1株番茄青枯病內(nèi)生拮抗細(xì)菌的分離鑒定及盆栽防效

伍善東，雷平，郭照輝，黃軍，程偉，付祖姣，單世平

(湖南省微生物研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410009)

1株番茄青枯病內(nèi)生拮抗細(xì)菌的分離鑒定及盆栽防效

伍善東，雷平，郭照輝，黃軍，程偉，付祖姣，單世平*

(湖南省微生物研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410009)

從番茄植株分離得到內(nèi)生細(xì)菌18株，其中2株對(duì)番茄青枯病病原菌(Ralstonia solanacearum)有較強(qiáng)的拮抗作用，菌株QGJ–6的拮抗圈直徑最大，為20.2 mm，盆栽試驗(yàn)中對(duì)番茄青枯病的生防效果達(dá)82.4%。逐步誘導(dǎo)拮抗內(nèi)生細(xì)菌QGJ–6對(duì)硫酸鏈霉素產(chǎn)生抗性，通過(guò)灌根接種的方法，驗(yàn)證了菌株QGJ–6能在番茄的根、莖、葉中定殖?；诰闝GJ–6的形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析結(jié)果，將其鑒定為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)。

番茄青枯病病原菌；內(nèi)生細(xì)菌；硫酸鏈霉素；生防效果；短短芽孢桿菌

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番茄青枯病是由茄科青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)侵染引起的細(xì)菌性病害[1]。青枯勞爾氏菌可侵染44個(gè)科450多種植物，造成15%～100%的產(chǎn)量損失[2]。青枯病的防治主要依賴化學(xué)藥劑，但長(zhǎng)期施用易導(dǎo)致菌株產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)也會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，增加農(nóng)產(chǎn)品有毒化學(xué)物質(zhì)的殘留量。王超等[3]研究發(fā)現(xiàn)，拮抗菌株R318、K18、R216對(duì)青枯病有較強(qiáng)的抑制作用；徐玲等[4]在番茄根際土壤篩選出的多粘類(lèi)芽孢桿菌HY96–2對(duì)青枯菌有較好的拮抗作用。根際拮抗微生物易受環(huán)境的影響，對(duì)植物病害的防效并不穩(wěn)定[5]。植物內(nèi)生細(xì)菌由于定殖于植物體內(nèi)，有穩(wěn)定的生存空間，不易受環(huán)境因素的影響[6]，有可能克服對(duì)植物病害防效不穩(wěn)定的缺陷。筆者從番茄植株組織中分離得到1株對(duì)番茄青枯病有較強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌QGJ–6，盆栽試驗(yàn)中該菌株對(duì)番茄青枯病的防效為82.4%，采用抗生素標(biāo)記的方法，分析了該菌株在番茄根、莖、葉中的定殖能力，結(jié)合該菌株的形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，將QGJ–6鑒定為短短芽孢桿菌。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

從湖南長(zhǎng)沙、邵陽(yáng)番茄青枯病發(fā)病田塊中，選取健壯植株的根、莖、葉，置于冰箱中保藏。

供試青枯病原菌(Ralstonia solanacarum)由湖南省微生物研究院提供。

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，酵母膏1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH7.0。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，氯化鈉 10 g，酵母粉 5 g，瓊脂18g，水1 000 mL，pH7.0。

1.2 方法

1.2.1 番茄內(nèi)生細(xì)菌的分離和篩選

番茄內(nèi)生細(xì)菌的分離參照文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行，挑取長(zhǎng)勢(shì)好的菌落，劃線純化，重復(fù)5次，保藏于4 ℃冰箱中。

番茄青枯病病原菌用NA培養(yǎng)基活化后，挑一環(huán)于5 mL無(wú)菌水中，菌液濃度為2.1×106CFU/mL，振蕩均勻，吸取0.1 mL加入到已凝固的5 mL NA培養(yǎng)基的平皿中，再倒入15 mL 45 ℃左右的NA培養(yǎng)基，混合均勻后，移入1個(gè)直徑為5 mm浸泡過(guò)待測(cè)細(xì)菌培養(yǎng)液的濾紙片, 每處理3個(gè)重復(fù)，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)2d，測(cè)定透明圈直徑大小。

1.2.2 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的鑒定

菌株劃線接種于LB培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)2d，記錄菌落形狀、顏色、大小、邊緣特征、是否透明、隆起程度等。進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。

菌株生理生化特征鑒定按照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。

依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取菌株QGJ–6的DNA后，采用細(xì)菌通用引物27F/1492R進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增[9]。PCR產(chǎn)物通過(guò)電泳進(jìn)行檢測(cè)，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，將所得序列通過(guò)Blast程序與GenBank中數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，選擇同源性高的序列使用MEGA5.1軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 抗300 μg/mL硫酸鏈霉素拮抗細(xì)菌突變株的篩選及其定殖能力測(cè)定

參照何紅等[10]的方法，將拮抗細(xì)菌株逐步誘導(dǎo)至300 μg/mL硫酸鏈霉素的抗性菌株，連續(xù)培養(yǎng)5代，以獲得穩(wěn)定抗性的菌株。

將5葉期的番茄苗移種于花盆中，將上述菌株接種于50 mL含有300 μg/mL硫酸鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基搖瓶中，30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵菌液稀釋10倍，量取100 mL灌根處理。5d后澆灌第2次，對(duì)照澆等量清水，常規(guī)管理，15d后取根、莖、葉進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離。

稱取5 g植株樣品，按文獻(xiàn)[7]方法處理后，取0.2 mL稀釋液涂于含有300 μg/mL硫酸鏈霉素的LB培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)2～3d，計(jì)算每克鮮質(zhì)量組織中的細(xì)菌數(shù)(CFU/g)[11]。

1.2.4 盆栽防效試驗(yàn)

番茄種子播于育苗盆中，待幼苗長(zhǎng)至20 cm高時(shí)，移栽至花盆中，每花盆種1株幼苗，每個(gè)處理20個(gè)重復(fù)，幼苗移栽成活后，使用該菌株的發(fā)酵液100 mL灌根處理，菌數(shù)約為6×107CFU/mL，每隔7d灌根處理1次，對(duì)照施等量清水，共3次。待第3次灌根處理3d后，利用傷根灌根法[12]接種青枯病原菌，接種病原菌25d后，按照Kempe(1983)提出的病級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[13]記錄病級(jí)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離與內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選結(jié)果

從番茄樣本中共分離得到內(nèi)生細(xì)菌18株，其中8株來(lái)自于根部，4株來(lái)自于莖部，6株來(lái)自于葉片。經(jīng)濾紙片法與青枯病原菌進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，僅有2株具有明顯的拮抗性，菌株QGJ–6的拮抗圈直徑為20.2 mm(圖1)，菌株QGJ–3的拮抗圈直徑為12.5 mm。

圖1 菌株QGJ–6的平皿抑菌效果Fig.1 The result of antibacterial experiment for strain QGJ–6

2.2 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的鑒定結(jié)果

選擇內(nèi)生拮抗細(xì)菌QGJ–6進(jìn)行鑒定。

菌株QGJ–6在LB培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)48 h，菌落為圓形，表面光滑、平整，白色或稍帶黃色，邊緣整齊。革蘭氏陽(yáng)性菌，在光學(xué)顯微鏡下觀察，菌體為桿狀，有芽孢。

菌株QGJ–6能利用葡萄糖、甘露醇發(fā)酵產(chǎn)酸，不能利用木糖發(fā)酵產(chǎn)酸，50 ℃的溫度不能生長(zhǎng)，5%氯化鈉不能生長(zhǎng)，能使明膠液化，不能水解淀粉，不產(chǎn)生硫化氫，V–P試驗(yàn)陰性，接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)陰性，氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性。

菌株QGJ–6的16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分析，長(zhǎng)度為1 505 bp, 將該序列提交至GenBank進(jìn)行比對(duì)，選擇相似性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鑒定菌株QGJ–6為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)。

圖2 依據(jù)菌株QGJ–6的16S rDNA序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 The phylogenetic tree for strain QGJ–6 based on 16S rDNA sequence

2.3 菌株QGJ–6突變株及其定殖能力

將菌株QGJ–6逐步誘導(dǎo)至抗300 μg/mL硫酸鏈霉素，其發(fā)酵液對(duì)番茄進(jìn)行灌根處理后，在含300 μg/mL硫酸鏈霉素的LB培養(yǎng)基中能分離到形態(tài)特征與原菌株一致的細(xì)菌，根中菌株的含量為8.3×104CFU/g，莖中菌株的含量為3.2×104CFU /g，葉片中菌株的含量為1.5×104CFU /g，清水對(duì)照中沒(méi)有分離到形態(tài)特征與原菌株一致的細(xì)菌，表明菌株QGJ–6能在番茄植株體內(nèi)定殖。

2.4 菌株QGJ–6發(fā)酵液的盆栽防效

用拮抗內(nèi)生細(xì)菌QGJ–6發(fā)酵菌液處理番茄苗3次，采用傷根灌根法接種青枯病原菌，25d后，番茄苗的發(fā)病率、病情指數(shù)均低于對(duì)照，盆栽防效達(dá)82.4%(表1)。

表1 拮抗內(nèi)生細(xì)菌QGJ–6對(duì)番茄青枯病的防效Table 1 The biocontrol efficacy of strain QGJ–6 against Ralstonia solanacearum

3 討論

用于防治青枯病的細(xì)菌有無(wú)致病力青枯菌、假單胞菌、芽孢桿菌等[14]。生防細(xì)菌的作用機(jī)理包括抗菌物質(zhì)產(chǎn)生、誘導(dǎo)抗病性、種群競(jìng)爭(zhēng)等[15]。利用內(nèi)生細(xì)菌防治作物病害越來(lái)越受到重視，內(nèi)生細(xì)菌對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育、抵抗不良外界環(huán)境、抵御病蟲(chóng)害等有廣泛的生物學(xué)作用[16]。

本試驗(yàn)從番茄青枯病發(fā)病田塊的健壯植株組織中分離得到18株內(nèi)生細(xì)菌，進(jìn)一步篩選得到2株對(duì)番茄青枯病有拮抗作用的細(xì)菌，其中菌株QGJ–6的拮抗圈直徑最大，為20.2 mm，在盆栽防效試驗(yàn)中，對(duì)番茄青枯病的防治效果為82.4%，根據(jù)拮抗內(nèi)生細(xì)菌QGJ–6的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鑒定其為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)。

采用硫酸鏈霉素標(biāo)記的方法證明QGJ–6能在番茄的根、莖、葉中定殖，表明其為內(nèi)生細(xì)菌，但定殖能力隨植株的器官不同而異，其在根部的定殖能力明顯強(qiáng)于莖、葉，可能與根部是內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)入植株體內(nèi)的入口有關(guān)[17]，這與龍良鯤等[18]研究?jī)?nèi)生細(xì)菌01–144在番茄根莖內(nèi)定殖的結(jié)果相似。后續(xù)將對(duì)拮抗內(nèi)生細(xì)菌QGJ–6的抗菌活性成分作進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅 維

Isolation, identification and potted control efficacy of an endophytic bacerial against Ralstonia solanacearum

Wu Shandong, Lei Ping, Guo Zhaohui, Huang Jun, Cheng Wei, Fu Zujiao, Shan Shiping*
(Hunan Institute of Microbiology, Changsha 410009, China)

Eighteen strains of endophytic bacteria were isolated from tomato plants, and 2 of them had stronger antagonistic effect on tomato bacterial wilt pathogens (Ralstonia solanacearum). Among them, strain QGJ–6 has maximal inhibition zone diameter (20.2 mm) and the potted biocontrol efficacy was 82.4%. The resistance of strain QGJ–6 to streptomycin sulfate was gradually induced. Andstrain QGJ–6 with the streptomycin sulfate label can colonize in the root, stem and leaf of tomato using the method of filling-root injection. The endophytic bacteria strain QGJ–6 was identified as Brevibacillus brevis based on the morphological characteristics, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis.

Ralstonia solanacearum; endophytic bacteria; streptomycin sulfate; biocontrol efficacy; Brevibacillus brevis

S435.112

A

1007-1032(2016)06-0627-04

2016–08–24

2016–10–18

湖南省科學(xué)技術(shù)廳項(xiàng)目(2015NK3056)；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(13JJ2035)

伍善東(1978—)，男, 湖南綏寧人, 工程師, 主要從事植物保護(hù)與微生物肥料研究，1059995305@qq.com；*通信作者，單世平，博士，副研究員，主要從事農(nóng)田土壤重金屬污染防控、土壤肥料發(fā)酵工藝研究，ssp312@hotmail.com