S1P4受體通過Akt調(diào)節(jié)骨髓瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

楊融輝,石小巖,傅 迪,仲 媛,鄭金科,廖愛軍

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S1P4受體通過Akt調(diào)節(jié)骨髓瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

楊融輝,石小巖,傅 迪,仲 媛,鄭金科,廖愛軍*

目的 探討S1P受體對(duì)多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞系LP-1生存及凋亡的影響及調(diào)控機(jī)制。方法 應(yīng)用芬戈莫德(FTY720)抑制LP-1細(xì)胞S1P受體，CCK-8法測定細(xì)胞生存率，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。應(yīng)用qRT-PCR方法檢測LP-1細(xì)胞中S1P受體的表達(dá)情況。應(yīng)用 S1P4R-shRNA敲除S1P4受體，采用熒光顯微鏡及qRT-PCR法測定病毒感染率及感染后S1P4受體表達(dá)。Western blot方法檢測S1P4受體敲除后抗凋亡蛋白Akt、Survivin、Birc4、Bag-1表達(dá)情況。結(jié)果 FTY720處理后，LP-1細(xì)胞生存率明顯下降，凋亡率明顯上升，與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LP-1細(xì)胞中S1P4受體呈高表達(dá)，敲除S1P4受體后，抗凋亡蛋白Akt、Survivin、Birc4、Bag-1表達(dá)明顯下降(P<0.05)。結(jié)論 S1P受體對(duì)LP-1細(xì)胞生存具有重要作用。其中S1P4受體在LP-1細(xì)胞凋亡中起主要作用。S1P4受體可通過Akt調(diào)節(jié)下游抗凋亡蛋白Survivin、Birc4、Bag-1的表達(dá)，從而影響LP-1細(xì)胞凋亡。

S1P4受體;多發(fā)性骨髓瘤；Akt；凋亡

0 引言

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是漿細(xì)胞異常增殖的惡性腫瘤，隨著治療藥物的逐漸增多，MM療效較前明顯改善，但目前仍無法治愈[1-2]。筆者前期研究證實(shí)，1-磷酸鞘氨醇(S1P)受體抑制劑芬戈莫德(FTY720)可誘導(dǎo)MM細(xì)胞系U266產(chǎn)生凋亡及自噬[3]，而 Pi3k/Akt/mTOR通路對(duì)細(xì)胞凋亡及自噬均具有調(diào)節(jié)作用，已成為MM靶向藥物研究的熱點(diǎn)之一。本研究旨在探討S1P受體(S1PRs)對(duì)多發(fā)性骨髓瘤LP-1細(xì)胞系生存及凋亡的影響，并探討S1PRs對(duì)Pi3k/Akt/mTOR通路的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 LP-1細(xì)胞系(我院血液內(nèi)科凍存)，慢病毒S1P4R-shRNA及LV-NC(上海吉瑪公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(Thermo公司)，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(Thermo公司)，DMSO(Sigma公司)，CCK-8試劑盒(Dojindo公司)，RNA提取試劑盒(全式金公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金公司)，PCR試劑盒(全式金公司)，PCR引物(大連寶生公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、增殖率及凋亡率檢測 實(shí)驗(yàn)選用人多發(fā)性骨髓瘤LP-1細(xì)胞系，細(xì)胞復(fù)蘇后置入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃+5% CO2環(huán)境孵箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行CCK-8檢測，細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104/mL，每孔90 μL，實(shí)驗(yàn)組加入FTY720，調(diào)整終濃度為10.0 μmol/L，對(duì)照組加入等量含LP-1細(xì)胞的RPMI 1640培養(yǎng)基，空白組加入等量不含細(xì)胞的培養(yǎng)基。37 ℃+5% CO2環(huán)境孵箱中培養(yǎng)24 h后加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞的生存率，生存率(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD對(duì)照組) /(OD空白組-OD對(duì)照組)×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。另取實(shí)驗(yàn)組及空白組細(xì)胞，調(diào)整密度1×106/mL接種，孵箱培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，按照流式凋亡試劑盒處理細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.2 PCR檢測 PCR法檢測LP-1細(xì)胞系S1PRs表達(dá)水平差異。提取細(xì)胞總RNA并合成cDNA，實(shí)驗(yàn)步驟依據(jù)試劑盒要求進(jìn)行；然后以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，用S1PRs引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。

表1 引物序列

設(shè)定反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，63 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)后記錄循環(huán)閾值(Ct值)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取Ct平均值進(jìn)行分析。

1.2.3 S1P4受體敲除 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，實(shí)驗(yàn)組加入S1P4R-shRNA慢病毒 25 μL/孔+Polybrene 10 μL/孔，對(duì)照組加入等量陰性對(duì)照(LV-NC)及Polybrene，置于孵箱培養(yǎng)，熒光顯微鏡每24 h觀察一次細(xì)胞GFP表達(dá)情況，結(jié)合熒光蛋白表達(dá)粗估轉(zhuǎn)染效率。72 h后采用PCR法檢測細(xì)胞系S1P4受體是否敲除。

1.2.4 Western blot方法 收集轉(zhuǎn)染S1P4R-shRNA和LV-NC病毒及未經(jīng)處理過的 LP-1細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，按2.5×106/mL的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)移至離心管，1 500 r/min離心5 min，仔細(xì)吸凈上清。加入RIPA裂解液200 μL，充分裂解后，14 000 r/min離心5 min，取上清于-80 ℃凍存。BCA法測定蛋白濃度，計(jì)算蛋白上樣量并上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，BSA封閉2 h后，加入Survivin、Bag-1、Birc4、Akt、GAPDH單克隆抗體(1∶500)，4 ℃孵育過夜，TBST液洗膜3次，5 min/次，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，再次洗膜3次，5 min/次，ECL發(fā)光液顯影，用image-J 軟件分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 FTY720對(duì)LP-1細(xì)胞生存及凋亡的影響 CCK-8結(jié)果顯示，F(xiàn)TY720處理后，細(xì)胞生存率明顯降低(圖1A)，凋亡率明顯增高(圖1B)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 FTY720對(duì)LP-1細(xì)胞生存及凋亡的影響

2.2 LP-1細(xì)胞S1PRs表達(dá)情況 LP-1細(xì)胞系中S1P4受體相較于其他受體呈高表達(dá)。見圖2。

圖2 LP-1細(xì)胞S1PRs表達(dá)情況

2.3 S1P4受體敲除結(jié)果 熒光顯微鏡觀察顯示，無論S1P4R-shRNA還是LV-NC組，細(xì)胞內(nèi)均呈高熒光狀態(tài)，表明慢病毒質(zhì)粒均進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)(圖3A)。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，S1P4受體敲除達(dá)74%(圖3B)。

2.4 S1P4R敲除后抗凋亡蛋白表達(dá)情況 Western bolt 結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞及空質(zhì)粒相比，敲除S1P4受體后，細(xì)胞內(nèi)Akt、Survivin、Bag-1、Birc4表達(dá)明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖3 S1P4受體敲除情況

3 討論

S1P是一種鞘脂類化合物，已被證實(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長、代謝、血管生成、死亡等進(jìn)程具有重要調(diào)節(jié)作用。S1P的生物學(xué)功能是通過與其受體S1PRs相結(jié)合實(shí)現(xiàn)的[4]。S1PRs分為5種(S1PR1～5)，各受體亞型能偶聯(lián)不同G蛋白偶聯(lián)受體，調(diào)節(jié)下游信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)[5]。FTY720是S1P類似物，實(shí)際上起到S1PRs抑制劑的作用，能有效抑制各S1P受體亞型活性[6]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)FTY720處理后，LP-1細(xì)胞生存率明顯降低，凋亡率明顯提高，表明S1PRs受體對(duì)多發(fā)性骨髓瘤LP-1細(xì)胞生長生存及凋亡具有重要作用。

Pi3k/Akt/mTOR通路是影響細(xì)胞凋亡調(diào)控的經(jīng)典通路之一，其中Akt是通路中的重要蛋白，除通過下游mTOR調(diào)節(jié)Bcl-2等抗凋亡因子活性外，Akt還能通過激活下游NF-κB通路、磷酸化p53結(jié)合蛋白、抑制caspase 9的活性等，直接或間接調(diào)節(jié)Survivin、Birc4、Bag-1等凋亡相關(guān)因子，阻止凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)和進(jìn)行[7-8]。在LP-1細(xì)胞系中，S1P4受體呈高表達(dá)狀態(tài)，推測S1P4受體是調(diào)節(jié)LP-1細(xì)胞系生長生存的主要受體亞型。敲除S1P4受體后，Akt表達(dá)明顯降低，說明S1P4受體可通過Pi3k/Akt/mTOR通路調(diào)節(jié)下游信號(hào)。

圖4 S1P4受體敲除后抗凋亡蛋白表達(dá)情況

Survivin、Birc4、Bag-1均是活性較強(qiáng)的凋亡抑制因子，已被證實(shí)參與多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展等多個(gè)進(jìn)程[9-10]。其中Survivin和Birc4均能作用于caspase酶，Survivin能直接或通過caspase 9間接抑制caspase 3和caspase 7活性抑制細(xì)胞凋亡[ 11-12]，Birc4在抑制caspase 3和caspase 7活性之外，還能通過結(jié)合TNF-α受體相關(guān)因子TRAF1和TRAF2抑制細(xì)胞凋亡[13 ]。而Bag-1可與Hsp70/Hsc70、Raf-1及蛋白酶體等形成復(fù)合體，參與細(xì)胞周期調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)及蛋白修飾等，并通過Bcl-2等多種途徑抑制細(xì)胞凋亡[14]。本研究中，敲除S1P4受體后，Survivin、Birc4、Bag-1表達(dá)均明顯下降，推測S1P4受體可通過Akt途徑調(diào)節(jié)下游抗凋亡蛋白，從而抑制細(xì)胞凋亡。

S1P4受體對(duì)多發(fā)性骨髓瘤LP-1細(xì)胞系生存及凋亡具有重要調(diào)控意義，抑制S1P4受體可下調(diào)Akt、Survivin、Birc4、Bag-1等抗凋亡蛋白水平，促進(jìn)LP-1細(xì)胞凋亡，S1P4受體可能是多發(fā)性骨髓瘤治療的潛在靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)為前期實(shí)驗(yàn)，對(duì)于S1P4受體如何影響多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡的深入研究仍需進(jìn)一步進(jìn)行。

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Mechanism of S1P4 receptor in regulating apoptosis of myeloma cells via Akt

YANG Rong-hui,SHI Xiao-yan,FU Di,ZHONG Yuan,ZHENG Jin-ke, LIAO Ai-jun*

(Department of Hematology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To explore the effect of S1P receptor on the survival and apoptosis of LP-1 cell line of MM and its mechanism.Methods Fingolimod (FTY720) was used to inhibit S1P receptor of LP-1 cell line;CCK-8 assay was performed to evaluate cell viability and flow cytometry was performed to detect the apoptosis rate.The expression of S1P receptors was measured by qRT-PCR.S1P4R-shRNA was used to knock down S1P4 receptor,then the expression of S1P4 was measured by fluorescence microscope and qRT-PCR assay.The expression of antiapoptotic protein Akt,Bag-1,Birc4 and Survivin in S1P4 silented cell was detected by Western blot.Results The LP-1 cell survival rate decreased significantly after FTY720 treatment,and the apoptosis rate was also significantly increased (P<0.05).S1P4 receptor expression in LP-1 cell line was the highest,while the expression of anti-apoptotic protein Akt,Bag-1,Birc4 and Survivin decreased obviously after the S1P4 receptor was knocked down (P<0.05).Conclusion S1P receptors play an important role in the survival of LP-1 cells,while S1P4 receptor plays a major role in the apoptosis of LP-1 cells.S1P4 receptor can regulate the expression of antiapoptotic protein Bag-1,Birc4 and Survivin via Akt,and affect the apoptosis of LP-1 cells

S1P4;Multiple myeloma;Akt;Apoptosi;

2016-07-28

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液內(nèi)科,沈陽 110004

國家自然科學(xué)基金 (81272629)

10.14053/j.cnki.ppcr.201611002

*通信作者