液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定葡萄中鏈霉素和雙氫鏈霉素

劉真真, 齊沛沛, 何付香, 汪志威, 狄珊珊, 徐 浩, 趙慧宇, 王 強(qiáng), 王新全

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室, 浙江 杭州 310021)

鏈霉素(streptomycin, STR)屬于氨基糖苷類抗生素;雙氫鏈霉素(dihydrostreptomycin, DSTR)是鏈霉素中鏈霉糖部分的醛基氫化后所獲得的另一種鏈霉素衍生物,與鏈霉素功效相似[1]。鏈霉素和雙氫鏈霉素作為飼料添加劑和抗菌劑在農(nóng)業(yè)、牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)上得到廣泛應(yīng)用[2]。然而,自1985年日本學(xué)者小笠原發(fā)現(xiàn)鏈霉素可以誘導(dǎo)葡萄無核結(jié)實以來,鏈霉素在巨峰、玫瑰金等葡萄生產(chǎn)中得以廣泛使用[3]。鏈霉素和雙氫鏈霉素存在一定的耳毒性、腎毒性、致畸和致癌作用,其可通過食物鏈進(jìn)入人體,危害人類健康[4]。無核葡萄食用時無須吐籽,深受消費(fèi)者喜愛。但葡萄中鏈霉素或雙氫鏈霉素殘留過量,會對人體造成嚴(yán)重危害。因此,鏈霉素和雙氫鏈霉素在葡萄中的殘留量及其安全性引起了消費(fèi)者的擔(dān)憂。

鏈霉素和雙氫鏈霉素作為重要的抗生素類藥物，國內(nèi)外已開展了其在動物源性產(chǎn)品中殘留的檢測技術(shù)研究。常用的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[5]、分光光度法[6]、液相色譜法[7,8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[9-21]等。其中,LC-MS/MS抗背景干擾能力強(qiáng),具有高靈敏度、高選擇性和高通量分析的優(yōu)勢,被廣泛應(yīng)用于牛奶、蜂蜜、肌肉等食品中鏈霉素和雙氫鏈霉素的殘留分析。然而,關(guān)于葡萄等植物源性樣品中鏈霉素和雙氫鏈霉素的分析研究卻鮮有報道。因此,為保證葡萄質(zhì)量安全,本研究擬采用LC-MS/MS建立快速、簡便、靈敏度高的定量分析鏈霉素和雙氫鏈霉素殘留的方法。目前,LC-MS/MS分析鏈霉素和雙氫鏈霉素殘留量主要存在兩個問題:一是在色譜分析的流動相中添加離子對試劑,增加其保留和響應(yīng)值,但在測定過程中離子對試劑難霧化,致使儀器靈敏度下降[11-13,16,21];二是前處理過程復(fù)雜,大多需經(jīng)兩次固相萃取小柱萃取凈化,耗時長,試劑消耗量大[1,22]。本研究選取在前處理過程中添加1-己烷磺酸鈉離子對試劑,采用Oasis HLB單柱即可達(dá)到理想富集效果,經(jīng)后續(xù)處理去除離子對試劑,避免在分析過程將其帶入質(zhì)譜而導(dǎo)致儀器靈敏度下降;同時通過優(yōu)化色譜條件,選取Waters HSS T3色譜柱增強(qiáng)其色譜響應(yīng)值,從而提高鏈霉素和雙氫鏈霉素分析的檢測靈敏度。

本研究以巨峰葡萄為代表,建立了葡萄中鏈霉素和雙氫鏈霉素的樣品前處理和定量分析方法。研究了色譜柱及流動相組成對鏈霉素和雙氫鏈霉素分離和響應(yīng)值的影響,同時對影響鏈霉素和雙氫鏈霉素殘留分析準(zhǔn)確度及精確度的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化研究,以期為葡萄中鏈霉素和雙氫鏈霉素污染水平研究及最大殘留限量制定提供方法依據(jù)。

表 1 鏈霉素和雙氫鏈霉素的質(zhì)譜參數(shù)

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Nexera X2 LC-30AD超高效液相色譜儀、8050三重四極桿質(zhì)譜儀、Labsolution軟件(用于儀器控制、數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析)(日本Shimadzu公司);色譜柱為Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm,美國Waters公司); Filter Unit濾膜(0.22 μm,天津Agela Technologies公司); Biofuge Primo R高速離心機(jī)(德國Thermo公司);超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

鏈霉素和雙氫鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr. Ehrenstorfer公司);商品化Oasis HLB固相萃取柱(500 mg/6 mL,美國Waters公司);甲醇(色譜純,美國Merck公司);甲酸、磷酸(色譜純,美國Tedia公司);磷酸氫二鈉(分析純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);實驗用水為超純水(Milli-Q超純水系統(tǒng)制備,美國Millipore公司); 1-己烷磺酸鈉(分析純,上海Macklin公司)。

巨峰葡萄、新郁葡萄、紅提葡萄、夏黑葡萄等購于浙江省杭州市超市。將葡萄樣品去除果蒂,高速勻漿混勻,然后放入冰箱中冷凍保藏(-18 ℃),待用。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品前處理

提取:稱取葡萄樣品5.00 g(±0.05 g),置于50 mL離心管中,準(zhǔn)確加入10 mL磷酸溶液(pH=2),超聲萃取15 min,渦旋1 min,以7 000 r/min離心3 min,取全部上清液(約12 mL);隨后向上清液中加入2 mL 1-己烷磺酸鈉(0.5 mol/L),混勻,靜置10 min,待凈化。

凈化:將上述待凈化液加入預(yù)先經(jīng)5 mL甲醇、5 mL水活化平衡的Oasis HLB固相萃取柱內(nèi),待樣液全部流盡后,依次用5 mL磷酸溶液(pH=2)、10 mL水淋洗;負(fù)壓抽干后,用6 mL 10%甲酸甲醇溶液洗脫,收集全部洗脫液,氮吹至干,用1 mL甲醇復(fù)溶,渦旋混勻后,過0. 22 μm濾膜,供LC-MS/MS分析。

1.2.2分析條件

色譜柱為Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)；柱溫為35 ℃；流動相為水-甲醇(60∶40, v/v),其中水相中含有0.1%甲酸；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL。

電噴霧電離源,正離子模式;多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM);加熱溫度400 ℃;噴霧電壓+3 500 V。鏈霉素和雙氫鏈霉素化合物分別由兩對母離子和子離子對共同確定,鏈霉素和雙氫鏈霉素前體離子、產(chǎn)物離子及相應(yīng)的碰撞能和偏差見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇

本研究考察了3種色譜柱Waters BEH C18 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)和Phenomenon LC-HILIC(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)對鏈霉素和雙氫鏈霉素保留和響應(yīng)的影響。當(dāng)流動相為水-甲醇(50∶50, v/v),且水相中含有0.1%的甲酸時，采用上述色譜柱分別對0.25 mg/L(甲醇配制)的鏈霉素和雙氫鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析測定,色譜圖見附圖1(詳見http://www.chrom-China.com)?？梢钥闯?鏈霉素和雙氫鏈霉素在HILIC柱上的保留時間有所增加,色譜峰形較差,為準(zhǔn)確定量帶來困難。鏈霉素和雙氫鏈霉素在C18、T3色譜柱上的保留時間相當(dāng),但在T3色譜柱上的響應(yīng)明顯高于C18色譜柱。因此,選取T3色譜柱用于鏈霉素和雙氫鏈霉素的分析測定。

2.1.2流動相的選擇

本研究以水和甲醇為流動相,其中水相中加入能與其互溶的揮發(fā)性緩沖溶液甲酸來改善化合物的保留和色譜峰形[23]。實驗分別考察甲酸體積分?jǐn)?shù)(0、0.1%和0.5%)和水-甲醇的比例(20∶80～80∶20, v/v)對色譜峰形和靈敏度的影響(見附圖2和附圖3)。

當(dāng)流動相為水-甲醇(50∶50, v/v)時,水相中加入甲酸增加了鏈霉素和雙氫鏈霉素在T3色譜柱上的保留和響應(yīng)值;然而,甲酸的添加量對目標(biāo)物在色譜柱上的保留時間影響不顯著,卻會造成化合物響應(yīng)值的變化,當(dāng)甲酸用量為0.5%時,目標(biāo)物在色譜柱上的響應(yīng)值顯著降低。因此,在水相中加入0.1%甲酸作為修飾劑。

在水相中加入0.1%甲酸后,進(jìn)一步調(diào)整流動相中水和甲醇的比例,以考察最佳的流動相條件。當(dāng)流動相中水與甲醇的體積比由20∶80升至60∶40時,鏈霉素和雙氫鏈霉素在T3色譜柱上的保留時間相當(dāng),在色譜柱上的響應(yīng)值呈上升趨勢;而水與甲醇的體積比由60∶40升至80∶20時,目標(biāo)物在色譜柱上的響應(yīng)值明顯降低,這可能是因為有機(jī)溶劑的比例降低,導(dǎo)致離子化效率的降低,從而使化合物響應(yīng)值降低。因此,最終確定最佳的流動相為水-甲醇(60∶40, v/v),其中水相中含有0.1%甲酸。

2.1.3提取液的選擇

在鏈霉素和雙氫鏈霉素的分析測定中,樣品通常以磷酸[22,24]和磷酸鹽緩沖溶液[25]作為提取液。本研究考察了水、磷酸(pH=2)、磷酸氫二鈉(pH=7)3種提取溶液對葡萄樣品中鏈霉素和雙氫鏈霉素的提取效率。實驗過程參照1.2.1節(jié),3種提取溶液對鏈霉素和雙氫鏈霉素提取回收率見圖1。結(jié)果可知,磷酸(pH=2)對葡萄中鏈霉素和雙氫鏈霉素的提取效果最佳,鏈霉素和雙氫鏈霉素的提取回收率分別為81.0%和78.4%。因此,本研究選取磷酸(pH=2)作為提取溶液,在超聲波輔助下對葡萄樣品中的鏈霉素和雙氫鏈霉素進(jìn)行提取。

圖 1 不同提取溶劑對鏈霉素和雙氫鏈霉素回收率的影響(n=3)Fig. 1 Effects of the different extraction solvents on the recoveries of the STR and DSTR (n=3) PA: phosphoric acid; DHP: disodium hydrogen phosphate.

2.1.4離子對試劑用量的選擇

圖 2 1-己烷磺酸鈉用量對鏈霉素和雙氫鏈霉素回收率的影響(n=3)Fig. 2 Effects of dosages of sodium hexane-1-sulfonate on the recoveries of STR and DSTR (n=3)

鏈霉素、雙氫鏈霉素中含有糖苷鍵,極性較大,在固相萃取柱上的保留不理想。因此,樣品經(jīng)固相萃取柱凈化和富集前,需向提取液中添加離子化試劑以增加其保留[1]。本研究以0.5 mol/L 1-己烷磺酸鈉為離子試劑,與目標(biāo)物形成離子對,從而增加Oasis HLB固相萃取柱對鏈霉素和雙氫鏈霉素的吸附能力,提高回收率。葡萄樣品經(jīng)磷酸(pH=2)超聲提取、渦旋、離心后,取上清液，然后向其加入不同體積(0、1、2、3和4 mL)的0.5 mol/L 1-己烷磺酸鈉。由圖2可以看出,樣液在不加1-己烷磺酸鈉時,Oasis HLB固相萃取柱對鏈霉素和雙氫鏈霉素的吸附作用較弱,1-己烷磺酸鈉的加入增加了鏈霉素和雙氫鏈霉素在固相萃取柱上的保留。且在一定用量范圍內(nèi)，隨著1-己烷磺酸鈉的加入其回收率也隨之增高,當(dāng)其加入量為2.0 mL時,鏈霉素和雙氫鏈霉素的回收率最佳。因此,本研究選擇在提取液中加入2.0 mL 0.5 mol/L 1-己烷磺酸鈉溶液來增加目標(biāo)物在固相萃取柱上的保留。

2.1.5洗脫溶劑的優(yōu)化

洗脫溶劑在固相萃取及凈化過程中起重要作用，因此選擇合適的洗脫溶劑至關(guān)重要。在極性化合物分析過程中,甲醇、乙腈(ACN)等為常用的固相萃取洗脫溶劑。因此,本方法探究了不同洗脫溶劑對鏈霉素和雙氫鏈霉素的脫附效果,并對洗脫液的體積進(jìn)行了優(yōu)化。不同洗脫溶劑(甲醇、1%甲酸甲醇、5%甲酸甲醇、10%甲酸甲醇、乙腈、1%甲酸乙腈、5%甲酸乙腈、10%甲酸乙腈)對鏈霉素和雙氫鏈霉素的洗脫效果見圖3a?？梢钥闯?甲醇的洗脫能力優(yōu)于乙腈,甲酸的加入進(jìn)一步提高了洗脫能力;當(dāng)用10%甲酸甲醇進(jìn)行洗脫時,鏈霉素和雙氫鏈霉素的洗脫效果最佳。因此,選擇10%甲酸甲醇作為洗脫溶劑進(jìn)行下一步實驗。

圖 3 (a)洗脫溶劑及其(b)體積對鏈霉素和雙氫鏈霉素回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effects of (a) elution solvents and (b) their volumes on the recoveries of STR and DSTR (n=3) ME: methanol; FA: formic acid; ACN: acetonitrile.

此外,洗脫溶劑的體積同樣是固相萃取中影響結(jié)果的關(guān)鍵性因素。本研究進(jìn)一步探究不同體積(2、3、4、5和6 mL)的10%甲酸甲醇溶液對目標(biāo)分析物回收率的影響(見圖3b)。當(dāng)10%甲酸甲醇溶液的洗脫體積為6 mL時,鏈霉素和雙氫鏈霉素的回收率最佳,分別為96.6%和75.4%。因此,選擇6 mL 10%甲酸甲醇溶液作為洗脫溶劑。

2.2 方法驗證

2.2.1線性關(guān)系和檢出限

配制鏈霉素和雙氫鏈霉素的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,其質(zhì)量濃度分別為2、5、10、25、50、100、250、400 μg/L。經(jīng)LC-MS/MS分析后,以鏈霉素和雙氫鏈霉素色譜峰面積(y)對其質(zhì)量濃度(x, μg/L)進(jìn)行線性擬合,得出回歸方程及相關(guān)系數(shù)(R2)。結(jié)果顯示,鏈霉素和雙氫鏈霉素在2～400 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,線性方程分別為y=122.7x+522.0和y=568.5x+3 219;線性相關(guān)系數(shù)分別為0.999 1和0.999 7。檢出限(LOD)為3倍信噪比所對應(yīng)的化合物質(zhì)量濃度,鏈霉素和雙氫鏈霉素的LOD值為1 μg/L。根據(jù)歐盟文件SANTE/11813/2017規(guī)定,定量限(LOQ)為添加回收試驗中回收率滿足實驗工作需求的最低添加濃度水平。本實驗的最低添加水平為5 μg/kg時,鏈霉素和雙氫鏈霉素的回收率分別為91.9%和76.8%(見表2),故本方法中鏈霉素和雙氫鏈霉素的LOQ為5 μg/kg。

表 2 葡萄中鏈霉素和雙氫鏈霉素在不同添加水平下的回收率(n=3)

2.2.2回收率及精密度

使用空白葡萄基質(zhì)進(jìn)行添加回收率試驗,添加水平分別為5、10、20和40 μg/kg(每個添加水平平行測定3次),按照本方法進(jìn)行試驗,結(jié)果見表2。鏈霉素和雙氫鏈霉素在不同添加水平下平均回收率為76.8%～91.9%, RSDs為0.4%～10.2%。方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合分析要求。

2.2.3實際樣品分析

為驗證該方法的適用性,本研究選取空白無籽紅提、新郁葡萄、夏黑葡萄等樣品進(jìn)行添加回收試驗。添加水平為20 μg/kg(每個添加水平平行測定3次)。鏈霉素和雙氫鏈霉素在20 μg/kg添加水平下的平均回收率分別為77.2%～83.9%和70.8%～78.9%, RSD為3.0%～15.6%。本方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合葡萄中鏈霉素和雙氫鏈霉素的分析要求。

3 結(jié)論

本研究建立了葡萄中鏈霉素和雙氫鏈霉素的定量分析方法。本方法準(zhǔn)確度和精密度高,適用于葡萄中鏈霉素和雙氫鏈霉素含量的定量分析,并可為葡萄中鏈霉素和雙氫鏈霉素污染水平研究及最大殘留限量制定提供方法依據(jù)。