單克隆抗體藥物糖基化修飾分析研究進展

叢宇婷, 胡良海

(吉林大學生命科學學院, 吉林 長春 130012)

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單克隆抗體藥物糖基化修飾分析研究進展

叢宇婷, 胡良海*

(吉林大學生命科學學院, 吉林 長春 130012)

單克隆抗體藥物是一類以免疫球蛋白G的結(jié)構(gòu)為基礎的大分子糖蛋白藥物,為癌癥、自身免疫疾病以及病毒感染等多種疾病的治療提供了全新的途徑。單抗藥物的糖基化修飾類型及水平對其穩(wěn)定性、清除率、免疫原性、抗體依賴細胞毒性及補體依賴細胞毒性等都有一定的影響。單抗藥物的迅速發(fā)展及其在多種疾病治療中日益凸顯的重要性都對單抗藥物的研發(fā)及用藥安全等方面提出了更高的要求。因此,建立規(guī)范可靠的單抗藥物糖基化修飾分析方法有著十分重要的意義。該綜述將簡要介紹單克隆抗體藥物糖基化修飾及相關的定性、定量分析方法。

單克隆抗體藥物;糖基化修飾;質(zhì)譜;蛋白質(zhì)組學;綜述

圖 1 單抗藥物分子結(jié)構(gòu)及其糖基化修飾示意圖Fig. 1 (a) General structure of therapeutic monoclonal antibodies and (b) the diagram of glycosylation of therapeutic monoclonal antibodies IgG: immunoglobulin G; mAb: therapeutic monoclonal antibody; VH: variable domain of heavy chain; VL: variable domain of light chain; CH1, CH2, and CH3: constant domains of heavy chain; CL: constant domain of light chain; CDR: complementarity determining regions; Fab: fragment antigen binding part; Fc: fragment crystallizable part; ADCC: antibody-dependent cellular cytotoxicity; CDC: complement-dependent cytotoxicity; G0F: GlcNAc4Man3Fuc1; G1F: GlcNAc4Man3Gal1Fuc1; G2F: GlcNAc4Man3Gal2Fuc1; A-fuc: GlcNAc4Man3Gal1.

1 單克隆抗體藥物及其糖基化修飾簡介

單克隆抗體藥物(therapeutic monoclonal antibody,mAb;以下簡稱單抗藥物)是一類以γ型免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)為結(jié)構(gòu)基礎的大分子蛋白類藥物,結(jié)構(gòu)如圖1a所示。1975年,Kohler和Milstein[1]證明,骨髓瘤細胞與經(jīng)抗原免疫的動物脾細胞融合,形成的融合細胞能分泌針對該抗原的均一、高特異性的抗體——單克隆抗體,這種技術稱為雜交瘤技術[1-3],這一發(fā)現(xiàn)實現(xiàn)了一個世紀前Ehrlich提出的通過抗體靶向治療腫瘤的設想[4]。隨著雜交瘤技術的發(fā)展,第一支單抗藥物——莫羅單抗(muromomab)于1986年由美國食品和藥品管理局(United States Food and Drug Administration,FDA)批準上市[1],從此,單抗藥物逐漸走入人們視野并得到了越來越多的關注。作為最重要的生物藥物之一,單抗藥物為多種疾病的治療提供了全新的途徑,包括心血管疾病、中樞神經(jīng)紊亂、自身免疫疾病、病毒感染以及癌癥等[4-11]。最初的單抗藥物為鼠源單抗,該類型單抗藥物具有典型的免疫原性且不易誘導免疫效應反應,因此限制了它們的臨床應用。隨著抗體工程的發(fā)展,嵌合單抗以及人源化單抗相繼問世,最終B淋巴細胞cDNA庫和噬菌體展示技術的發(fā)展使完全人源單抗成為可能,第一支完全人源單抗——阿達木單抗(adalimumab)已成功研制并于2002年由FDA批準上市[12]。完全人源單抗具有良好的功效,并且無副作用,已成為當前發(fā)展最迅速的一類單抗藥物。目前,已有超過50種單抗藥物由FDA和歐盟醫(yī)藥產(chǎn)品管理機構(gòu)(European Medicine Agency,EMA)批準上市,還有四十余種單抗藥物處于臨床Ⅲ期研究階段[13]。根據(jù)Ecker等[14]的推測,預計以每年批準4支單抗藥物上市的速度,到2020年將有大約70支單抗藥物投入市場使用,全球市場銷售額將達1 250億美元。

作為復雜的大分子糖蛋白藥物,單抗藥物兩條重鏈的Fc片段上297位的天冬氨酸(依據(jù)Kabat編號)上具有一個高度保守的N-糖基化修飾位點[15]。有趣的是,盡管單抗藥物的輕鏈與重鏈的氨基酸序列是對稱的,但是Fc片段上N-糖基化修飾有些是對稱的而有些則不是[16]。單抗藥物的N-糖基化修飾通常是復雜的雙天線糖鏈結(jié)構(gòu),可能發(fā)生巖藻糖化和唾液酸化。許多單抗藥物的糖型中高甘露糖型處于較低的水平,這同樣也發(fā)生在人免疫球蛋白上。人免疫球蛋白中也經(jīng)常存在平分型N-乙酰葡糖胺。此外,20%～30%的人免疫球蛋白及個別單抗藥物在Fab(fragment antigen binding part)片段上也存在N-糖基化修飾位點,比如西妥昔單抗(cetuximab)重鏈的第88位天冬氨酸[17]。已發(fā)現(xiàn)一些單抗藥物存在O-糖基化修飾,如在通過畢赤酵母生產(chǎn)的單抗藥物中發(fā)現(xiàn)存在單獨一個甘露糖修飾的O-糖基化修飾[18];由中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細胞生產(chǎn)的某人源化單抗藥物存在單獨一個葡萄糖修飾的O-糖基化修飾[19]。單抗藥物的糖基化修飾與單抗藥物的生產(chǎn)系統(tǒng)、選擇的細胞系種類以及孵育過程密切相關[20]。目前最常用的細胞孵育體系是哺乳動物細胞,包括CHO細胞、鼠NS0細胞、鼠Sp2/0細胞和鼠雜交瘤細胞等[20-22]。其中CHO細胞系生產(chǎn)出的單抗藥物的糖基化修飾最接近人IgG的糖基化修飾情況,而鼠NS0或Sp2/0細胞生產(chǎn)出的單抗藥物的糖基化修飾情況則相對不同。例如通過鼠NS0或Sp2/0細胞生產(chǎn)出的單抗藥物糖基化修飾通常存在少量的非人源化α-1,3-半乳糖修飾以及大量的非人源化N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(N-glycolyl neuraminic acid,NGNA)唾液酸結(jié)構(gòu),而這些糖基化修飾在人體內(nèi)易引起免疫原性[23-26]。此外,大腸桿菌被用于非糖基化修飾的Fab片段的生產(chǎn)[20]。而酵母、真菌、昆蟲細胞和植物等生產(chǎn)體系則由于受到產(chǎn)生糖基化修飾的限制而仍未得到廣泛應用[20,27]。大量研究表明單抗藥物的N-糖基化修飾對其穩(wěn)定性、清除率、免疫原性、抗體依賴細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity,ADCC)及補體依賴細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity,CDC)等都有一定的影響[28]。例如,缺少核心巖藻糖的糖型能夠增強對FcγRⅢa受體的親和力,從而提高ADCC[29];而高水平的唾液酸化的糖型則會減少對FcγRⅢa受體的親和力,從而降低ADCC[30];此外,高甘露糖型會降低血漿半衰期,提高免疫原性以及提高ADCC[30]。圖1b中列舉了一些糖型影響單抗藥物理化特性的實例。

單抗藥物的迅速發(fā)展及其在多種疾病治療中日益凸顯的重要性都對單抗藥物的研發(fā)及用藥安全等方面提出了更高的要求。此外,FDA于2012年頒布了《生物仿制產(chǎn)品開發(fā)的指導意見草案》,給出了單抗藥物的評價標準,并明確指出對于單抗藥物這種大分子蛋白類藥物要對能夠影響其有效性及安全性的初級或二級結(jié)構(gòu)進行評價,如N-糖型的表征[31]。因此,對單抗藥物糖基化修飾的定性、定量研究對藥物研發(fā)、改進以及安全用藥等都具有十分重要的意義。本綜述將簡要介紹單抗藥物糖基化修飾的分析研究進展。

2 單抗藥物糖基化修飾分析方法

對單抗藥物糖基化修飾的定性和定量研究已在各個層次上展開,包括在完整蛋白質(zhì)水平、蛋白片段、糖肽以及糖鏈水平進行定性和定量表征。常用的技術手段包括毛細管電泳技術(capillary electrophoresis,CE)[32]、高效液相色譜技術(high-performance liquid chromatography,HPLC)[33,34]、電噴霧質(zhì)譜技術(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)[33,35]及傅里葉離子回旋共振質(zhì)譜技術(Fourier ion cyclotron resonance mass spectrometry,FT-ICR-MS)[36]等。本節(jié)將簡要介紹各個層次上單抗藥物糖基化修飾分析的常用方法及研究現(xiàn)狀。

2.1 完整蛋白質(zhì)水平的MS分析和CE分析

ESI-MS偶聯(lián)HPLC或者尺寸排阻色譜(size-exclusion chromatography, SEC)技術常用于完整蛋白質(zhì)層次的單抗糖基化修飾的表征[37]。HPLC-MS對蛋白質(zhì)具有較好的分離能力,但常伴有吸附性強、形成多峰等問題,可以通過色譜柱材料選擇、流動相調(diào)節(jié)和升高柱溫等方式進行改進[38-40]。SEC相對簡單,只需在室溫條件下進行分離[41,42],但分離度和柱效較低,并且同樣存在蛋白質(zhì)吸附等問題。ESI-MS通常具有較高的分辨率及質(zhì)量精度,在單抗糖基化修飾的表征研究中發(fā)揮了重要作用,已成功用于多種單抗藥物糖基化修飾的表征。FT-ICR-MS由于其極高的分辨率(>106)和質(zhì)量精度(<1 ppm(1×10-6))而被越來越多地用于完整蛋白質(zhì)水平的單抗糖基化修飾分析[36],但是操作復雜、價格高昂等不足使其仍未得到廣泛應用。2000年,Makarov等[43]發(fā)展了一種通過離子圍繞中心電極的軌道旋轉(zhuǎn)而捕獲離子的裝置—靜電場軌道阱(orbitrap)質(zhì)量分析器。隨后Thermo公司推出了系列Orbitrap質(zhì)譜,除了具有高達5×105的分辨率、高質(zhì)量精度(<1 ppm)等優(yōu)點外,它的完整蛋白質(zhì)模式能提供對完整蛋白質(zhì)的靈敏、準確的分析,對于50 kDa內(nèi)的蛋白質(zhì)能實現(xiàn)同位素分辨,是分析完整蛋白質(zhì)水平的糖基化修飾的強有力工具。此外,基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜技術(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)可用于完整蛋白質(zhì)糖基化的快速分析,但是由于較低的分辨率使其更適合于相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)而在完整單抗水平的糖基化分析中不具備優(yōu)勢。為了提高質(zhì)譜分析的靈敏度,可以通過酶輔助手段在單抗片段層次進行糖基化表征。這種基于middle-up策略的糖基化表征通常結(jié)合蛋白質(zhì)還原和酶解手段生成Fab、Fc(fragment crystallizable part)、Fc/2、重鏈和輕鏈等蛋白質(zhì)片段。常用的還原試劑包括二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)、三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)、β-巰基乙醇(β-ME)和巰基乙胺(mercaptoethylamine,MEA)等,常用的酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、IdeS和IdeZ等。Sinha等[16]的研究表明,與完整單抗水平的糖基化修飾分析結(jié)果相比,單抗片段水平的糖基化修飾分析能夠獲得更多的糖基化修飾信息,具有更高的靈敏度。

CE-MS技術也常被用于糖基化修飾的分析中[44-46]。此外,蛋白水平的唾液酸化分析也可通過基于電荷差異的電泳策略實現(xiàn),包括等電聚焦電泳技術(isoelectric focusing electrophoresis, IEF)[44,47]、CE技術[48]及離子交換色譜技術(ion-exchange chromatography, IEX)[46,49]等。這些方法通常被用于蛋白藥物的質(zhì)量控制監(jiān)測中[50],不過傳統(tǒng)的IEF和IEX方法不能和質(zhì)譜技術兼容且耗時,而CE技術因其快速、高分辨率、低樣本量以及能與質(zhì)譜兼容等優(yōu)勢而更適用于蛋白藥物糖基化修飾的表征研究[51]。

2.2 糖鏈水平的分析

N-糖基化修飾的糖鏈可以通過酶切作用或者化學方法從糖蛋白上釋放出來,最常用的是通過肽糖苷酶F(peptide-N-glycosidase F,PNGase F)或肽糖苷酶A(peptide-N-glycosidase A,PNGase A)酶切作用,或者肼解作用釋放糖鏈。O-糖鏈的釋放通常采用化學方法,包括肼解法[52]、β-消除法[53]和三氟甲磺酸法[54]等。釋放的糖鏈可以利用MALDI-TOF MS技術進行簡單、方便的快速定性、定量分析,但是唾液酸化糖鏈易被破壞,使其難以表征,因此有研究通過將糖鏈甲基化實現(xiàn)了提高離子化效率、同時保護唾液酸化糖鏈的目的[37,55,56]。HPLC方法常用于對糖鏈的定性、定量分析,因為糖鏈的紫外吸收較弱,通常會在分析前對糖鏈進行熒光標記以提高檢測靈敏度,2-氨基苯甲酰胺(2-aminobenzamide,2-AB)和2-氨基苯甲酸(2-aminobenzoic acid,2-AA)是最常用的熒光標記試劑。標記后的糖鏈可以通過親水作用色譜(hydrophilic interaction chromatography,HILIC)、反向高效液相色譜、陰離子交換色譜(anion-exchange chromatography,AEC)以及CE等技術進行分析[57]。而釋放的糖鏈也可以不進行熒光標記直接通過高效陰離子交換色譜結(jié)合脈沖安培檢測技術或者熱裂解色譜技術進行分析[58,59],但是方法的穩(wěn)定性及重現(xiàn)性較差[59]。最近的一項研究通過7種正交方法(包括HILIC、CE、高效陰離子交換色譜結(jié)合脈沖安培檢測法(high-performance anionic exchange chromatography-air pulsing ampere detectors,HPAEC-PAD)等)在糖鏈水平對單抗的糖基化修飾進行了分析,7種方法的分析結(jié)果基本一致[15]。通過和質(zhì)譜技術的聯(lián)用,上述方法不僅可用于糖基化的定性和定量分析,同樣適用于對未知糖型的表征,但是解析過程卻相對繁瑣且成本較高。隨著質(zhì)譜技術的發(fā)展,高分辨質(zhì)譜在糖鏈結(jié)構(gòu)的解析方面為我們提供了一種更簡單、快速、靈敏度的方法[60-62]。但是糖鏈的同分異構(gòu)體及三維結(jié)構(gòu)則需通過核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)技術和X射線晶體學(X-ray crystallography)進行分析[63,64]。

2.3 糖肽水平的分析

糖肽水平的蛋白質(zhì)糖基化修飾位點鑒定及糖基化修飾情況分析通常是通過ESI-MS技術或MALDI-TOF MS技術完成的[65],而ESI-MS是進行糖肽表征最有力的工具。通過MS/MS譜圖可以獲取大量糖鏈信息,結(jié)合糖肽分析軟件可以簡單、高效地完成糖基化位點鑒定及糖鏈組成的確定。目前有許多免費的糖肽分析軟件可以使用,包括GlycoMod[66]、GlycoPep DB[67]、GlycoMiner[68]和ArMone[69]等。

基于MRM策略的糖肽水平定量分析也展現(xiàn)出了強大的優(yōu)勢。Toyama等[70]建立了一種通過“能量依賴型”氧鎓離子監(jiān)測模式對單抗藥物的N-糖型進行定量表征的方法,系統(tǒng)地研究了質(zhì)譜能量與N-糖鏈氧鎓離子碎裂情況之間的關系,實現(xiàn)了對N-糖鏈的定量表征,糖肽的檢測下限為30 amol,線性范圍達4個數(shù)量級,并可區(qū)分糖鏈的同分異構(gòu)體。該研究為單抗藥物N-糖型的定量研究提供了一個新思路。Hong等[71]建立了一種利用MRM策略同時對IgG蛋白質(zhì)及其N-糖型進行絕對定量的方法。該方法中IgG蛋白質(zhì)的檢測下限為60 amol,檢測動態(tài)范圍達3個數(shù)量級。對IgG蛋白質(zhì)進行絕對定量的同時,可在不經(jīng)過富集的情況下直接對血清中26種高豐度N-糖肽進行測定。實現(xiàn)了對IgG蛋白質(zhì)及N-糖型的同時測定?？蓞⒖荚摲椒▽ι锘|(zhì)中的單抗及其N-糖型的定量分析。Yang等[72]通過MRM方法對6種單抗藥物的糖基化修飾進行了定量研究,并同時考察了單抗藥物糖基化修飾的位點占有率。該方法快速、高效,具有良好的特異性,為單抗藥物糖基化修飾的定量研究、藥物研發(fā)及質(zhì)量監(jiān)控提供了新途徑。

在糖肽水平的定量分析過程中,一方面由于糖肽豐度往往遠低于普通肽段,另一方面則由于糖肽的離子化易受共洗脫物的抑制,尤其在復雜樣品中抑制效應更顯著,因此常輔以分離富集策略以排除干擾、提高檢測靈敏度。常見的糖肽分離富集方法包括酰肼化學法(hydrazide chemistry)[73]、凝集素親和色譜法(lectin affinity chromatography, LAC)[74]、HILIC[75]等。酰肼化學法的原理是利用高碘酸鈉氧化糖鏈上的順式鄰位二羥基生成醛基,而酰肼基團可以與醛基發(fā)生化學鍵合,從而富集出糖肽[76]。該方法特異性好,但是會不可逆地破壞糖鏈結(jié)構(gòu),因此不適合用于糖鏈的結(jié)構(gòu)解析及定量研究。LAC的原理是利用植物或動物細胞合成并分泌的凝集素能與特定的糖單元結(jié)合的特點富集糖肽[75],最早被用于糖基化富集研究中。如伴刀豆凝集素(concanavalin A,Con A)能特異性地富集甘露糖,麥胚凝集素(wheat germ agglutinin,WGA)能特異性地富集N-乙酰葡糖胺。該方法的缺點在于,凝集素具有選擇性,只能富集特定種類的糖,不適用于糖基化修飾的廣譜性富集,并且凝集素與糖鏈之間的相互作用較弱,因此富集效率較低。HILIC的原理是以水-水溶性有機溶劑的混合物為流動相,親水作用材料表面吸附水分子形成富水層,分析物中的親水成分會濃縮在所形成的富水層中,疏水成分則留在高含量有機溶劑的流動相中[77]。糖肽相對于非糖肽具有更強的親水性,容易被保留在親水富集材料上,達到富集的目的。該方法對所有糖鏈都有富集作用,并且不會破壞糖鏈結(jié)構(gòu),而且隨著該技術的不斷發(fā)展,方法特異性也不斷提高,因此是用于糖基化定量研究的較好選擇[78]。

3 結(jié)論與展望

單抗藥物是當前發(fā)展最為迅速的蛋白類藥物之一,作為大分子糖蛋白藥物,單抗藥物的糖基化修飾對其穩(wěn)定性、有效性和安全性等各方面均有不同程度的影響,因此對其糖基化修飾進行全面表征具有十分重要的意義。這就需要及時建立高效、快速、可靠的糖基化修飾定性、定量分析方法。而糖基化修飾本身的復雜性以及對糖基化修飾檢測的難度,給相關研究帶來了巨大的挑戰(zhàn)。盡管對單抗藥物糖基化修飾的定量研究已在各個層次上展開并且在快速發(fā)展,但仍存在一些問題,如糖肽富集的回收率和重復性、樣品處理的通量、方法靈敏度、數(shù)據(jù)分析處理流程的簡化、標準化流程的建立等,這有待于分析化學家發(fā)展新的方法和技術,為單抗藥物的研究提供高效可靠的分析手段。

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Recent advances on the analysis of glycosylation of therapeutic monoclonal antibodies

CONG Yuting, HU Lianghai*

(SchoolofLifeSciences,JilinUniversity,Changchun130012,China)

Therapeutic monoclonal antibodies are the variants of immunoglobulin G, most commonly based on human or mouse immunoglobulin G. They provide a new platform to treat a wide range of diseases, such as cancers, inflammatory diseases and virus infection. A lot of studies demonstrated thatN-glycosylation of therapeutic monoclonal antibodies has effects on their stability, solubility, and clearance as well as immunogenicity, antibody-dependent cellular cytotoxicity and complement-dependent cytotoxicity. The fast development and increasing importance of their therapeutic action highlight the importance of drug research and medication security. Therefore, it has great significance to establish reliable qualitative and quantitative analytical methods of glycosylation of therapeutic monoclonal antibodies. This review introduces the glycosylation of therapeutic monoclonal antibodies and the method developments for qualitative and quantitative analyses of their glycosylation.

therapeutic monoclonal antibody (mAb); glycosylation; mass spectrometry (MS); proteomics; review

10.3724/SP.J.1123.2016.08035

2016-08-29

國家自然科學基金項目(81373374).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 81373374).

O658

A

1000-8713(2016)12-1186-06

鄒漢法研究員紀念專輯(上)·專論與綜述

* 通訊聯(lián)系人.E-mail:lianghaihu@jlu.edu.cn.