低磷食物對模擬失重小鼠后肢骨骨質(zhì)丟失防治作用的探討

郭慧慧 張璐 申晉斌 馮娟 栗向東 張蓉

·實(shí)驗(yàn)研究論著·

低磷食物對模擬失重小鼠后肢骨骨質(zhì)丟失防治作用的探討

郭慧慧 張璐 申晉斌 馮娟 栗向東 張蓉

目的初步探討低磷食物對模擬失重下小鼠骨丟失防治的可能性及防治效果，為后期可能的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法利用尾部懸吊法模擬失重。將24只C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為四組，即對照（CON）組、對照低磷（CON?LP）組、懸尾（SUS）組及懸尾低磷（SUS?LP）組，每組6只。4周實(shí)驗(yàn)期滿后取小鼠后肢骨標(biāo)本，通過Micro?CT掃描分析比較各組小鼠股骨的骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume frac?tion,BV/TV）、骨小梁密度（trabecular density,Tb.Density）等骨密度參數(shù)，骨小梁厚度（trabecular thickness, Tb.Th）、平均骨小梁數(shù)（trabecular number,Tb.N）等骨形態(tài)學(xué)參數(shù)。通過抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate?resistant acid phosphatase,TRAP）染色、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和麗春紅三色（Ponceau S）染色對各組小鼠脛骨生長發(fā)育和改建情況進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果Micro?CT結(jié)果顯示，CON?LP組與CON組比較：骨密度參數(shù)BV/TV和Tb.Density減?。≒＜0.05），形態(tài)學(xué)參數(shù)Tb.Th增高和Tb.N減少（P＜0.05）。SUS?LP組與SUS組比較：骨密度參數(shù)BV/TV和Tb.Density減小（P＜0.05），形態(tài)學(xué)參數(shù)Tb.Th和Tb.N減少（P＜0.05）。染色結(jié)果顯示：懸尾的小鼠（SUS組、SUS?LP組）與地面的小鼠（CON組、CON?LP組）比較，骨小梁出現(xiàn)明顯的骨吸收，Tb.N減少、骨小梁間距變大。CON?LP組與CON組比較，Tb.Density減低、Tb.N減少。SUS?LP組與SUS組比較，骨小梁變細(xì)、Tb.N減少。結(jié)論低磷食物對模擬失重下小鼠后肢骨骨丟失防治效果不明顯，甚至可能產(chǎn)生不利的后果。

模擬失重；低磷食物；股骨；脛骨；骨質(zhì)丟失

在執(zhí)行太空任務(wù)中，航天員由于受到微重力、強(qiáng)輻射、超低溫、高真空、弱磁場、噪聲和晝夜節(jié)律變化等不良環(huán)境因素的影響，而引發(fā)其機(jī)體骨骼肌肉系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)等各個(gè)系統(tǒng)的改變［1?4］。在所發(fā)生的一系列改變中，大部分系統(tǒng)變化具有一定自限性，會達(dá)到新的平衡狀態(tài)不再繼續(xù)發(fā)展，但骨骼系統(tǒng)的變化由于沒有自限性，會出現(xiàn)持續(xù)性骨密度下降、骨質(zhì)丟失［5?7］，呈現(xiàn)進(jìn)行性的過程［8，9］。隨著航天工程的迅猛發(fā)展，航天員在太空環(huán)境停留時(shí)間將越來越長，骨礦鹽的持續(xù)丟失對機(jī)體的危害嚴(yán)重，也將成為妨礙人類長期太空停留和探索外星球的主要障礙之一。目前科學(xué)家和學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究工作，但仍未明確骨丟失的機(jī)制。運(yùn)動鍛煉、藥物預(yù)防和營養(yǎng)補(bǔ)充等各種防護(hù)措施均無法有效地防止失重環(huán)境下負(fù)重骨的骨丟失。較長時(shí)間（＞1個(gè)月）的太空飛行可使骨丟失可達(dá)15％，而返回地球1年后僅能恢復(fù)6％［10，11］。因此，預(yù)防失重下骨丟失的研究已成為相關(guān)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

懸尾鼠是用于研究模擬失重下身體機(jī)能改變、廢用性骨質(zhì)疏松癥病因及治療的成熟動物模型［12］。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)研究過程中發(fā)現(xiàn)懸吊4周后，小鼠的血磷水平升高明顯，同時(shí)在高磷食物飼養(yǎng)鼠的配對研究中發(fā)現(xiàn)：懸尾和高磷食物飼養(yǎng)均可減少脛骨骨形成、增加吸收。從而推測血磷的升高可能是導(dǎo)致失重后后肢骨丟失的重要原因。由此，我們提出假設(shè)：是否可以通過低磷飲食防治模擬失重小鼠后肢骨骨丟失？

本研究于2015年10月至2016年8月通過對模擬失重小鼠進(jìn)行低磷食物干預(yù)，觀察低磷飲食對小鼠骨組織形態(tài)學(xué)改變的影響，初步探討低磷食物對模擬失重下骨丟失防治的可能性及防治效果，為后期可能的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

戊巴比妥鈉（西安舟鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司），4％多聚甲醛（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司），乙二胺四乙酸鈉（MPBiomedicals公司，美國），高效切片石蠟（上海華靈康復(fù)器械廠），抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒、堿性磷酸酶染色試劑盒（南京建成科技有限公司），二甲苯、無水酒精、甲苯胺藍(lán)、蘇木素和伊紅（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），甲基綠（Sigma公司，美國），冰醋酸（重慶川東化工公司）中性樹脂（上海標(biāo)本模型廠），1％磷鎢酸（上海譜振生物科技有限公司），麗春紅染色試劑（上海里奇生物科技有限公司）。

DST641型實(shí)驗(yàn)動物稱量用電子秤（蘇州蘇杭科技器材有限公司），載玻片和蓋玻片（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司），TS?12U生物組織自動脫水機(jī)、BM?IX生物組織包埋機(jī)、冷凍臺和CS?Ⅵ型攤片烤片機(jī)（孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司），GZX?GFC電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)（上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），LEICA RM2235石蠟切片機(jī)（Leica公司，德國），BX?43型正置顯微鏡成像系統(tǒng)（Olympus公司，日本），Micro?CT（Siemens公司，德國）。

二、動物模型的建立和實(shí)驗(yàn)分組

選取第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供的C57BL/6清潔級雌性小鼠24只，體重平均為（17.0± 1.0）g。小鼠先在動物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，保證足量的清潔飲水和鼠糧。動物飼養(yǎng)房溫度為24℃，相對濕度為50％，光照/黑暗時(shí)間均為12 h。本實(shí)驗(yàn)研究通過了第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物管理倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號：2015倫審字061號）。

將24只雌性小鼠隨機(jī)分為四組，每組6只。飼養(yǎng)食物均由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心飼料科配制。對照（CON）組為地面狀態(tài)正常食物飼養(yǎng)，對照低磷（CON?LP）組為地面狀態(tài)低磷食物飼養(yǎng)，懸尾（SUS）組為懸尾狀態(tài)正常食物飼養(yǎng)，懸尾低磷（SUS?LP）組為懸尾狀態(tài)低磷食物飼養(yǎng)。正常食物含磷0.7％，含鈣0.9％；低磷食物含磷0.35％，含鈣0.9％。小鼠尾吊參照陳杰等［13］改進(jìn)的方法操作，小鼠始終保持30°頭低位及后肢伸直不能觸籠底，前肢可自由活動。

三、標(biāo)本的獲取及制備

4周實(shí)驗(yàn)期滿，各組小鼠稱重后腹腔注射1％戊巴比妥鈉注射液50mg/kg。麻醉藥起效后，分離右側(cè)后肢骨，置于4％多聚甲醛液固定24 h。股骨標(biāo)本進(jìn)行Micro?CT掃描測量；脛骨標(biāo)本用10％乙二胺四乙酸液脫鈣后石蠟包埋，切片機(jī)經(jīng)冠狀面切5μm厚連續(xù)切片，60℃烘干后，4℃保存，用抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate?resistantacid phosphatase,TRAP）染色、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和麗春紅三色（Ponceau S）染色。

四、Micro?CT掃描及重建分析

采用Inveon Micro?CT對小鼠股骨進(jìn)行掃描及三維重建。將股骨平行于水平面放入樣品管中進(jìn)行掃描。掃描參數(shù)：分辨率為10μm，電壓為80 kV，電流為450μA，掃描方式為360°旋轉(zhuǎn)，掃描時(shí)間為40min，平均幀數(shù)為1幀，角度增益為0.5°，曝光時(shí)間為400ms。感興趣區(qū)域（region of interest,ROI）為股骨遠(yuǎn)端生長板上0.5～1.5mm區(qū)域的骨小梁（圖1 a），對其進(jìn)行三維圖像重建。使用Micro?CT系統(tǒng)自帶的Inveon ResearchWorkplace 2.2軟件進(jìn)行骨小梁形態(tài)定量分析，獲得骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume fraction, BV/TV）、骨小梁密度（trabecular density,Tb.Density）等骨密度參數(shù)，骨小梁厚度（trabecular thickness,Tb. Th）、平均骨小梁數(shù)（trabecular number,Tb.N）等骨形態(tài)學(xué)參數(shù)。

五、組織形態(tài)學(xué)分析

（一）TRAP染色

采用TRAP染色試劑盒，操作方法參照說明書進(jìn)行。脛骨標(biāo)本石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟及梯度酒精水化。按說明書配制底物反應(yīng)液。切片用固定液固定標(biāo)本少許時(shí)間后清水漂洗，將混合后的底物反應(yīng)液滴加切片上，顯微鏡下觀察切片染色呈金黃色；蘇木精復(fù)染5min；甲基綠復(fù)染5min。最后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

（二）ALP染色

采用堿性磷酸酶染色試劑盒（鈣鈷法），操作方法參照說明書進(jìn)行。脛骨標(biāo)本石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟及梯度酒精水化，切片用固定液固定標(biāo)本，再在標(biāo)本上滴加基質(zhì)液。37℃避光孵育15min，甩掉多余染液，立即滴加顯色液A，染色5min，水洗30 s；再滴加顯色液B，染色5min，水洗30 s；滴加復(fù)染劑，復(fù)染30 s，甩干。最后酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

（三）Ponceau S染色

脛骨標(biāo)本石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟及梯度酒精水化后，1％磷鎢酸浸泡10min，去離子水沖洗后浸入甲苯胺藍(lán)10min，70％酒精分化1min，苦味酸-桔黃G混合液30 s，2％麗春紅2R-麗春紅結(jié)晶混合3min，以上每一操作之后都需用去離子水沖洗，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0（SPSS公司，美國）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所得計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩獨(dú)立樣本組間比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析（One?way ANOVA），方差齊性計(jì)量資料采用LSD多重檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、股骨標(biāo)本Micro?CT結(jié)果

Micro?CT三維重建可見：正常小鼠（CON組）的股骨遠(yuǎn)端ROI處骨小梁結(jié)構(gòu)完整，厚度分布均勻（圖1 a）。懸尾的小鼠（SUS組、SUS?LP組）與地面的小鼠（CON組、CON?LP組）比較，Tb.N明顯減少，骨小梁間距增大，骨小梁變細(xì)、厚薄不均，其立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)受到破壞，連續(xù)性中斷（圖1 b～d）。

進(jìn)一步對骨小梁的掃描結(jié)果進(jìn)行定量分析后發(fā)現(xiàn)，CON?LP組與CON組比較，骨密度參數(shù)BV/TV減小（P=0.006）、Tb.Density減?。≒=0.001）；形態(tài)學(xué)參數(shù)Tb.Th增高（P=0.122）、Tb.N減少（P=0.000）。SUS?LP組與SUS組比較，骨小梁結(jié)構(gòu)散亂，骨密度參數(shù)BV/TV減?。≒=0.000）、Tb.Density減小（P=0.002）；形態(tài)學(xué)參數(shù)Tb.Th（P=0.024）、Tb.N減少（P=0.002）（表1）。

表1　四組小鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁感興趣區(qū)域Micro?CT參數(shù)統(tǒng)計(jì)表（±s，n=6）

表1　四組小鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁感興趣區(qū)域Micro?CT參數(shù)統(tǒng)計(jì)表（±s，n=6）

注：與CON組比較，*P＜0.05；與SUS組比較，#P＜0.05

組別CON組CON?LP組SUS組SUS?LP組BT/TV（％）4.88±0.86 4.73±0.82*1.54±0.75 1.27±0.05#Tb.Th（μm）0.025±0.008 0.028±0.006 0.022±0.001 0.020±0.004#Tb.N（mm-1）1.89±0.22 1.65±0.49*0.85±0.30 0.59±0.21#Tb.Density 1 433.82±13.32 1 393.56±18.69*1 254.90±11.01#1 241.52±17.16

二、脛骨切片染色形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

小鼠脛骨干骺端的骺生長板自上而下為貯備區(qū)（Ⅰ區(qū)）、增生區(qū)（Ⅱ區(qū)）、肥大區(qū)（Ⅲ區(qū)）、鈣化區(qū)（Ⅳ區(qū)）和成骨區(qū)（Ⅴ區(qū)）（圖2）。

（一）TRAP染色情況

軟骨細(xì)胞出現(xiàn)死亡消失，留下空洞狀的軟骨陷窩，陷窩內(nèi)可見TRAP染色陽性的破骨細(xì)胞，表現(xiàn)為深紅色，細(xì)胞形態(tài)較大（圖2 a）。

（二）ALP染色情況

活躍的ALP染色陽性的成骨細(xì)胞，表現(xiàn)為褐色，細(xì)胞形態(tài)呈小圓形（圖2 b）。

（三）Ponceau S染色情況

在鈣化的骨小梁表面沉淀骨基質(zhì)，形成由骨和鈣化的軟骨組成的混合性的骨小梁（圖2 c）。

圖1　小鼠股骨Micro?CT掃描圖及感興趣區(qū)域骨小梁三維結(jié)構(gòu)重建圖（bar=1 mm）CON組（a）股骨遠(yuǎn)端ROI骨小梁結(jié)構(gòu)完整，厚度分布均勻；SUS組（c）、SUS?LP組（d）與CON組（a）、CON?LP組（b）比較，Tb.N明顯減少，骨小梁間距增大，骨小梁變細(xì)、厚薄不均，其立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)受到破壞，連續(xù)性中斷

圖2　小鼠脛骨干骺端的骺生長板染色后顯微鏡下組織形態(tài)學(xué)觀察（×400，bar=100μm）a～c：Ⅰ區(qū)為貯備區(qū)，Ⅱ區(qū)為增生區(qū)，Ⅲ區(qū)為肥大區(qū)，Ⅳ區(qū)為鈣化區(qū)，Ⅴ區(qū)為成骨區(qū)；懸尾組（SUS組、SUS?LP組）和地面組（CON組、CON?LP組）比較，可見骨小梁出現(xiàn)明顯的骨吸收，Tb.N減少，骨小梁間距變大；CON?LP組與CON組比較，Tb.Density減低、骨小梁變粗、Tb.N減少。SUS?LP組與SUS組比較，Tb.Density升高、骨小梁變細(xì)、Tb.N減少，在破骨細(xì)胞鄰近的骨小梁可見明顯的骨質(zhì)缺損

四組小鼠脛骨組織切片（成骨區(qū)）在光學(xué)顯微鏡下觀察差別明顯。染色結(jié)果顯示，懸尾組（SUS組、SUS?LP組）與地面組（CON組、CON?LP組）比較，骨小梁出現(xiàn)明顯的骨吸收，Tb.N減少，骨小梁間距變大。CON?LP組與CON組比較，Tb.Density減低、骨小梁變粗、Tb.N減少。SUS?LP組與SUS組比較，Tb. Density降低、骨小梁變細(xì)、Tb.N減少，在破骨細(xì)胞鄰近的骨小梁有明顯的骨質(zhì)缺損，表現(xiàn)為骨質(zhì)被吸收。

討論

一、松質(zhì)骨在失重性骨丟失研究中的意義

骨組織是一種適應(yīng)性結(jié)構(gòu)，其主要功能是滿足機(jī)體的生物力學(xué)需求和礦鹽代謝需要［14］，骨的負(fù)荷增加骨量與骨強(qiáng)度，失負(fù)荷則減少骨量與骨強(qiáng)度。骨強(qiáng)度和穩(wěn)定性除受骨量影響外，還受骨結(jié)構(gòu)因素影響，如骨小梁的形態(tài)、數(shù)量及骨小梁間的連接等。對于松質(zhì)骨來說骨小梁的強(qiáng)度、穩(wěn)定性與其微構(gòu)筑的方式有關(guān)，骨小梁的立體網(wǎng)狀空間結(jié)構(gòu)有利于吸收震蕩而不易骨折［15］。Cervinka等［16］研究發(fā)現(xiàn)，失重狀態(tài)下骨質(zhì)的丟失以松質(zhì)骨為主。故本實(shí)驗(yàn)以小鼠后肢骨松質(zhì)骨為主要研究對象，探討低磷食物對預(yù)防模擬失重下骨質(zhì)丟失的防治效果。

骨密度是診斷骨質(zhì)疏松的重要參數(shù)，可反映約70％的骨強(qiáng)度情況，且其測量方法統(tǒng)一、結(jié)果準(zhǔn)確可靠［17］。本研究中骨密度參數(shù)包括BV/TV和Tb.Den?sity CT值，松質(zhì)骨密度變化范圍為0.1～1.0 g/cm3，數(shù)據(jù)跨度是1個(gè)數(shù)量級，所以即使骨密度只發(fā)生微小的變化，也將會對松質(zhì)骨力學(xué)性能產(chǎn)生巨大影響。由于松質(zhì)骨的密度和BV/TV主要反映骨密度的變化，而骨形態(tài)學(xué)參數(shù)可以提供有關(guān)骨實(shí)際結(jié)構(gòu)的信息，有助于提高骨強(qiáng)度預(yù)測的準(zhǔn)確性，Micro?CT是一種分辨率高達(dá)微米級的三維定量分析儀，能夠從骨小梁結(jié)構(gòu)水平上評價(jià)骨的結(jié)構(gòu)和功能［18，19］。本研究中形態(tài)學(xué)參數(shù)包括Tb.Th和Tb.N，Micro?CT結(jié)果顯示懸尾小鼠（SUS組、SUS?LP組）與地面小鼠（CON組、CON?LP組）比較，股骨遠(yuǎn)端和脛骨干骺端Tb.N明顯減少、間距變大，表明模擬失重下后肢骨松質(zhì)骨丟失明顯。與孫平等［20］報(bào)道一致，證實(shí)尾部懸吊法導(dǎo)致了小鼠后肢骨骨丟失，建模成功。

二、控制血磷水平在改善骨丟失中的可行性

磷作為人體第二大豐富的礦物質(zhì)，對于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和多種細(xì)胞生理活動非常重要［21］。機(jī)體內(nèi)85％的磷以羥基磷灰石結(jié)晶的形式存在于骨組織［22］。磷在骨礦物質(zhì)中的作用之一是維持機(jī)械強(qiáng)度，另外以無機(jī)磷的形式存在于骨中維持細(xì)胞內(nèi)磷的穩(wěn)定保證生命過程的完成。近年來，磷感受器通過感受血液和細(xì)胞周圍磷離子濃度的變化并傳遞給效應(yīng)細(xì)胞，由此產(chǎn)生的一系列生物學(xué)效應(yīng)研究引起了學(xué)者們對磷的代謝及生物學(xué)功能越來越廣泛的重視和關(guān)注［23，24］。體外研究已證實(shí)，高磷/低磷對軟骨細(xì)胞［25］、成骨細(xì)胞［26］、破骨細(xì)胞［27，28］活性都有影響，從而影響骨礦化及骨重建。

失重環(huán)境下，骨骼細(xì)胞感受力學(xué)刺激，轉(zhuǎn)化為生物學(xué)反應(yīng)，骨吸收活性增加同時(shí)骨基質(zhì)礦化減少，骨基質(zhì)溶解釋放鈣磷入血，同時(shí)骨細(xì)胞周圍磷濃度增高，處于高磷環(huán)境。體內(nèi)鈣磷代謝的平衡及其在細(xì)胞內(nèi)外液中濃度的穩(wěn)定對維持正常骨代謝有重要作用［29］。Calvo等［30］已有研究證實(shí)，高血磷可引起骨的吸收增加、減少骨基質(zhì)礦化。在失重環(huán)境下航天員骨丟失沒有自限性的原因之一可能是產(chǎn)生了“失重→骨丟失→磷釋放入血→高血磷→骨損害”的惡性循環(huán)。故通過控制血磷水平，從而改善骨丟失情況為一個(gè)理論上可行的方法。

三、本研究低磷干預(yù)結(jié)果分析與存在的不足

本實(shí)驗(yàn)中，通過分析骨小梁微觀結(jié)構(gòu)和應(yīng)力分布的關(guān)系，探索低磷食物干預(yù)是否能改善模擬失重懸尾鼠后肢骨骨丟失情況。股骨Micro?CT結(jié)果顯示，低磷食物干預(yù)后骨小梁結(jié)構(gòu)散亂，Tb.N較少，間隙增大；骨密度參數(shù)BV/TV和Tb.Density均減?。ň鵓＜0.05），形態(tài)學(xué)參數(shù)Tb.N降低（P＜0.05），提示低磷干預(yù)后小鼠松質(zhì)骨骨形成與骨吸收的最終結(jié)果是不利的。Micro?CT有其不可代替的優(yōu)勢，但仍不能完全代替組織形態(tài)學(xué)與生物代謝指標(biāo)檢測［31］。為進(jìn)一步驗(yàn)證Micro?CT的結(jié)果，對脛骨標(biāo)本進(jìn)行TRAP、ALP、Ponceau S染色，得到了相似的結(jié)果。ALP、TRAP染色分別從成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞水平間接反映骨形成與骨吸收，較好地體現(xiàn)了骨重建與骨轉(zhuǎn)換。染色結(jié)果顯示，低磷食物飼養(yǎng)后小鼠脛骨破骨細(xì)胞增多，成骨細(xì)胞減少，骨小梁變細(xì)，Tb.N減少，Tb.Density減低，呈現(xiàn)骨量減少的趨勢，提示低磷干預(yù)后骨改建結(jié)果為新骨形成減少，舊骨吸收增加。Micro?CT結(jié)果和染色結(jié)果表明給予低磷食物干預(yù)后，小鼠后肢骨骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，骨吸收大于骨形成，提示低磷食物飼養(yǎng)的小鼠后肢骨骨丟失情況更為嚴(yán)重，不僅沒有起到治療模擬失重下小鼠后肢骨骨丟失的作用，甚至可能產(chǎn)生不利的后果。

低磷飲食作為一種治療方法在臨床上已有應(yīng)用，一般推薦為慢性腎臟疾病（CKD）Ⅱ期的透析患者開始限磷飲食治療，然而限磷飲食伴隨著蛋白質(zhì)攝入量的減少，可能導(dǎo)致營養(yǎng)不良［32］。目前臨床指南多推薦慢性腎衰竭患者建議低磷飲食，一般限制在500～600mg/d，并輔以α-酮酸治療。但觀察時(shí)間均較短，長期低磷飲食對骨組織形態(tài)學(xué)的影響在國內(nèi)外研究均鮮見報(bào)道。分析本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果原因可能為低磷喂食時(shí)間長（28 d），且沒有輔助治療導(dǎo)致蛋白攝入不足而引起營養(yǎng)不良所致。

本研究為初步探討性研究，實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量較少，其結(jié)論還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。在下一步研究設(shè)計(jì)中應(yīng)參照CKD患者限磷食譜，既精確把握低磷食物中磷的含量又同時(shí)保證鼠糧中蛋白質(zhì)含量，從而減少可能出現(xiàn)的骨強(qiáng)度下降等副作用，為后期可能的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Preventive and therapeutic effect to hind limb bone loss of m ice under conditions of simu lated weightlessness w ith low phosphate diet:a pilot study.

GUO Huihui*,ZHANG Lu,SHEN Jinbin,FENG Juan,LIXiangdong,ZHANGRong.*State Key Laboratory ofMilitary Stomatology＆amp;National Clinical Research CenterforOral Diseases＆amp;Shaanxi Key Laboratory ofStomatology,Department ofOperative Density and Endo?dotics,SchoolofStomatology,the Fourth MilitaryMedicalUniversity,Xi'an 710032,China
Corresponding author:ZHANGRong,E?mail：zhangrong@fmmu.edu.cn

Objective To investigatewhether low phosphate(Pi)diethas a preventive and therapeutic effecton bone loss ofmice hindlimb under simulated weightlessness.M ethods Twenty female C57BL/6mice were divided into 4 groups randomly:the control group(CON),the controlmicewith low Pidiet(CON?LP),the tail suspension group(SUS),and the tail suspension group with low Pidiet(SUS?LP).After 4?week experiments, allmicewere sacrificed and the righthindlimbswere removed as the specimens.The bone volume fraction(BV/ TV),trabecular bone thickness(Tb.Th),trabecular bone number(Tb.N)and average density CT value(Tb. Density)in 4 groups were compared by micro?CT scanning,reconstruction and analysis.Meanwhile,TRAP, ALP and Ponceau S stains were used for the proximal tibia slices to observe the histomorphologic changes. Results Micro?CT showed that Tb.Th in CON?LP group was higher than that in CON group(P＜0.05).As compared with the SUS group,BV/TV,Tb.Density,Tb.Th and Tb.N in SUS?LP group were significantly decreased(P＜0.05).TRAP,ALP and Ponceau S staining showed a significant difference among the 4 groups. As compared with the CON/CON?LP group,the trabecular bone losswas significant in the SUS/SUS?LP group. And thenumberof trabecularbonewas lessand the trabecularbone separation distancewas larger than in CON/CON?LP group.As compared with the CON group,the trabecular bone density and the number of trabecular bone were reduced in the CON?LP group.As compared with the SUS group,the trabecular bone width was thinner and the trabecular bone numberwas less in the SUS?LP group.Conclusion The results indicate that the preventive and therapeutic effect to hind limb bone loss ofmice under conditions of simulated weightless?nesswith low phosphate dietwasnot feasible,and itmighteven be harm ful to do so.

Simulated weightlessness;Low?Pidiet;Femur;Tibia;Bone loss

10.3969/j.issn.1674?8573.2016.06.012

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31170898）；回國人員啟動基金（HG3101）

710032西安，軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科（郭慧慧、申晉斌、馮娟、張蓉）；陜西省西安市臨潼療養(yǎng)院第二療養(yǎng)區(qū)口腔科（張璐）；第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科（栗向東）

張蓉，E?mail：zhangrong@fmmu.edu.cn

郭慧慧和張璐對本文有同等貢獻(xiàn)，并列第一作者

（2016?06?06）