均勻設(shè)計(jì)法結(jié)合動(dòng)態(tài)優(yōu)化法優(yōu)選復(fù)方獨(dú)一味凝膠貼膏的提取工藝

王 森，歐水平，袁 濤（1.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州遵義 5600；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，貴州遵義 5600；.江西青峰藥業(yè)有限公司，江西贛州 41008）

均勻設(shè)計(jì)法結(jié)合動(dòng)態(tài)優(yōu)化法優(yōu)選復(fù)方獨(dú)一味凝膠貼膏的提取工藝

王 森1＊，歐水平2#，袁 濤3（1.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州遵義 563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，貴州遵義 563003；3.江西青峰藥業(yè)有限公司，江西贛州 341008）

目的：優(yōu)選復(fù)方獨(dú)一味凝膠貼膏的提取工藝。方法：以浸膏得率、5種指標(biāo)成分（馬錢苷酸、山梔苷甲酯、龍膽苦苷、8-O-乙酰山梔苷甲酯、2′，4′-二羥基查耳酮）提取率和純度（5種指標(biāo)成分含量之和/浸膏得率）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以乙醇用量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間為考察因素，獲得均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝參數(shù)后，進(jìn)一步采用動(dòng)態(tài)優(yōu)化法優(yōu)化提取時(shí)間。結(jié)果：均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝為8倍量90%乙醇回流提取2次，每次1 h；優(yōu)化后的浸膏得率為24.37%，5種指標(biāo)成分提取率依次為0.10%、0.51%、1.65%、0.74%、0.19%，純度為13.11%。動(dòng)態(tài)優(yōu)化后提取時(shí)間縮短為第1次40 min、第2次30 min，浸膏得率為24.58%，5種指標(biāo)成分提取率依次為0.10%、0.52%、1.78%、0.75%、0.31%，純度為14.08%。結(jié)論：均勻設(shè)計(jì)優(yōu)選的提取工藝合理、穩(wěn)定，提取率高；動(dòng)態(tài)優(yōu)化法可進(jìn)一步縮短提取時(shí)間、降低耗能、節(jié)約生產(chǎn)成本。

獨(dú)一味；凝膠貼膏；浸膏得率；指標(biāo)成分；均勻設(shè)計(jì)；動(dòng)態(tài)優(yōu)化法

復(fù)方獨(dú)一味凝膠貼膏由獨(dú)一味、白花秦艽、鐮形棘豆、唐古特烏頭組方而成，有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、消腫止痛之功效，對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有良好療效[1]。本品原為藏醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方，臨床以粉末調(diào)敷，有效成分透皮吸收有限，使用不便，限制了臨床應(yīng)用。本研究將處方藥味進(jìn)行提取后制成凝膠貼膏，以擴(kuò)大用藥范圍、提高順應(yīng)性。方中獨(dú)一味中所含環(huán)烯醚萜苷類成分是主要活性成分，代表成分為山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯，有鎮(zhèn)痛、抗炎、止血等作用[2-3]；白花秦艽所含環(huán)烯醚萜苷類成分是其主要活性成分，代表成分為馬錢苷酸、龍膽苦苷，有鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[4]；鐮形棘豆中黃酮類成分主要有抗炎止痛、清熱解毒等藥理作用，代表成分為2′，4′-二羥查耳酮[5]?？紤]獨(dú)一味、白花秦艽均含環(huán)烯醚萜苷類成分，擬采用合提方式。但環(huán)烯醚萜苷類含有半縮醛結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性差，容易在稀堿環(huán)境下發(fā)生結(jié)構(gòu)異構(gòu)化，如龍膽苦苷極易轉(zhuǎn)化為龍膽堿[6]，故將方中獨(dú)一味、鐮形棘豆、白花秦艽混合提??；而唐古特烏頭含生物堿類成分，宜分開單獨(dú)提取[7-8]。本試驗(yàn)選用浸膏得率，以及山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯、馬錢苷酸、龍膽苦苷、2′，4′-二羥基查耳酮等5種指標(biāo)成分的提取率和純度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以優(yōu)化提取工藝，為研制性質(zhì)穩(wěn)定、工藝可行的復(fù)方獨(dú)一味凝膠貼膏奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜（HPLC）儀，包括G1322A型在線脫氣機(jī)、G1311A型四元泵、G1316A型柱溫箱、G1314A型可見波長檢測(cè)器（美國安捷倫公司）；BS124S型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.2 藥材、藥品與試劑

獨(dú)一味、鐮形棘豆、白花秦艽藥材均由西藏藏醫(yī)學(xué)院提供，經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院藥劑學(xué)教研室王森副教授鑒定符合2015年版《中國藥典》相關(guān)規(guī)定；馬錢苷酸（批號(hào)：L-005-121002）、山梔苷甲酯（批號(hào)：M-0008-13111）、龍膽苦苷（批號(hào)：S-013-120910）、8-O-乙酰山梔苷甲酯（批號(hào)：120809）對(duì)照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，純度：≥98%）；2′，4′-二羥基查耳酮對(duì)照品（天津阿法埃莎化學(xué)有限公司，批號(hào)：MFCD00180050，純度：≥98%）；乙腈、磷酸等均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 5種指標(biāo)成分的含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取馬錢苷酸、山梔苷甲酯、龍膽苦苷、8-O-乙酰山梔苷甲酯對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋成每1 ml含馬錢苷酸0.502 mg、山梔苷甲酯0.536 mg、龍膽苦苷0.818 mg、8-O-乙酰山梔苷甲酯0.480 mg的混合溶液，搖勻，即得對(duì)照品溶液1。取2′，4′-二羥基查耳酮對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋成每1 ml含2′，4′-二羥基查耳酮0.122 mg的溶液，搖勻，即得對(duì)照品溶液2。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取“2.3”～“2.6”項(xiàng)下制備的獨(dú)一味、鐮形棘豆、白花秦艽混合提取液1 ml，置于10 ml量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05%磷酸水（B）（用于同時(shí)測(cè)定馬錢苷酸、山梔苷甲酯、龍膽苦苷和8-O-乙酰山梔苷甲酯），梯度洗脫[9]（0～15 min，9%A；15～18 min，9%～11%A；18～28 min，11%A；28～35 min，11%～18%A）；乙腈-0.05%磷酸水（60∶40，V/V，用于測(cè)定2′，4′-二羥基查耳酮）；柱溫30℃；流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長235 nm（馬錢苷酸、山梔苷甲酯、龍膽苦苷和8-O-乙酰山梔苷甲酯）、365 nm（2′，4′-二羥基查耳酮）；進(jìn)樣量：20 μl。取“2.1.1”“2.1.2”項(xiàng)下溶液進(jìn)樣測(cè)定，理論板數(shù)按5種指標(biāo)成分峰計(jì)不低于3 000，分離度＞1.5。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品溶液1；B.供試品溶液1（馬錢苷酸、山梔苷甲酯、龍膽苦苷和8-O-乙酰山梔苷甲酯）；C.對(duì)照品溶液2；D.供試品溶液2（2，′4′-二羥基查耳酮）；1.馬錢苷酸；2.山梔苷甲酯；3.龍膽苦苷；4.8-O-乙酰山梔苷甲酯；5.2，′4′-二羥基查耳酮Fig 1 HPLC chromatogramsA.standard solution 1；B.sample solution 1（loganin acid，shanzhiside methyl ester，gentiopicroside，8-O-acetyl shanzhiside methyl ester）；C. standard solution 2；D.sample solution 2（2′，4′-dihydroxychalcone）；1. loganin acid；2.shanzhiside methyl ester；3.gentiopicroside；4.8-O-acetyl shanzhiside methyl ester；5.2，′4′-dihydroxychalcone

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml對(duì)照品溶液1，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml對(duì)照品溶液2，分別置于5 ml量瓶中，蒸餾水定容，制得不同濃度系列對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，線性方程與線性范圍見表1。

表1 指標(biāo)成分線性方程與線性范圍Tab 1 The linear equation and range of marker components

2.1.5 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率試驗(yàn) 按相關(guān)方法操作。結(jié)果，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均未超過2.33%（n＝6），供試品在15 h內(nèi)穩(wěn)定；平均加樣回收率在98.91%～100.32%之間（RSD≤2.62%，n＝6）。

2.2 浸膏得率測(cè)定

精密量取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液20 ml，置于105℃已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃干燥10 h，置于干燥器中冷卻至室溫，迅速稱定干膏質(zhì)量并計(jì)算浸膏得率。浸膏得率（%）＝干膏質(zhì)量（g）×提取液總體積（ml）/[藥材質(zhì)量（g）×20 ml]×100%。

2.3 單因素考察

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，采用回流法提取方法，單因素考察提取溶劑、次數(shù)、時(shí)間對(duì)浸膏得率和提取物中5種指標(biāo)成分提取率及純度（5種指標(biāo)成分含量之和/浸膏得率×100%）的影響。

2.3.1 提取溶劑 按處方比例稱取藥材獨(dú)一味、鐮形棘豆、白花秦艽粉末共25.0 g，共4份。分別加入10倍量蒸餾水、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇，浸泡30 min，加熱回流提取2次，每次提取1 h，合并提取液，濾過，加相應(yīng)溶劑定容至500 ml，即得混合提取液，按“2.1.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 提取溶劑考察結(jié)果（%%）Tab 2 The results of solvent extraction test（%%）

結(jié)果表明，與水和低體積分?jǐn)?shù)乙醇比較，高體積分?jǐn)?shù)乙醇可總體提高指標(biāo)成分提取率，但使用95%乙醇會(huì)降低浸膏得率，故擬以70%乙醇為均勻試驗(yàn)考察的中間水平。

2.3.2 提取次數(shù) 稱取“2.3.1”項(xiàng)下藥材粉末25.0 g，加入10倍量70%乙醇溶液，加熱回流提取3次，每次1 h，將每次提取的提取液分別倒出，過濾，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表3（表中“＊”表示5種指標(biāo)成分含量之和/3次浸膏得率之和×100%）。

表3 提取次數(shù)考察結(jié)果（%%）Tab 3 The results of extraction times test（%%）

結(jié)果表明，經(jīng)2次提取后，浸膏得率、指標(biāo)成分的提取率及純度均較高，為兼顧提取效率和成本，確定提取次數(shù)為2次。

2.3.3 提取時(shí)間 稱取“2.3.1”項(xiàng)下藥材粉末25.0 g，共3份，加入10倍量70%乙醇溶液，分別加熱回流提取1、1.5、2 h，提取2次，過濾，得混合提取液后按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4 提取時(shí)間考察結(jié)果（%%）Tab 4 The results of extraction time test（%%）

結(jié)果表明，隨著提取時(shí)間的增加，5種指標(biāo)成分的提取率未顯著增加，而浸膏得率呈上升趨勢(shì)，純度呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，故需對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2.4 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化

根據(jù)單因素考察結(jié)果，以一定體積分?jǐn)?shù)乙醇為提取溶劑，提取次數(shù)為2次，選擇溶劑倍數(shù)（X1）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X2）、提取時(shí)間（X3，h）為考察因素，以提取物的浸膏得率、5種指標(biāo)成分的提取率及純度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用U6（64）均勻設(shè)計(jì)表安排試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

表5 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果（%%）Tab 5 The design and results of uniform design（%%）

以5種指標(biāo)成分的總提取率（Y）為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用JMP Pro 10統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多元回歸分析[7-8]。結(jié)果Y＝0.122 1－0.001 9X1+0.055 9X2－0.015 04X3－0.055 5×（X2－0.7）×（X3－1.5），r2＝0.999 4。方差分析結(jié)果見表6。

表6 方差分析結(jié)果Tab 6 Results of variance analysis

注：F0.1（2，2）＝9.00，F(xiàn)0.05（2，2）＝19.00

Note：F0.1（2，2）＝9.00，F(xiàn)0.05（2，2）＝19.00

結(jié)果表明，在均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)條件下，擬合的模型顯著，對(duì)提取工藝的影響依次為X2＞X3＞X1＞X2X3，Y隨X1、X3的增大而減小，隨X2的增大而增大。其中X2的影響最顯著，X1、X3、X2X3的影響達(dá)到顯著水平，X2與X3有一定交互作用。相對(duì)X3而言，X2對(duì)Y的影響更顯著，X2提高至90%可顯著降低浸膏得率，提高指標(biāo)成分提取率，使Y明顯提高；且X2越靠近90%，隨X3的縮短Y提高越明顯，可見X2和X3的影響規(guī)律與單因素考察結(jié)果一致，即提高乙醇濃度和縮短提取時(shí)間，有利于提高指標(biāo)成分純度。

通過JMP Pro 10軟件預(yù)測(cè)刻畫器，以指標(biāo)成分總純度最大化為優(yōu)化意愿，預(yù)測(cè)最優(yōu)提取工藝參數(shù)為8倍量90%乙醇回流提取2次，每次1 h；指標(biāo)成分總純度理論預(yù)測(cè)值為14.8%，預(yù)測(cè)意愿達(dá)99.86%。

2.5 均勻設(shè)計(jì)驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方比例稱取獨(dú)一味、鐮形棘豆、白花秦艽藥材粉末125.0 g，根據(jù)均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化的工藝參數(shù)提取，即得混合提取液，平行進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表7，表明均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行。

表7 工藝驗(yàn)證結(jié)果（%%）Tab 7 The results of technology verification（%%）

2.6 提取時(shí)間動(dòng)態(tài)優(yōu)化

由均勻設(shè)計(jì)分析可知縮短提取時(shí)間可提高指標(biāo)成分提取率、縮短生產(chǎn)周期、降低生產(chǎn)成本，但均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)未考察提取時(shí)間1 h以內(nèi)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。按均勻優(yōu)化工藝條件提取藥材，分別在10、20、30、40、50、60 min時(shí)精密量取提取液3 ml進(jìn)行含量測(cè)定，每次補(bǔ)足同體積的90%乙醇。提取完畢后，濾過，再加入8倍量90%乙醇，相同時(shí)間間隔取樣測(cè)定，結(jié)果見表8、表9。

表8 第1次提取各時(shí)間點(diǎn)指標(biāo)成分含量（mg/ml）Tab 8 The contents of marker components at different time points of first extraction（mg/ml）

表9 第2次提取各時(shí)間點(diǎn)指標(biāo)成分含量（mg/ml）Tab 9 The contents of marker components at different time points of second extraction（mg/ml）

結(jié)果表明，在2次提取過程中，隨著提取時(shí)間的延長，提取液中5種指標(biāo)成分含量均先增加后減少，這可能與指標(biāo)成分長時(shí)間受熱不穩(wěn)定有關(guān)。故以每次提取指標(biāo)成分含量達(dá)最高值的時(shí)間為優(yōu)化后的提取時(shí)間，即第1次提取時(shí)間為40 min，第2次提取時(shí)間為30 min，并與均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝進(jìn)行比較，結(jié)果見表10。

表10 兩種提取工藝結(jié)果比較（%%）Tab 10 Comparison of two extraction technologies（%%）

結(jié)果表明，動(dòng)態(tài)優(yōu)化提取方法在指標(biāo)成分提取率和純度方面均優(yōu)于均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，且提取時(shí)間比均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝節(jié)約42%，有利于提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本。

3 討論

中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，因此僅單一藥味或單一成分作為指標(biāo)考察提取工藝，不能全面反映提取效果[8-9]。復(fù)方獨(dú)一味凝膠貼膏為藏藥復(fù)方制劑，本研究為全面兼顧復(fù)方制劑藥味和有效成分對(duì)藥理作用的貢獻(xiàn)，根據(jù)各藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，結(jié)合制劑臨床應(yīng)用，設(shè)計(jì)了提取工藝路線。

復(fù)方獨(dú)一味凝膠貼膏原方以粉末調(diào)敷外用，獨(dú)一味、白花秦艽、鐮形棘豆日用量約25 g。為兼顧臨床粉末調(diào)敷用藥的需求，在外用調(diào)敷粉末的基礎(chǔ)上進(jìn)行提取，即先將3味藥材（各5 kg）粉碎成粉末調(diào)敷成相當(dāng)粒度的粉末，并按處方量混合均勻，考察提取工藝設(shè)計(jì)時(shí)取樣25 g進(jìn)行試驗(yàn)。后期進(jìn)行放大試驗(yàn)（提取3味藥材共4 kg），結(jié)果浸膏得率、5種指標(biāo)成分提取率與純度均較高，表明提取工藝的合理和可放大性，可為工業(yè)化大規(guī)模提取提供可靠的依據(jù)。

均勻設(shè)計(jì)和動(dòng)態(tài)優(yōu)化法在中藥提取中得到了廣泛應(yīng)用，能夠用較少的試驗(yàn)次數(shù)優(yōu)選出比較科學(xué)合理的工藝[10-11]。本試驗(yàn)采用均勻設(shè)計(jì)法，讓試驗(yàn)點(diǎn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)充分地“均勻分散”，使每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)有更好的代表性，以較小次數(shù)的試驗(yàn)獲取更好的試驗(yàn)效果[12]，并采用JMP Pro 10軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸建模分析[13-14]，取得了預(yù)期效果。

綜上所述，本研究均勻設(shè)計(jì)優(yōu)選的提取工藝合理、穩(wěn)定，提取率高；動(dòng)態(tài)優(yōu)化法可進(jìn)一步縮短提取時(shí)間、降低耗能、節(jié)約生產(chǎn)成本。

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（編輯：劉明偉）

Optimization of the Extraction Technology of Compound Lamiophlomis rotata Gel Plasters with Uniform Design and Dynamic Optimization Method

WANG Sen1，OU Shuiping2，YUAN Tao3（1.School of Pharmacy，Zunyi Medical College，Guizhou Zunyi 563003，China；2.Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Guizhou Zunyi 563003，China；3.Jiangxi Qinfeng Pharmaceutical Co.Ltd.，Jiangxi Ganzhou 341008，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of Compound Lamiophlomis rotata gel plasters.METHODS：With the yield of extractum，the extract rate and purity（sum of contents of 5 marker components/extract rate）of 5 marker components（loganin acid，shanzhiside methyl ester，gentiopicroside，8-O-acetyl shanzhiside methyl ester，2′，4′-dihydroxychalcone）as indexes，with ethanol amount，ethanol concentration and extraction time as factors，uniform design（UD）was used to optimize technology parameters.Then dynamic optimization extraction method（DOEM）was employed to further optimize extraction time.RESULTS：The optimum extraction conditions of UD were as follows as 8-fold 90%ethanol，extracting 2 times，1 h each time.The yield of extractum was 24.37%，and the extract rate of 5 marker components were 0.10%，0.51%，1.65%，0.74%and 0.19%，respectively；the purity of them was 13.11%.The extraction time was reduced to 40 times at first time and 30 times at second time by DOEM；the extract rates of 5 marker components were 0.10%，0.52%，1.78%，0.75%and 0.31%，respectively；the purity of them was 14.08%.CONCLUSIONS：The optimum extraction conditions of UD are reasonable and stable.DOEM can significantly reduce extraction time，consumption and production costs.

Lamiophlomis rotate；Gel plasters；Yield of extractum；Marker components；Uniform design；Dynamic optimization method

R283.6

A

1001-0408（2016）31-4439-04

2016-01-21

2016-09-13）

＊副教授，博士。研究方向：中藥新劑型新制劑。電話：0851-28642515。E-mail：wangsen912912@126.com

#通信作者：副主任藥師，博士。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：0851-28608517。E-mail：oushuiping1208@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.35