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    染色體微陣列分析在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

    2016-12-16 19:37:51劉翠嫻熊符
    婦產(chǎn)與遺傳(電子版) 2016年4期
    關(guān)鍵詞:拷貝數(shù)核型高通量

    劉翠嫻 熊符

    一、引言

    出生缺陷可造成胎兒、嬰兒的死亡,人類(lèi)壽命的縮短,并可導(dǎo)致許多兒童患病和殘疾,因此成為當(dāng)今各國(guó)重視的衛(wèi)生問(wèn)題。相當(dāng)一部分出生缺陷是基因及染色體變異導(dǎo)致,而基因組拷貝數(shù)變異就是其中之一[1-2]?;蚪M拷貝數(shù)變異 (copy number variations,CNVs)即染色體片段的重復(fù)或缺失,指與已報(bào)道的正?;蚪M相比,拷貝數(shù)存在差異且增加或減少的堿基數(shù)目>1kb,這是一種十分普遍的染色體變異,并且很多染色體數(shù)目的變異都與疾病直接相關(guān)[3]。為減少及預(yù)防缺陷嬰兒的出生,精準(zhǔn)的產(chǎn)前診斷技術(shù)及專(zhuān)業(yè)的遺傳咨詢(xún)必不可少。目前,主要的產(chǎn)前診斷技術(shù)包括核型分析、染色體微陣列分析、熒光原位雜交技術(shù) (fluorescence in situ hybridization,F(xiàn)ISH)、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)、熒光定量PCR、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及Sanger測(cè)序、高通量測(cè)序等。其中,染色體微陣列分析是2001年人類(lèi)基因組計(jì)劃完成后衍生的一種新的分子水平染色體分析技術(shù),在進(jìn)行全基因組掃描時(shí),其高分辨率能夠檢出<50kb的基因拷貝數(shù)變異。CMA技術(shù)主要結(jié)合了傳統(tǒng)的比較基因組雜交與基因探針兩種方法,其基本原理是將待測(cè)基因組DNA用特定的熒光或生物素進(jìn)行標(biāo)記,然后結(jié)合到已包埋在固相載體上的探針陣列中,再通過(guò)檢測(cè)待測(cè)基因與探針的雜交信號(hào)以實(shí)現(xiàn)對(duì)海量的基因信息的定量分析,該技術(shù)以PCR和分子雜交為基礎(chǔ),實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的快速、有效地檢測(cè),這樣不僅顯著提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度,還大大提高了檢測(cè)效率[4]。目前,CMA根據(jù)芯片所使用探針類(lèi)型的不同分為兩大類(lèi),分別是微陣列比較基因組雜交 (array-based comparative genomic hybridization,aCGH)及單核苷酸多態(tài)性微陣列(single nucleotide ploymophism array,SNP array)技術(shù)[5-7]。前者探針來(lái)源于基因組寡核苷酸序列,其優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)拷貝數(shù)變異方面,該技術(shù)的探針能覆蓋全基因組位點(diǎn),分辨率可精確到50 bp或以下;而后者是根據(jù)人類(lèi)基因組單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針位點(diǎn),優(yōu)勢(shì)在于除了能夠檢出CNV以外,還能夠檢測(cè)出大多數(shù)的單親二倍體以及檢測(cè)到低水平的嵌合體[8-10]及單基因疾病等,有利于大量樣本關(guān)聯(lián)連鎖研究,但不能識(shí)別基因組拷貝數(shù)變異[11]。

    二、CMA技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

    在產(chǎn)前診斷的過(guò)程中,對(duì)于常規(guī)產(chǎn)前檢查、唐氏篩查、超聲檢查等發(fā)現(xiàn)的可疑征象,往往需要進(jìn)行細(xì)胞和分子層面的更為準(zhǔn)確精細(xì)的檢測(cè)。臨床上常用的手段有細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析、FISH、比較基因組雜交 (comparative genomic hybridization,CGH)等。通過(guò)G顯帶染色體核型分析技術(shù)可以檢出的基因組拷貝數(shù)變化主要表現(xiàn)形式為較大片段的染色體結(jié)構(gòu)變異如缺失或重復(fù)或易位或倒位,對(duì)片段較小的拷貝數(shù)變異則存在漏檢。針對(duì)染色體的拷貝數(shù)變異,近年來(lái)多項(xiàng)研究表明CMA技術(shù)能對(duì)其進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)。CMA技術(shù)分辨率高,可檢測(cè)出低于50kb的微缺失及微重復(fù),且有效地克服或彌補(bǔ)了現(xiàn)有的染色體檢測(cè)技術(shù)的局限性,將染色體的診斷提高到了亞顯微甚至是基因的水平上,極大地提高了染色體異常的檢出率,而且其具有特異性高、靈敏度強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單快速等優(yōu)勢(shì),已被廣泛應(yīng)用于微生物、腫瘤、遺傳性疾病及產(chǎn)前診斷等多個(gè)領(lǐng)域[12-13]。

    CMA作為一種新的檢測(cè)技術(shù),相對(duì)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有不可比擬的優(yōu)點(diǎn)[14]。傳統(tǒng)的G顯帶染色體核型分析是產(chǎn)前細(xì)胞遺傳診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”,其優(yōu)點(diǎn)是可以檢測(cè)到染色體的平衡異位,該技術(shù)需要培養(yǎng)足夠量的細(xì)胞才能進(jìn)行人工鏡檢,而且只能分辨大于10Mb的染色體變異,存在較高的人為偏差。而FISH作為針對(duì)核型分析缺陷而發(fā)展的一項(xiàng)更為精細(xì)的技術(shù),具有比核型分析更高的分辨率并且可以檢測(cè)到平衡及不平衡易位以及融合基因,但其一次只能檢測(cè)一到數(shù)個(gè)異常染色體片段,而且不能檢測(cè)雜合子缺失 (loss of heterozygosity,LOH)/單親二倍體 (uniparental disomy,UPD)。而且,F(xiàn)ISH的檢測(cè)依賴(lài)探針,目前所制備的探針類(lèi)型及數(shù)目比較單一,不能作為全基因篩查的一種方法。相較于G顯帶及FISH檢測(cè)方法,CMA分辨率高,能夠全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)到細(xì)微的缺失及重復(fù);同時(shí),SNP array利用高密度的單核苷酸芯片檢測(cè)基因組基因的多態(tài)性,可以進(jìn)行 LOH、UPD 以及多倍體的檢測(cè)等[15-17]。而且,CMA的檢測(cè)無(wú)需進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng),整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期只需兩天,可縮短患者的心理焦慮時(shí)間,而且實(shí)驗(yàn)的流程經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理,其結(jié)果運(yùn)用軟件分析,代替了以往的主觀判斷,降低了人為偏差[18-19]。但是,CMA也存在一定的缺點(diǎn),例如不能檢測(cè)平衡異位、倒位。更為重要的是,CMA目前最大問(wèn)題是對(duì)結(jié)果的正確解讀,其原因在于該技術(shù)能找出約1%的不確定性的拷貝數(shù)變異,這會(huì)給遺傳咨詢(xún)帶來(lái)一定的困擾[20-21]。即使CMA存在上述一些缺點(diǎn),但其對(duì)拷貝數(shù)變異檢測(cè)具有顯著優(yōu)勢(shì),其臨床應(yīng)用價(jià)值不可低估。

    隨著科學(xué)的進(jìn)步,產(chǎn)前篩查技術(shù)也是日新月異。近幾年發(fā)展比較快的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷即孕婦外周血高通量測(cè)序就是其中之一,其特點(diǎn)是對(duì)胎兒沒(méi)有創(chuàng)傷,并且敏感性及特異性高,適合胎兒染色體非整倍體篩查[22-23]。高通量測(cè)序即深度測(cè)序,是在人類(lèi)基因組測(cè)序順利完成的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的第二代測(cè)序技術(shù),該技術(shù)能較好地檢測(cè)到13、18、21號(hào)染色體的整體變化情況,但對(duì)于更細(xì)微的基因組拷貝數(shù)變異,則需要提高測(cè)序的深度才能檢測(cè)成功,該技術(shù)對(duì)生物信息分析要求比較高,要處理大量的測(cè)序數(shù)據(jù)。而且,無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前高通量測(cè)序在染色體非整倍體檢測(cè)中會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性及假陰性結(jié)果,可能原因包括母體細(xì)胞嵌合、母體的癌細(xì)胞、消失的雙胎以及母體的拷貝數(shù)變異、游離在母體外周血的胎兒遺傳片段少等。所以,無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前高通量測(cè)序結(jié)果陽(yáng)性的孕婦都需要進(jìn)一步做有創(chuàng)的CMA或核型檢測(cè),結(jié)合CMA或核型結(jié)果對(duì)孕婦胎兒情況進(jìn)行判斷。同時(shí),CMA技術(shù)在嵌合體檢測(cè)方面亦優(yōu)于高通量測(cè)序技術(shù),其能根據(jù)樣本DNA與探針雜交信號(hào)的比對(duì),甚至可以精確地檢測(cè)到嵌合比例。并且,高通量測(cè)序也存在不能檢測(cè)染色體平衡異位、費(fèi)用高、檢測(cè)出的數(shù)據(jù)量大,難以分析等特點(diǎn)[24]。更重要的是,無(wú)創(chuàng)高通量測(cè)序的假陽(yáng)性結(jié)果風(fēng)險(xiǎn)將會(huì)在極大程度上導(dǎo)致孕婦做出終止妊娠的錯(cuò)誤決定。所以,無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前高通量技術(shù)亦離不開(kāi)CMA技術(shù),前者做篩查,后者做驗(yàn)證,才能得出一個(gè)準(zhǔn)確的產(chǎn)前診斷結(jié)果。

    三、CMA技術(shù)在產(chǎn)前診斷的臨床應(yīng)用

    CMA作為一線技術(shù)早已應(yīng)用于臨床,2010年國(guó)際細(xì)胞遺傳學(xué)協(xié)會(huì)認(rèn)定CMA為發(fā)育障礙或先天畸形患者的染色體突變檢測(cè)的首選臨床診斷檢測(cè)技術(shù)[25]。此外,2009年美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)會(huì)亦推薦aCGH作為一線技術(shù)應(yīng)用于智力障礙、自閉癥和先天性異?;颊叩娜旧w檢測(cè)[26]。美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)大會(huì)則認(rèn)為對(duì)全部妊娠婦女提供有創(chuàng)取樣微芯片檢測(cè)是合適的,推薦無(wú)論風(fēng)險(xiǎn)如何,所有的孕婦都應(yīng)有機(jī)會(huì)選擇有創(chuàng)的產(chǎn)前診斷芯片技術(shù)檢測(cè)技術(shù)[27]。2009年美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)醫(yī)師協(xié)會(huì)提出建議對(duì)于超聲檢查證實(shí)胎兒攜帶一個(gè)或者多個(gè)結(jié)構(gòu)異常并正在接受侵入性產(chǎn)前診斷的患者,建議進(jìn)行CMA代替?zhèn)鹘y(tǒng)的胎兒核型分析檢測(cè),而且若胎兒出現(xiàn)宮內(nèi)死亡或死產(chǎn)的情況,需要進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)分析時(shí),建議對(duì)胎兒組織 (即羊水,胎盤(pán)或妊娠物)進(jìn)行染色體微陣列分析,因?yàn)樵摷夹g(shù)可以增加獲得結(jié)果的可能性,提高致病畸形的檢測(cè)率[28]。此外,2010年加拿大醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)會(huì)同樣推薦CMA作為研究發(fā)育遲緩/精神發(fā)育遲滯、自閉癥、多種先天性異?;蚧蔚然颊叩牡谝痪€實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù);當(dāng)超聲或胎兒磁共振成像技術(shù)檢測(cè)胎兒存在結(jié)構(gòu)異常,或當(dāng)進(jìn)行非整倍體快速掃描的結(jié)果是陰性時(shí),建議aCGH可以代替染色體核型分析,作為一個(gè)適當(dāng)?shù)脑\斷檢查[29]。鑒于CMA技術(shù)在醫(yī)療領(lǐng)域得到的高度評(píng)價(jià),接下來(lái)簡(jiǎn)要地介紹CMA技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的臨床應(yīng)用。

    1.多發(fā)性自然流產(chǎn)的原因排查:2012年,Wapner等[27]人曾對(duì)3 822例核型正常的樣本進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)96例 (2.5%)存在或可能存在致病的染色體拷貝數(shù)變化。而有研究顯示,核型分析正常的群體中依然能檢測(cè)出6%的染色體異常,而這部分人發(fā)生流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)更高。而5%的流產(chǎn)原因已經(jīng)明確是由于染色體的微缺失、微重復(fù)導(dǎo)致,而這種畸變無(wú)法被傳統(tǒng)檢測(cè)方法所識(shí)別。2013年有研究對(duì)一例多發(fā)性流產(chǎn)患者進(jìn)行染色體核型分析,利用SNP array確定了該患者外周血所有有核細(xì)胞的染色體核型均為47,XX,+8,找到造成患者習(xí)慣性流產(chǎn)的原因[30]。

    2.產(chǎn)前胎兒染色體檢測(cè):由于染色體變異能導(dǎo)致多種遺傳性疾病的發(fā)生,所以,應(yīng)用CMA技術(shù)進(jìn)行胎兒產(chǎn)前診斷尤為必要。該技術(shù)的產(chǎn)前診斷適應(yīng)證包括:分娩時(shí)年齡達(dá)到或超過(guò)35歲的孕婦;孕期超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常或軟骨指標(biāo)陽(yáng)性的孕婦;曾生育過(guò)染色體異?;純旱脑袐D;夫婦之一是染色體平衡異位、羅氏異位、倒位攜帶者的夫婦;可能攜帶某種X連鎖遺傳病基因的孕婦;曾有不明原因的自然流產(chǎn)史、不明原因胎兒停止發(fā)育、死產(chǎn)的孕婦;或新生兒死亡的孕婦等;妊娠期接觸了致癌物質(zhì)的孕婦;宮內(nèi)發(fā)育遲緩的胎兒及其父母。其中,對(duì)超聲結(jié)果顯示結(jié)構(gòu)異常而傳統(tǒng)核型分析結(jié)果正常的胎兒,進(jìn)行CMA技術(shù)檢測(cè)尤為必要。利用CMA技術(shù)進(jìn)行以上適應(yīng)證的產(chǎn)前診斷,可以為患者提供有效的遺傳咨詢(xún)所需要的信息,更好地控制出生人口的身體素質(zhì)。

    3.胚胎植入前遺傳學(xué)診斷:2006年,Le Caignec等[31]證實(shí)了aCGH應(yīng)用于染色體平衡易位攜帶者進(jìn)行第三代試管嬰兒即植入前遺傳學(xué)診斷 (preimplantation genetic diagnosis,PGD) 的 可 行 性。Fiorentino等[32-33]也進(jìn)一步地利用aCGH技術(shù)檢測(cè)了18種不同易位產(chǎn)生的68類(lèi)非平衡,并檢測(cè)到了最小為2.5 Mb的非平衡片段及可以檢測(cè)出低至10%水平的嵌合體。上述研究結(jié)果表明,aCGH技術(shù)應(yīng)用于胚胎植入前染色體易位遺傳學(xué)診斷具有令人滿(mǎn)意的效果。aCGH用于IVF可以獲得較高的臨床妊娠率[34],且可以應(yīng)用于復(fù)雜易位和全基因組異倍體篩查[35]。隨著科技的發(fā)展,aCGH有望成為輔助生殖領(lǐng)域中經(jīng)濟(jì)而可靠的胚胎全基因組診斷技術(shù)。

    4.“二孩”的孕前遺傳咨詢(xún)及產(chǎn)前診斷:“二孩”政策開(kāi)放使許多家庭再生育的愿望得以實(shí)現(xiàn),但已生育過(guò)一個(gè)表型異?;蛘J(rèn)知障礙孩子的家庭對(duì)此望而卻步。而染色體微陣列分析能幫這些患者家庭找出病因,是產(chǎn)后及新生兒表型異常以及認(rèn)知功能障礙等的一個(gè)主要的遺傳評(píng)估手段。已有許多研究表明CMA技術(shù)能對(duì)不明原因的智力障礙、多發(fā)先天畸形及自閉癥等進(jìn)行分子診斷[36-38]。大約有12%~19%的此類(lèi)患者能被CMA檢測(cè)出攜帶染色體異常,而傳統(tǒng)的G顯帶核型分析的檢出率只有2%~3%,脆性X試驗(yàn)的檢出率則是0.46%[39]。由此,美國(guó)兒科學(xué)會(huì)推薦CMA成為這些疾病的分子檢測(cè)技術(shù)的第一道防線[6]。所以,可以通過(guò)CMA找出導(dǎo)致患者表型或認(rèn)知異常的分子機(jī)制,然后給患者家庭提供相應(yīng)的遺傳咨詢(xún)及下一胎的產(chǎn)前診斷,減少患兒出生的可能性。國(guó)內(nèi)外的研究表明,應(yīng)用CMA技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前、產(chǎn)后遺傳病診斷是提高染色體患兒檢出率、查明病因并指導(dǎo)家庭二次生育的有效措施。

    綜上所述,CMA是當(dāng)前針對(duì)基因拷貝數(shù)變異及致病基因多態(tài)性的最好的一種高通量掃描及基因分型技術(shù),可以用于多種疾病的產(chǎn)前診斷,提高出生人口的身體素質(zhì)。隨著基因致病數(shù)據(jù)庫(kù)的完善及芯片技術(shù)的改進(jìn),CMA這項(xiàng)技術(shù)還將繼續(xù)迅速發(fā)展,并在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更多重要的作用。

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