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    葡萄胎診斷進(jìn)展與STR基因分型的應(yīng)用

    2016-12-16 19:37:51劉巖劉從容
    婦產(chǎn)與遺傳(電子版) 2016年4期
    關(guān)鍵詞:葡萄胎三倍體完全性

    劉巖 劉從容

    葡萄胎 (hydatidiform mole)是婦科病理中常見(jiàn)的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病 (gestational trophoblastic disease)。盡管組織學(xué)對(duì)充分發(fā)育的完全性葡萄胎的診斷基本可靠,但早期完全性葡萄胎常常被臨床和病理醫(yī)生誤診為流產(chǎn)性絨毛水腫或正常妊娠。臨床實(shí)踐中,部分性葡萄胎的診斷存在更多問(wèn)題,低診斷和過(guò)診斷的現(xiàn)象同時(shí)并存[1]。葡萄胎具有發(fā)展為持續(xù)性滋養(yǎng)細(xì)胞疾病 (侵襲性葡萄胎和絨癌等)的危險(xiǎn)性,且完全性葡萄胎的進(jìn)展率 (15%~20%)比部分性葡萄胎 (<4%)更高,因此鑒別葡萄胎和非葡萄胎水腫性流產(chǎn)、進(jìn)一步區(qū)分完全性和部分性葡萄胎具有重要的臨床意義[2-3]。此外,葡萄胎的過(guò)度診斷會(huì)給患者帶來(lái)不必要的精神和醫(yī)療上的負(fù)擔(dān)和后果,導(dǎo)致有迫切生育需求的高齡孕婦不得不面臨隨著年齡的增長(zhǎng)而受孕概率降低的局面。眾所周知,形態(tài)學(xué)鑒別早期葡萄胎缺乏準(zhǔn)確性,使用更加準(zhǔn)確的葡萄胎診斷方法是進(jìn)行臨床診斷、流行病學(xué)以及生物學(xué)研究的保證。DNA倍體分析和P57免疫組化染色可以提供一定程度的輔助作用[4-5],但在醫(yī)學(xué)實(shí)踐中會(huì)遇到不少的困難和陷阱。因此,臨床迫切需要提高葡萄胎診斷手段的敏感性和特異性。葡萄胎的發(fā)病機(jī)理有其獨(dú)特的遺傳學(xué)背景,遺傳學(xué)分型被認(rèn)為是最終診斷葡萄胎的“金標(biāo)準(zhǔn)”。近數(shù)年來(lái)STR的多態(tài)性分析被證實(shí)為最為準(zhǔn)確且實(shí)用的葡萄胎診斷和分型手段[6-7]。

    一、葡萄胎的病因及發(fā)病機(jī)制

    1.歷史回顧

    葡萄胎是最早被人類(lèi)描述并認(rèn)知的疾病之一,最初的文字記載可追溯至2500年前,古希臘的希波克拉底將葡萄胎描述為“因飲用不潔水導(dǎo)致的子宮水腫”。約1500年前,來(lái)自美索不達(dá)米亞的醫(yī)生Aetius of Amida將這種伴有乳房脹痛和閉經(jīng)的疾病命名為“mola hydatidosa”,分別起源于拉丁語(yǔ)“mole”和希臘語(yǔ)“hydatisia”,意為“充滿(mǎn)水的囊泡”,這也成為目前使用的“水泡狀胎塊” (hydatidiform mole)一詞的由來(lái)。公元十七世紀(jì),Samuel Degys對(duì)荷蘭女伯爵Margaret of Henneberg傳說(shuō)的思考展示了當(dāng)時(shí)人們對(duì)葡萄胎的進(jìn)一步了解[8],女伯爵因羞辱了一個(gè)懷有雙胞胎的窮苦女乞丐而受到上帝的懲罰,她誣陷這對(duì)雙胞胎是女乞丐與兩個(gè)不同的男人所生,因此女伯爵在耶穌受難日產(chǎn)下了365個(gè)“孩子”(其實(shí)為不計(jì)其數(shù)的囊狀水泡)之后隨即死去,而她的孩子中一半為男性,一半為女性。以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度可以判斷,這位女伯爵是一位典型的完全性葡萄胎患者,上帝對(duì)她的“懲罰”其實(shí)是無(wú)核卵子與兩個(gè)不同的精子受精而導(dǎo)致的滋養(yǎng)細(xì)胞疾病。盡管這個(gè)傳說(shuō)源于700多年以前,反映出當(dāng)時(shí)人類(lèi)對(duì)葡萄胎的認(rèn)識(shí)還處于蒙昧階段,但是它的情節(jié)完全契合了目前公認(rèn)的葡萄胎發(fā)生的遺傳學(xué)機(jī)制。

    隨著近代醫(yī)學(xué)的發(fā)展和顯微鏡的使用,人們逐漸認(rèn)識(shí)到葡萄胎中所見(jiàn)到的所謂“葡萄”,事實(shí)上是因水腫而膨脹的絨毛膜絨毛,葡萄胎的組織學(xué)基礎(chǔ)是合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的增生。直至上世紀(jì)七十年代,細(xì)胞遺傳學(xué)首次證實(shí)了完全性葡萄胎具有雄源性本質(zhì)[9],即完全性葡萄胎只含有父源性基因組,而不含有母源性基因。隨后分子遺傳學(xué)徹底揭示了葡萄胎的病因和發(fā)病機(jī)制,即親代基因組在胎盤(pán)的發(fā)育過(guò)程中扮演不同的角色,基因組印跡異常是導(dǎo)致妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病,尤其是葡萄胎和絨毛膜癌發(fā)生的重要基礎(chǔ)[10-11]。

    2.胎盤(pán)部位的“父母利益沖突”

    親代基因組,即父源性基因組和母源性基因組,在胎兒和胎盤(pán)的發(fā)育過(guò)程中扮演不同的角色。在進(jìn)化過(guò)程中,父源性基因組力圖操縱母體,使其子代獲得更多的資源和絕對(duì)的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì),與之相反,母源性基因組則力求對(duì)子代的基因資源分配保持平衡,為她所有的孩子提供等量的營(yíng)養(yǎng),并且阻止子代中的父源性基因?qū)δ阁w的絕對(duì)操控和傷害[12]。研究結(jié)果表明,母源性基因組對(duì)于胚胎的發(fā)育是重要的,而父源性基因組對(duì)于胚胎外組織,即胎盤(pán)的發(fā)育是必需的,只有在父母的基因型以正確形式互相平衡時(shí),才會(huì)有胎兒的正常發(fā)育。哺乳動(dòng)物的發(fā)育需要父母兩方的基因組進(jìn)行精細(xì)協(xié)調(diào)才能達(dá)成,走錯(cuò)一步,一切都前功盡棄。正如一場(chǎng)拔河比賽 (tug-ofwar),如果一方丟掉繩子,雙方就都會(huì)栽倒。這一觀點(diǎn)促進(jìn)了基因組印跡 (genomic imprinting)理論的創(chuàng)立,該理論解釋了為何某些特定基因會(huì)根據(jù)來(lái)自于你的父親還是母親而獲得不同的表達(dá)。在此理論的助力之下,我們便能看清父母之間那些基因利益的爭(zhēng)斗是怎樣在其后代的基因組中進(jìn)行到底的?!案改咐鏇_突”假說(shuō)認(rèn)為,在胎盤(pán)部位,父源性印跡基因組促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和侵襲,而母源性印跡基因相對(duì)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)[13]。因此若干父源性基因在正常胎盤(pán)中受基因印跡而歸于沉默,而母源性等位基因得以表達(dá),兩者形成平衡,既不妨礙胎兒的正常發(fā)育又保證了母體的生命安全。在妊娠期,一個(gè)正常的、平衡的基因組印跡過(guò)程被破壞,母源性等位基因的缺乏或父源性印跡基因的表達(dá)相對(duì)過(guò)剩,可能引發(fā)異常的滋養(yǎng)細(xì)胞增生和侵襲,進(jìn)而導(dǎo)致葡萄胎等妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的發(fā)生

    3.葡萄胎的發(fā)病機(jī)制和遺傳學(xué)基礎(chǔ)

    在遺傳學(xué)水平,葡萄胎妊娠具有異常的父源染色體成分,存在過(guò)剩的父源性基因組是完全性和部分性葡萄胎發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵遺傳因素。

    與正常的單卵、單精子二倍體 (46,XX或XY)妊娠不同,幾乎所有的完全性葡萄胎(complete hydatidiform mole)是僅含父源染色體的雙精子二倍體[1,14]:它們多數(shù)是一個(gè)空卵與一個(gè)精子受精后再?gòu)?fù)制的46,XX二倍體核型 (單精純合子,占80%),或者是一個(gè)空卵與一個(gè)減數(shù)分裂失敗的精子或兩個(gè)不同的精子同時(shí)受精的46,XX或46,XY二倍體核型 (雙精雜合子,占20%)。值得注意的是,雙精雜合子比雙精純合子的完全性葡萄胎更容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,進(jìn)展為持續(xù)性滋養(yǎng)細(xì)胞疾病。卵子丟失母源性單倍體基因組的原因尚未完全清晰,可能因?yàn)槁炎硬怀墒旎蚶匣荒鼙S凶陨淼暮宋镔|(zhì),或者在受精過(guò)程中母源性核被當(dāng)做極體而排出細(xì)胞外,這種假設(shè)與葡萄胎的年齡危險(xiǎn)因素(<20歲或>40歲)不謀而合。還有一類(lèi)極為特殊的雙親源性完全性葡萄胎,具有正常比例的雙親基因組,但由于基因印跡調(diào)控相關(guān)的特定基因 (NALP7或KHDC3L基因)發(fā)生了遺傳性突變,導(dǎo)致母源性基因被異常滅活而發(fā)生完全性葡萄胎。在這種家系中,超過(guò)一個(gè)以上的女性 (母女或姐妹)在多次妊娠中反復(fù)發(fā)生完全性葡萄胎,目前見(jiàn)于文獻(xiàn)報(bào)道的僅有 30 余個(gè)家系[15]。

    部分性葡萄胎 (partial hydatidiform mole)的遺傳學(xué)本質(zhì)是具有雙雄單雌性基因組的三倍體,它們來(lái)自一個(gè)具有單倍體核的卵子同時(shí)與兩個(gè)精子受精(雙精雜合子,占90%),或是由一個(gè)具有單倍體核的卵子與一個(gè)精子受精,隨后由于減數(shù)分裂失敗而發(fā)生父源性染色體倍增 (單精純合子,占10%),由此產(chǎn)生二倍父源和單倍母源 (69,XXX或69,XXY核型)的三倍體妊娠[1,14]。值得注意的是,并非所有的三倍體妊娠都表現(xiàn)為部分性葡萄胎。三倍體核型是最常見(jiàn)的人類(lèi)染色體異常,三分之二為雙倍的父源性雄性基因組并且與部分性葡萄胎表型相關(guān),其余則是由于減數(shù)分裂過(guò)程中母體染色體未分離而形成的雙雌單雄性基因組,并非葡萄胎妊娠,這種非葡萄胎型三倍體,額外擁有一組來(lái)自于母體的染色體基因組,因此并不會(huì)表現(xiàn)出雙雄單雌性部分性葡萄胎的生物學(xué)和臨床特征。有趣的是,在那些能夠形成完整胎兒并出現(xiàn)胎死宮內(nèi)的病例中,雙雌性三倍體的比例更高。但由于妊娠早期流產(chǎn)的絨毛發(fā)育尚不充分,組織學(xué)形態(tài)特征不明顯,只依據(jù)常規(guī)的病理檢查而不使用其他輔助檢測(cè)方法,大量病例可能會(huì)被漏診。因此,明確一個(gè)三倍體妊娠中父源性染色體的倍數(shù)對(duì)診斷部分性葡萄胎十分重要。

    二、葡萄胎診斷中輔助技術(shù)的應(yīng)用

    為了提高葡萄胎診斷的準(zhǔn)確性,人們探索了多種針對(duì)葡萄胎遺傳學(xué)變化的分子檢測(cè)手段。其中包括傳統(tǒng)的流式DNA倍體分析、常用的P57免疫組化染色和新興的基因多態(tài)性分析 (STR基因分型)。

    1.流式DNA倍體分析

    流式DNA倍體分析曾經(jīng)是葡萄胎診斷的主要輔助技術(shù)。通過(guò)顯示三倍體的核型,流式倍體分析常用于從完全性葡萄胎和非葡萄胎性水腫性流產(chǎn)中鑒別部分性葡萄胎[16]。但此方法不能明確妊娠絨毛組織中染色體的親本來(lái)源,因此無(wú)法區(qū)分均為二倍體核型的完全性葡萄胎和非葡萄胎性水腫性流產(chǎn),也無(wú)法區(qū)分均為三倍體的部分性葡萄胎和雙雌單雄性非葡萄胎三倍體流產(chǎn)。如前所述,雙雄單雌的部分性葡萄胎僅占所有三倍體流產(chǎn)的三分之二,因此流式分析檢測(cè)出的三倍體核型只能協(xié)助、但不能確診部分性葡萄胎,更不可能分辨出究竟是單精純合型還是雙精雜合型部分性葡萄胎[17]。此外,倍體分析組織標(biāo)本常遇到技術(shù)困難和解讀錯(cuò)誤。尤其是石蠟包埋組織容易出現(xiàn)細(xì)胞碎片和倍體直方圖峰值增寬,并伴有系數(shù)波動(dòng)等技術(shù)上的人工假象,不同的固定劑和固定條件也對(duì)DNA倍體分析具有明顯影響,這些都會(huì)造成結(jié)果偏差而導(dǎo)致葡萄胎的誤診[18]。

    2.P57免疫組化染色

    P57是細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶抑制蛋白,負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和抑制增殖。在胎盤(pán)部位,父源性P57屬于印跡基因而不能表達(dá),僅有母源性P57等位基因得以表達(dá),因此細(xì)胞核表達(dá)P57蛋白可作為胎盤(pán)部位有無(wú)母源性基因的標(biāo)志物[19]。作為胎盤(pán)絨毛生長(zhǎng)的源動(dòng)力,細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛間質(zhì)細(xì)胞常常是父源性基因印跡的代表,也是評(píng)判P57陽(yáng)性與否的評(píng)判對(duì)象。母體蛻膜細(xì)胞持續(xù)性表達(dá)母源性基因,可作為P57染色的陽(yáng)性?xún)?nèi)對(duì)照。絨毛表面的合體滋養(yǎng)細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞,不再具有增殖和分裂能力,因此不表達(dá)P57等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白,可作為P57染色的陰性?xún)?nèi)對(duì)照。對(duì)于完全性葡萄胎,細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛間質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)P57,有助于將完全性葡萄胎與表達(dá)P57的正常妊娠胎盤(pán)、水腫性流產(chǎn)和部分性葡萄胎中區(qū)分出來(lái)。

    盡管P57免疫組化染色已在絕大多數(shù)病理科得到了廣泛應(yīng)用,但其對(duì)于葡萄胎的診斷仍然具有不可避免的局限性[5]。首先,P57染色無(wú)法鑒別部分性葡萄胎和包含有母源性基因的其他水腫性妊娠(如水腫性流產(chǎn)、三體病、雙雌三倍體以及胎盤(pán)間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育不良)。其次,即使P57可以用于診斷完全性葡萄胎,但是無(wú)法鑒別雙精雜合型和單精純合型完全性葡萄胎,而此兩者的生物學(xué)行為截然不同,雙精雜合型完全性葡萄胎進(jìn)展為持續(xù)性滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的危險(xiǎn)度更高。再次,不完全印跡、人工輔助生殖后的雙胎妊娠、罕見(jiàn)的基因嵌合體以及病理醫(yī)生判讀中的主觀性偏差都有可能導(dǎo)致P57判讀的不確定性而對(duì)葡萄胎的診斷造成誤差[20]。

    3.STR基因分型

    STR是人類(lèi)基因組中長(zhǎng)度僅有2~7個(gè)核苷酸的DNA重復(fù)序列,在基因組非編碼區(qū)非常豐富并具有高度的遺傳穩(wěn)定性[6]。STR多態(tài)性是指?jìng)€(gè)體之間在相應(yīng)位置的STR位點(diǎn)內(nèi)重復(fù)片段數(shù)目有所不同。通過(guò)分析多個(gè)特異位點(diǎn)STR的數(shù)目,可以確認(rèn)個(gè)體的遺傳特點(diǎn)而達(dá)到個(gè)體識(shí)別和鑒定的目的。STR多態(tài)性分析已經(jīng)是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域進(jìn)行個(gè)體鑒定最精準(zhǔn)的方法?;谕瑯拥脑?,分析妊娠組織和相應(yīng)母體組織的STR多態(tài)性,可獲得葡萄胎中雙親的遺傳成份而有助于明確葡萄胎診斷及分型。使用商品化的STR遺傳學(xué)分析試劑盒,如 AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification和Promega Powerplex 16HS,能夠在一個(gè)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增15個(gè)STR位點(diǎn)及一個(gè)性別識(shí)別位點(diǎn),成為一個(gè)極其強(qiáng)大的基因組STR多態(tài)性分析平臺(tái)[21]。同時(shí),STR分析所需的DNA模板量極其微小 (少到1.5~2.5ng,相當(dāng)于150~250個(gè)人體細(xì)胞),其擴(kuò)增片段較短,僅為100~350個(gè)堿基對(duì),非常適合分析從福爾馬林固定、石蠟包埋組織中提取的DNA樣本,其準(zhǔn)確性已經(jīng)分別在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的身份鑒定和臨床移植鑲嵌體的檢測(cè)中得到了很好的驗(yàn)證。

    葡萄胎的遺傳學(xué)背景是其異常的父源性染色體成分。盡管已知很久,直到最近這樣的“金標(biāo)準(zhǔn)”才能夠用于葡萄胎的常規(guī)診斷。因?yàn)镾TR基因分型可以測(cè)定同一物種不同成員之間的遺傳學(xué)差異,所以可鑒定葡萄胎中每一個(gè)單倍體基因組是來(lái)自于父親還是來(lái)自于母親。因此,隨著商品化STR遺傳學(xué)分析檢測(cè)試劑盒的出現(xiàn)和多重STR分析方法性?xún)r(jià)比的提高,STR基因分型已被公認(rèn)為是一種準(zhǔn)確的和高性?xún)r(jià)比的葡萄胎診斷和分類(lèi)的檢測(cè)方法。

    葡萄胎妊娠的STR基因分型需要對(duì)絨毛和母體組織 (如子宮內(nèi)膜)的STR圖譜進(jìn)行對(duì)比[22]。鑒別每個(gè)STR基因座中有無(wú)父源性等位基因以及它的拷貝數(shù)是得到準(zhǔn)確分析結(jié)果的關(guān)鍵,即通過(guò)比較每一個(gè)STR位點(diǎn)的等位基因,識(shí)別出絨毛組織中異常的父源等位基因。如果絨毛組織的STR圖譜至少在兩個(gè)位點(diǎn)全部為父源性等位基因,即為完全性葡萄胎。如果在每個(gè)STR位點(diǎn)均出現(xiàn)兩個(gè)父源性和一個(gè)母源性等位基因,即為部分性葡萄胎[23]。具有來(lái)自于雙親的平衡性雙等位基因表型 (即“一父一母”)屬于非葡萄胎妊娠 (二倍體水腫性流產(chǎn))。而在平衡性雙等位基因表型基礎(chǔ)上,如在某一個(gè)STR位點(diǎn)出現(xiàn)了額外的母源性等位基因,則符合三體病的診斷。

    極其少見(jiàn)的雙親源性 (單精單卵)完全性葡萄胎是葡萄胎STR基因檢測(cè)面臨的一個(gè)潛在陷阱。盡管有母源性染色體的存在,異常的基因印跡使其組織學(xué)表現(xiàn)與完全性葡萄胎非常近似。但由于此種葡萄胎同時(shí)具有父源和母源性染色體,STR基因分型顯示為平衡性雙等位基因表型。此時(shí),P57免疫組化檢測(cè)常常提示母源性基因的異常印跡 (即細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛間質(zhì)細(xì)胞無(wú)P57的核表達(dá)),結(jié)合患者病史、臨床表現(xiàn)和進(jìn)一步的遺傳性突變檢測(cè)有助于此類(lèi)罕見(jiàn)遺傳性疾病的確診[5]。發(fā)生于雙胎妊娠的葡萄胎、基因嵌合體等可能使STR的分析變得復(fù)雜,產(chǎn)生難以解讀的結(jié)果,此時(shí)STR基因分型僅可排除葡萄胎,但無(wú)法進(jìn)一步解讀上述復(fù)雜的遺傳學(xué)改變[6]。

    完整的葡萄胎STR基因型分析流程包括靶組織的選擇與分離、DNA提取、STR位點(diǎn)多重PCR、毛細(xì)管電泳片段分析以及數(shù)據(jù)解析與判讀。由于絨毛和母體組織的STR多態(tài)對(duì)比分析是診斷葡萄胎的關(guān)鍵,組織分離和純化就顯得非常重要,尤其是部分性葡萄胎的診斷。在大多數(shù)流產(chǎn)刮宮樣本中,絨毛和蛻膜組織的界限比較清楚,可輕易辨識(shí)而分別裝入試管進(jìn)入提取過(guò)程。但一些標(biāo)本中母體血液、子宮內(nèi)膜組織或細(xì)胞可能會(huì)與絨毛組織密切混合,所以評(píng)估組織交叉污染的程度是STR基因多態(tài)性分析的前提。對(duì)于希望用于STR分析的絨毛樣本,建議使用生理鹽水漂浮的方法做好絨毛和蛻膜的前期分離,病理取材醫(yī)生將兩種組織分別包埋制片,最后由診斷醫(yī)生進(jìn)行顯微鏡下進(jìn)行確認(rèn)和精確分離。如前期處理不當(dāng)或使用存檔蠟塊,導(dǎo)致不能獲得純凈的蛻膜組織,建議使用母體外周血中的白細(xì)胞作為母體基因組的來(lái)源,用于判斷絨毛組織中是否存在過(guò)量的父源性基因。

    三、展望

    隨著血清hCG監(jiān)測(cè)和早期超聲檢查的飛速發(fā)展,盡管大多數(shù)葡萄胎往往在妊娠的極早期階段即被終止,但是繼葡萄胎之后發(fā)生妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的危險(xiǎn)性并未發(fā)生改變,而且不同基因型的葡萄胎繼發(fā)持續(xù)性滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的危險(xiǎn)度也有所不同。因此,葡萄胎的精準(zhǔn)診斷和分型對(duì)于患者的臨床處置和預(yù)后具有重要意義。目前,單純形態(tài)學(xué)診斷的準(zhǔn)確性明顯不足,病理學(xué)家,甚至是婦產(chǎn)科病理學(xué)專(zhuān)家在診斷葡萄胎存在著相當(dāng)?shù)牟灰恢滦?。如果病理醫(yī)生對(duì)水腫性絨毛組織有診斷疑問(wèn),則應(yīng)該進(jìn)行包括STR基因分型和/或免疫組化在內(nèi)的輔助診斷以排除葡萄胎妊娠。STR基因分型為葡萄胎的準(zhǔn)確診斷和遺傳學(xué)分型提供了一種極其有效的分子手段,該方法比傳統(tǒng)的流式倍體分析和免疫組化染色具有更大的優(yōu)越性。隨著大多數(shù)醫(yī)院病理科分子診斷能力的逐步提高,STR基因分型將成為葡萄胎常規(guī)診斷中必不可缺少的一項(xiàng)應(yīng)用技術(shù)。

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