基因型頻率和5A等位基因頻率均明顯高于無頸動脈狹窄人群，具體機制有待于進一步探討。

綜上所述，MMP-3基因啟動子區(qū)-1171位點的5A/6A多態(tài)性與無癥狀性頸動脈狹窄的發(fā)生相關(guān)；5A等位基因可能是頸動脈狹窄的遺傳易感基因，具體作用機制有待進一步研究。

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Association between matrix metalloproteinase-3 5A/6A polymorphism and prevalence of asymptomatic carotid artery stenosis

HUANG Xiaoya,HAN Liya,HUANG Xiangdong,et al.Department of Neurology,Wenzhou Central Hospital&Dingli Clinical Institute of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the relationship between matrix metalloproteinase-3 (MMP-3)-1171 5A/6A polymorphism and the prevalence of asymptomatic carotid artery stenosis in Han Chinese population. Methods Total 425 healthy subjects aged≥60 years were enrolled in this study from January 2011 to December 2013.The genotypes of MMP-3 promoter polymorphism (-1171 5A/6A)were determined using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP). Results Among 425 subjects 65 showed evidence of asymptomatic carotid artery stenosis.The genotype distributionsof the asymptomatic carotid artery stenosisgroup and the non-stenosisgroup were both in Hardy-Weinberg equilibrium(P＞0.05).The frequencies of MMP-3 5A/6A+5A/5A genotype and 5A allele in the asymptomatic carotid artery stenosis group was significantly higher than those in non-stenosis group(P＜0.05).After adjustment for vascular risk factors,multivariate logistic regression analysis showed that the MMP-3 5A/6A+5A/5A genotype was an independent risk factor for asymptomatic carotid artery stenosis(OR=1.98,95%CI:1.05-3.72). Conclusion The MMP-3(-1171 5A/6A)polymorphism may contribute to susceptibility of asymptomatic carotid artery stenosis.

Matrix metalloproteinase-3 Polymorphism asymptomatic Asymptomatic carotid antery stenosis

2016-05-23）

（本文編輯：陳丹）

浙江省溫州市科技計劃項目（Y20140531）

325000 溫州市中心醫(yī)院（溫州醫(yī)科大學(xué)定理臨床學(xué)院）神經(jīng)內(nèi)科

黃小亞，E-mail：huangxiaoya389@163.com