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    萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球的制備及其體外釋藥特性和抑菌作用研究

    2016-12-15 08:03:56黃義新首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科北京100038
    中國(guó)藥房 2016年31期
    關(guān)鍵詞:釋藥萬(wàn)古霉素藥量

    劉 煒,劉 菊,黃義新(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科,北京 100038)

    萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球的制備及其體外釋藥特性和抑菌作用研究

    劉 煒*,劉 菊,黃義新(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科,北京 100038)

    目的:制備萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球,考察其體外釋藥特性和抑菌作用。方法:采用乳化交聯(lián)法制備萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球,觀察微球的粒徑分布及形態(tài);應(yīng)用紫外分光光度法測(cè)定微球藥物含量,計(jì)算載藥量及包封率;通過(guò)體外釋放試驗(yàn),比較其與鹽酸萬(wàn)古霉素24 h內(nèi)的體外釋藥情況,考察其7 d內(nèi)的累積釋放度(Q);通過(guò)體外抑菌試驗(yàn)觀察其作用20 d對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的影響。結(jié)果:所制萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球呈圓球形,表面圓整,無(wú)明顯凹凸和孔隙,平均粒徑為(165.6±19.7)μm,平均載藥量為(32.6±3.2)%,平均包封率為(53.8±6.3)%,Q7d為82.7%;其與鹽酸萬(wàn)古霉素的Q2h分別為18.6%、91.3%;其作用1 d時(shí)的抑菌圈直徑>3 cm,隨其作用時(shí)間的延長(zhǎng),抑菌圈直徑逐漸縮小。結(jié)論:成功制得萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球,其體外緩釋效果明顯,且具有良好的體外抑菌作用。

    萬(wàn)古霉素;殼聚糖;微球;體外釋藥;體外抑菌

    臨床修復(fù)骨損傷的過(guò)程中,常發(fā)生細(xì)菌感染難以控制的難題,常規(guī)靜脈滴注抗生素治療難以在局部產(chǎn)生高濃度的抗生素,無(wú)法達(dá)到理想的治療效果。因此,近年來(lái)抗生素局部緩釋系統(tǒng)在骨感染中的應(yīng)用逐漸發(fā)展,該系統(tǒng)可以控制藥物在局部釋放,又能發(fā)揮良好抗菌活性[1-2]。微球作為緩控釋藥物載體應(yīng)用廣泛,其制備方法簡(jiǎn)便,適用于不同部位的給藥,可用于注射、黏膜吸附或口服等不同給藥方式,因此被廣泛應(yīng)用于載藥緩釋系統(tǒng)[3-4]。萬(wàn)古霉素是骨科應(yīng)用較廣的抗生素,細(xì)胞毒性較低,主要針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌,對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌抑制效果顯著[5]。本研究應(yīng)用殼聚糖微球良好的緩控釋載體性能,制備萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球,并探討其載藥性能、體外釋放性能和體外抑菌性能,旨在為骨修復(fù)過(guò)程中的局部載藥緩釋系統(tǒng)的應(yīng)用提供依據(jù)。

    1 材料

    1.1 儀器

    JEM-200CX透射電子顯微鏡(日本日立公司);Lambda 650紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)鉑金埃爾默);Zetasizer-3000激光粒度分布測(cè)量?jī)x(英國(guó)Malvern公司)。

    1.2 藥品與試劑

    注射用鹽酸萬(wàn)古霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):150607,規(guī)格:每支500 mg);殼聚糖(上海銳谷生物科技有限公司,分析純);25%戊二醛、三氯甲烷、乙醇、NaOH等均為分析純。

    1.3 細(xì)菌

    金黃色葡萄球菌(ATCC 25923),購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球的制備

    采用水/油乳化交聯(lián)法制備萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球。將殼聚糖分散于稀乙酸水溶液中,溶脹12 h后制成0.2%的殼聚糖溶液,取適量鹽酸萬(wàn)古霉素溶入殼聚糖溶液,邊攪拌邊將0.4%戊二醛稀溶液5 ml緩慢加入殼聚糖溶液中,繼續(xù)攪拌10 min;加入液體石蠟和乳化劑油酸山梨坦,攪拌1 h后緩慢加入交聯(lián)劑25%戊二醛溶液4 ml,40℃攪拌;加適量的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至微堿性,過(guò)濾后依次用三氯甲烷、乙醇溶液洗滌脫水,真空干燥器中干燥,制得萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球。

    2.2 微球的粒徑分布與形態(tài)觀察

    將萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球粉末均勻分散地黏附于導(dǎo)電膠上,觀測(cè)前噴金,在透射電子顯微鏡下觀察微球的形態(tài)結(jié)構(gòu)。取2 ml萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球混懸液,置于激光粒度分布測(cè)量?jī)x中分析微球的粒徑分布。結(jié)果顯示,萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球形貌較好,大致呈圓球形,表面光滑圓整,無(wú)凹凸和孔隙,粒徑分布均勻,粒徑分布在200 nm左右,平均粒徑為(165.6±19.7)nm(n=3)。萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球電鏡掃描圖見(jiàn)圖1。

    圖1 萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球的電鏡掃描圖(×200)Fig 1 TEM of vancomycin-loaded chitosan sustained-release microspheres(×200)

    2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

    稱(chēng)取鹽酸萬(wàn)古霉素和空白殼聚糖緩釋微球在200~800 nm全波段行紫外掃描。結(jié)果顯示,萬(wàn)古霉素在280 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰,且空白殼聚糖緩釋微球在此波長(zhǎng)下不干擾測(cè)定,故選用280 nm作為萬(wàn)古霉素的檢測(cè)波長(zhǎng),光譜圖見(jiàn)圖2。

    圖2 紫外吸收光譜圖Fig 2 UV spectrums

    2.4 微球中萬(wàn)古霉素的含量測(cè)定

    精密稱(chēng)取鹽酸萬(wàn)古霉素100 mg溶解于HCl溶液中,置于100 ml量瓶中定容,制成1 mg/ml的對(duì)照品溶液;然后將對(duì)照品溶液稀釋制成系列梯度濃度的萬(wàn)古霉素溶液,于280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各濃度溶液的吸光度(A)。以A值對(duì)質(zhì)量濃度(c)進(jìn)行線性回歸分析,得回歸方程為A=2.967 2c+0.003 2(r2=0.999 6)。萬(wàn)古霉素檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為10~500 μg/ml。

    2.5 微球載藥量和包封率的測(cè)定

    將萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球溶解于HCl溶液中,于280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定萬(wàn)古霉素的吸光度,根據(jù)回歸方程計(jì)算萬(wàn)古霉素的含量。按公式計(jì)算包封率與載藥量,包封率(%)=微球中藥物質(zhì)量/藥物的投藥量×100%;載藥量(%)=微球中藥物質(zhì)量/微球的質(zhì)量×100%。結(jié)果顯示,萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球的載藥量為(32.6±3.2)%,包封率為(53.8±6.3)%(n=3)。

    2.6 體外釋放試驗(yàn)

    稱(chēng)取定量的萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球和鹽酸萬(wàn)古霉素對(duì)照品,置于截留分子質(zhì)量為8 000~10 000 Da的透析袋內(nèi),以釋放介質(zhì)為pH 7.4的磷酸鹽緩沖液、轉(zhuǎn)速為100 r/min,于37℃恒溫水浴中振搖。分別于1、2、4、6、8、12、16、24 h取樣1 ml,并立即補(bǔ)加等量的釋放介質(zhì)1 ml,在280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定取樣液的吸光度。根據(jù)回歸方程計(jì)算萬(wàn)古霉素的濃度,再計(jì)算累積釋放度(Q),繪制釋放曲線,結(jié)果見(jiàn)圖3。

    圖3 萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球和鹽酸萬(wàn)古霉素24 h內(nèi)的累積釋藥曲線Fig 3 Accumulative release curves of vancomycin-loaded chitosan sustained-release microspheres and vancomycin hydrochloride within 24 h

    由圖3顯示,萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球的Q1h為13.2%,Q2h為18.6%,Q4h為29.5%,Q12h為42.3%,Q24h為47.6%;鹽酸萬(wàn)古霉素的Q1h為82.1%,Q2h為91.3%,Q4h為98.7%。通過(guò)對(duì)二者的體外累積釋放度的比較,發(fā)現(xiàn)萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球能減緩萬(wàn)古霉素的體外釋放。同法測(cè)定萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球7 d內(nèi)的體外釋放情況,結(jié)果顯示,其Q7d為82.7%,表明萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球具有較好的緩釋作用。萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球7 d內(nèi)的累積釋藥曲線見(jiàn)圖4。

    圖4 萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球7 d內(nèi)的累積釋藥曲線Fig 4 Accumulative release curve of vancomycin-loaded chitosan sustained-release microspheres within 7 d

    2.7 體外抑菌試驗(yàn)

    將平行3組萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球材料滴入含金黃色葡萄球菌的瓊脂固體培養(yǎng)基中,37℃恒溫培養(yǎng)24 h,測(cè)量抑菌圈直徑。將微球材料置于新的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基中培養(yǎng),每隔24 h重復(fù)此操作,共測(cè)量抑菌圈20 d,繪制抑菌圈直徑-時(shí)間曲線。結(jié)果顯示,萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球?qū)瘘S色葡萄球菌具有持續(xù)抑菌作用,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),抑菌圈逐漸縮小。萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球?qū)瘘S色葡萄球菌的體外抑菌圈直徑-時(shí)間曲線見(jiàn)圖5。

    圖5 萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球?qū)瘘S色葡萄球菌的體外抑菌圈直徑-時(shí)間曲線Fig 5 The diameter of inhibition zone-time curve in vitro of vancomycin-loaded chitosan sustained-release microspher-es to S.aureus

    3 討論

    開(kāi)放性骨折或感染性骨缺損,常因?yàn)榇嬖诟腥疽蛩兀哟罅酥委熾y度[6]。常規(guī)口服或靜脈給予抗生素治療,由于藥物劑量大,易引發(fā)不良反應(yīng),且局部治療效果較差。而采用藥物緩控釋技術(shù)可以降低藥物的毒副作用,減少用藥次數(shù),避免耐藥性的產(chǎn)生。

    理想的抗生素緩釋載體材料,應(yīng)具有一定的載藥量,釋藥速度平穩(wěn);不但能夠有效釋放抗生素以控制感染,且能實(shí)現(xiàn)局部給藥增強(qiáng)藥物的療效,有效避免全身給藥產(chǎn)生的不利影響[7-10]。殼聚糖是一種天然高分子生物材料,以其良好的生物相容性和可降解特性,被廣泛應(yīng)用于基因、藥物載體載體[9-10]。

    本實(shí)驗(yàn)以殼聚糖作為緩釋載體、戊二醛為交聯(lián)劑,采用乳化交聯(lián)法制備萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球,經(jīng)測(cè)量載藥量為(32.6±3.2)%,包封率為(53.8±6.3)%。推測(cè)萬(wàn)古霉素在微球中的載藥機(jī)制為:萬(wàn)古霉素與殼聚糖分子中均含有氨基,戊二醛作為交聯(lián)劑可以和氨基發(fā)生反應(yīng)。在微球制備初期殼聚糖形成少量交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),將萬(wàn)古霉素分子包裹其中。當(dāng)水相和油相混合之后能有效減少萬(wàn)古霉素的分散,從而提高微球交聯(lián)度和萬(wàn)古霉素的交聯(lián)密度,增加復(fù)合微球的載藥性能[11-12]。

    萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球在釋放介質(zhì)中開(kāi)始時(shí)釋放較快,Q4h為29.5%,之后釋放平穩(wěn)。其機(jī)制在于鹽酸萬(wàn)古霉素分子中含有親水性羥基,呈水溶性,可以與水分子以氧鍵結(jié)合,能很快地?cái)U(kuò)散在溶液中[13]。由緩釋微球和單藥萬(wàn)古霉素的釋放對(duì)比曲線可以看出,載藥微球能顯著抑制萬(wàn)古霉素的突釋?zhuān)苊馑查g局部產(chǎn)生高藥物濃度。綜上所述,萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球在體外顯示了良好的緩釋作用和抑菌活性,可為其在骨感染治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。

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    (編輯:鄒麗娟)

    Preparation of Vancomycin-loaded Chitosan Sustained-release Microspheres and Its Drug Release in vitro and Antibacterial Effect

    LIU Wei,LIU Ju,HUANG Yixin(Dept.of Pharmacy,Beijing Shijitan Hospital,Capital Medical University,Beijing 100038,China)

    OBJECTIVE:To prepare vancomycin-loaded chitosan sustained-release microspheres and to study its drug release and antibacterial effects in vitro.METHODS:The emulsion cross-linking was used to prepare vancomycin-loaded chitosan sustainedrelease microspheres,and the particle size and morphology of microspheres were observed.The contents of vancomycin in microspheres was determined by UV spectrophotometry,and drug-loading amount of entrapment efficiency were calculated.Drug release of prepared microspheres and vancomycin hydrochloride within 24 h were compared by release trial in vitro,and then its accumulative release rate(Q)within 7 d was investigated.The effects of prepared microspheres on the diameter of inhibition zone to Staphylococcus aureus after treated for 20 d were observed through in vitro antibacterial test.RESULTS:The microspheres were spherical and complete round without obvious bump and pore.The average particle size of the microspheres was(165.6±19.7) μm;average drug-loading amount was(32.6±3.2)%;average encapsulation efficiency was(53.8±6.3)%;Q7dwas 82.7%.Q2hof prepared microspheres and vancomycin hydrochloride were 18.6%and 91.3%.The diameter of inhibition zone was higher than 3 cm after treated for 1 d,and then decreased gradually as time.CONCLUSIONS:Vancomycin-loaded chitosan sustained-release microspheres can be prepared successfully,and show obvious in vitro sustained-release effect and antibacterial effects.

    Vancomycin;Chitosan;Microsphere;Release in vitro;Antibacterial effect in vitro

    R943

    A

    1001-0408(2016)31-4443-03

    2016-03-21

    2016-06-20)

    *副主任藥師,碩士。研究方向:藥物制劑、臨床藥學(xué)。電話:010-63926411。E-mail:liuwei8090@126.com

    DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.36

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